Name: Estratégias para Estudo da neuroproteção de frio pré-condicionamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 27 s
Description: Aprenda a usar culturas de fatias hipocampais de ratos para estudar neuroproteção por pré-condicionamento a frio. Este método revela mecanismos de sinalização imune neural envolvendo citocinas pró-inflamatórias.

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Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NS-19108), a Fundação de Pesquisa de enxaqueca, ea Fundação Branca Richard P. Kraig. Ms. Marcia P. Kraig assistida na preparação de meios de cultura e manutenção de culturas fatia. Agradecemos a Yelena Grinberg por seus comentários e revisões sobre a versão final deste artigo.

<ol><li>Aptowicz, C. O., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+plasticity+in+hippocampal+slice+cultures+involves+changes+in+voltage-gated+Na%2B+channel+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Homeostatic plasticity in hippocampal slice cultures involves changes in voltage-gated Na+ channel expression.</a> Brain Res. 998, 155-163 (2004).</li>
<li>Beattie, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+synaptic+strength+by+glial+TNFalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of synaptic strength by glial TNFalpha.</a> Science. 295, 2282-2285 (2002).</li>
<li>Breder, C. D., Dewitt, D., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+inducible+cyclooxygenase+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Characterization of inducible cyclooxygenase in rat brain.</a> J Comp Neurol. 355, 296-315 (1995).</li>
<li>Caggiano, A. O., Breder, C. D., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+elevation+of+cyclooxygenase-2%2C+but+not+lipoxygenase%2C+in+regions+synaptically+distant+from+spreading+depression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Long-term elevation of cyclooxygenase-2, but not lipoxygenase, in regions synaptically distant from spreading depression.</a> J Comp Neurol. 376, 447-462 (1996).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eicosanoids+and+nitric+oxide+influence+induction+of+reactive+gliosis+from+spreading+depression+in+microglia+but+not+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes.</a> J Comp Neurol. 369, 93-108 (1996).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+and+4-aminopyridine+prevent+the+lipopolysaccharide-induced+outwardly+rectifying+potassium+current+and+interleukin-1beta+production+in+cultured+rat+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 and 4-aminopyridine prevent the lipopolysaccharide-induced outwardly rectifying potassium current and interleukin-1beta production in cultured rat microglia.</a> J Neurochem. 70, 2357-2368 (1998).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E+receptor+subtypes+in+cultured+rat+microglia+and+their+role+in+reducing+lipopolysaccharide-induced+interleukin-1beta+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E receptor subtypes in cultured rat microglia and their role in reducing lipopolysaccharide-induced interleukin-1beta production.</a> J Neurochem. 72, 565-575 (1999).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+therapies+for+stroke+and+traumatic+brain+injury+often+display+U-shaped+dose+responses%3A+occurrence%2C+mechanisms%2C+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Drug therapies for stroke and traumatic brain injury often display U-shaped dose responses: occurrence, mechanisms, and clinical implications.</a> Crit Rev Toxicol. 38, 557-577 (2008).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+stress+response+terminology%3A+Integrating+the+concepts+of+adaptive+response+and+preconditioning+stress+within+a+hormetic+dose-response+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Biological stress response terminology: Integrating the concepts of adaptive response and preconditioning stress within a hormetic dose-response framework.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 222, 122-128 (2007).</li>
<li>Calabrese, E. J., Baldwin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormesis%3A+the+dose-response+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hormesis: the dose-response revolution.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 175-197 (2003).</li>
<li>Hansel, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CD4%2B+T-cell+gene+expression+in+allergic+subjects+using+two+different+microarray+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Analysis of CD4+ T-cell gene expression in allergic subjects using two different microarray platforms.</a> Allergy. 63, 366-369 (2008).</li>
<li>Hulse, R. E., Kunkler, P. E., Fedynyshyn, J. P., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+multiplexed+bead-based+cytokine+immunoassays+for+rat+serum+and+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of multiplexed bead-based cytokine immunoassays for rat serum and brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 136, 87-98 (2004).</li>
<li>Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+IgG+is+neuroprotective+via+enhancing+microglial+recycling+endocytosis+and+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-alpha.</a> J Neurosci. 28, 12199-12211 (2008).</li>
<li>Hulse, R. E., Winterfield, J., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+clasmatodendrosis+in+hippocampal+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocytic clasmatodendrosis in hippocampal organ culture.</a> Glia. 33, 169-179 (2001).</li>
<li>Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+and+Microglial+Hormetic+Involvement+in+Neurological+Health+and+Migraine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Dose-Respose+Society%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha and Microglial Hormetic Involvement in Neurological Health and Migraine.</a> International Dose-Respose Society. , (2010).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+cytokine+protein+expression+profiles+from+spreading+depression+in+hippocampal+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Multiplexed cytokine protein expression profiles from spreading depression in hippocampal organotypic cultures.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 24, 829-839 (2004).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+current+source+density+analysis+in+hippocampal+organotypic+culture+shows+that+spreading+depression+occurs+with+uniquely+reversing+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents.</a> J Neurosci. 25, 3952-3961 (2005).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytosis+from+excitotoxic+injury+in+hippocampal+organ+culture+parallels+that+seen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 17, 26-43 (1997).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+precede+electrophysiological+changes+of+spreading+depression+in+hippocampal+organ+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures.</a> J Neurosci. 18, 3416-3425 (1998).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P%2FQ+Ca2%2B+channel+blockade+stops+spreading+depression+and+related+pyramidal+neuronal+Ca2%2B+rise+in+hippocampal+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">P/Q Ca2+ channel blockade stops spreading depression and related pyramidal neuronal Ca2+ rise in hippocampal organ culture.</a> Hippocampus. 14, 356-367 (2004).</li>
<li>Lambertsen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+protect+neurons+against+ischemia+by+synthesis+of+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia protect neurons against ischemia by synthesis of tumor necrosis factor.</a> J Neurosci. 29, 1319-1330 (2009).</li>
<li>Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+of+G-protein+signaling+10+promotes+dopaminergic+neuron+survival+via+regulation+of+the+microglial+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response.</a> J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).</li>
<li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormesis+and+disease+resistance%3A+activation+of+cellular+stress+response+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Exp+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hormesis and disease resistance: activation of cellular stress response pathways.</a> Hum Exp Toxicol. 27, 155-162 (2008).</li>
<li>Ning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+simultaneous+gene+profiling+of+84+drug-metabolizing+genes+in+primary+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Systematic and simultaneous gene profiling of 84 drug-metabolizing genes in primary human hepatocytes.</a> J Biomol Screen. 13, 194-201 (2008).</li>
<li>Oppenheim, J., Feldman, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOppenheim%2C+J+%22in+Cytokine+Reference%22">in Cytokine Reference</a>. Oppenheim, J. J., Feldman, M. 1, Academic. New York. (2001).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, e45-e45 (2001).</li>
<li>Stellwagen, D., Beattie, E. C., Seo, J. Y., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+AMPA+receptor+and+GABA+receptor+trafficking+by+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of AMPA receptor and GABA receptor trafficking by tumor necrosis factor-alpha.</a> J Neurosci. 25, 3219-3228 (2005).</li>
<li>Stellwagen, D., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+scaling+mediated+by+glial+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic scaling mediated by glial TNF-alpha.</a> Nature. 440, 1054-1059 (2006).</li>
<li>Streit, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+as+neuroprotective%2C+immunocompetent+cells+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS.</a> Glia. 40, 133-139 (2002).</li>
<li>Wilde, G. J., Pringle, A. K., Sundstrom, L. E., Mann, D. A., Iannotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+and+augmentation+of+ischaemia-related+neuronal+death+by+tumour+necrosis+factor-alpha+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Attenuation and augmentation of ischaemia-related neuronal death by tumour necrosis factor-alpha in vitro.</a> Eur J Neurosci. 12, 3863-3870 (2000).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Dois conceitos de fundamental importância importante para o delineamento do sistema de sinalização de citocinas envolvidas no frio pré-condicionamento neuroproteção são ilustrados nas Figuras 6 e 7. Primeiro, as citocinas são concentração extremamente baixa moléculas de sinalização no cérebro normal. No entanto, as mudanças fisiológicas concentração de citocinas têm um imenso potencial para alterar a estrutura e função cerebral (ie, fenótipo) por causa de sua capacidade de alterar a expressão gênica (Figura 6). Além disso, as citocinas são altamente redundante e pleiotrópicos em que múltiplas citocinas podem ter efeitos semelhantes e uma citocina pode ter efeitos única variável (Figura 7). Assim, estabelecer com precisão a inata citocinas bases para a neuroproteção de frio pré-condicionamento (ou outros estímulos fisiológicos pré-condicionamento), análise de composição de variáveis ​​relacionadas com a sinalização deve ser determinada. Isto é conseguido através de estratégias de ensaio multiplex. Isto irá estabelecer a citocina "assinatura" de frio pré-condicionamento neuroproteção. <img src="/files/ftp_upload/2192/2192fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Poder de sinalização de citocinas no cérebro. As ilustrações transmitir o imenso poder de sinalização de concentrações fisiológicas de citocinas cerebrais em comparação com as concentrações de outros bem conhecidos homólogos. Concentração é representada como o inverso da distância, começando com um bigode de gato único como ponto de referência. De sódio (10 -1 M ilustrado por um grão de pimenta) e potássio (10 -3 M ilustrado por um tomate) estão presentes no espaço intersticial do cérebro em níveis de cerca de 150 mM e 3, respectivamente, e têm bem reconhecida em papéis função das células neurais eletrofisiológico. Da mesma forma, pH (ou seja, ~ 10 -7 M níveis de íons de hidrogênio e ilustrado como 780 metros ao longo das proximidades do lago de Chicago) e cálcio (ie, ~ 10 -8 níveis M mostrado como 7,8 km visto de uma imagem de satélite do Google ao longo do lago de Chicago McCormick lugar para Promontory Point no Hyde Park, perto da Universidade de Chicago). Além disso, os neurotransmissores liberados no espaço intersticial sobre estas concentrações afetar a atividade cerebral região local. Em contraste, as citocinas (mostrado como a distância da Terra a Marte) podem alterar a função cerebral em concentrações mais de dez milhões de vezes menos. <img src="/files/ftp_upload/2192/2192fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Sinalização de vias interativas citocina inata. Citocinas são altamente redundantes e pleiotrópicos em que múltiplas citocinas podem ter efeitos semelhantes e uma citocina único pode ter vários efeitos. Essa diversidade decorre de sinalização interativo complexo que ocorre no nível de ligantes, receptores e fosfoproteínas. Maior complexidade decorre do fato de que o cérebro é composto por diferentes tipos de células, com cada um capaz de células específicas de citocinas inata, receptor, e as mudanças fosfoproteína relacionados. Para fins ilustrativos aqui, só citocina inata vias de sinalização (derivado de estudos com células imune) são mostrados. Para simplificar, o cérebro é desenhada como uma única célula (linha branca), mostrando as interações potencial de citocinas inata (IL-1α e IL-1β (referido aqui como IL-1α / β), TNF-α, IL-6, IFN-γ e IL-10), receptores (IL-1R1, TNFR1, IL-6/gp130, IFNγR, e IL-10R), e fosfoproteínas (ie, quinases ERK1 / 2, P38 (P38-MAPK) e JNK) e fatores de transcrição (ATF-2, NFκB e STAT3). Por exemplo, TNF-α sinais via TNFR1 de JNK, p38-MAPK e ERK1 / 2, o que desencadeia a expressão do gene através de ATF-2. TNF-α também altera a expressão do gene diretamente através da ativação NFκB. Juntos, ativação desses fatores de transcrição evocar aumentada (seta) e diminuição (fim blunt) expressão de citocinas e seus receptores, como indicado. Importante, essas vias mostram que as mudanças em uma citocina (por exemplo, TNF-α) de produção influência de outros (por exemplo, IL-1β) citocinas. Assim, para estabelecer com precisão a citocina-bases para a neuroproteção de frio pré-condicionamento, análise composta de variáveis ​​relacionadas com a sinalização deve ser determinada. Isso irá estabelecer o inato citocina "assinatura" de frio pré-condicionamento. (A imagem foi compilado a partir de dados de referência # 25.)

Preparação das Culturas Slice <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Catálogo / Número modelo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Millicell-CM tecido insere a cultura (30 mm) </td><td> Thermo Fisher </td><td> PICM0-3050 </td><td></td></tr><tr><td> Basal Medium Águia </td><td> Invitrogen </td><td> 21010 </td><td></td></tr><tr><td> Solução salina balanceada de Earle s </td><td> Sigma </td><td> E2888 </td><td></td></tr><tr><td> Soro de cavalo </td><td> Invitrogen </td><td> 26050-088 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 35050 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15295 </td><td></td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G8769 </td><td></td></tr><tr><td> BSL-1 coifa </td><td> Padeiro </td><td></td><td></td></tr><tr><td> McIlwain helicóptero tecido </td><td> Brinkmann </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Discos de teflon </td><td> Brinkmann </td><td> 023-49-310-1 </td><td></td></tr><tr><td> Espátula </td><td> Thermo Fisher </td><td> 14-373-25A </td><td></td></tr><tr><td> Curvo íris tesoura </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 14091-09 </td><td></td></tr><tr><td> Tesoura reta longa </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 14002-14 </td><td></td></tr><tr><td> Forceps longo </td><td> Thermo Fisher </td><td> 13-812-40 </td><td></td></tr><tr><td> Pinças anguladas </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11808-02 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps curta </td><td> Thermo Fisher </td><td> 13-812-38 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Inox forceps </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Iris 2 espátulas </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 10094-13 </td><td></td></tr><tr><td> 150 x 15 mm placas de Petri </td><td> Thermo Fisher </td><td> 08-757-148 </td><td></td></tr><tr><td> 60 x 15 mm placas de Petri </td><td> Thermo Fisher </td><td> 08-757-100B </td><td></td></tr><tr><td> Estereomicroscópio M8 selvagens </td><td> Selvagens Heerbrugg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solução Gey s sal equilíbrio </td><td> Sigma </td><td> G9779 </td><td></td></tr><tr><td> Blak-Ray ondas curtas metros medição Ultraviolet </td><td> UVP </td><td> J-225 </td><td></td></tr><tr><td> 6-cultura bem pratos Falcon </td><td> Thermo Fisher </td><td> 08-772-1B </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 21103</td><td></td></tr><tr><td> B27 suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17504 </td><td></td></tr><tr><td> Gem21 Neuroplex </td><td> Bioproducts gemini </td><td> 400-160-010 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido ascórbico </td><td> Sigma </td><td> A4544 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 Analyzer </td><td> Bacharach </td><td> # 2820 </td><td></td></tr></tbody></table> Pré-seleção para a vitalidade das culturas Slice <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Catálogo / Número modelo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Sytox Verde </td><td> Invitrogen </td><td> S7020 </td><td></td></tr><tr><td> DMIBRE microscópio invertido </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Frio Precondicionamento <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Catálogo / Número modelo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> BSL-2 coifa </td><td> NuAire </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Lesão excitotóxico <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Catálogo / Número modelo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> CoolSnap fx câmera CCD </td><td> Fotométricos </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluoroscein </td><td> Invitrogen </td><td> F36915 </td><td></td></tr><tr><td> Metamorph software </td><td> Os dispositivos moleculares </td><td> v. 7.5.04 </td><td></td></tr><tr><td> 100 mM hemacitómetro profunda </td><td> Hausser Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> N-metil-D-aspartato </td><td> Calbiochem </td><td> 454575 </td><td></td></tr><tr><td> SigmaStat software </td><td> Systat Software Inc. </td><td> v. 3.5 </td><td></td></tr></tbody></table> Co-tratamentos aplicados com frio Precondicionamento <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Catálogo / Número modelo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> sTNFR1 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 425-R1-050 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> Sigma </td><td> A-4503 </td><td></td></tr></tbody></table> RNA Isolation <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Catálogo / Número modelo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Ater RNAl </td><td> Ambion </td><td> AM7021 </td><td></td></tr><tr><td> Micro RNEasy Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74004 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Pescador </td><td> 03446-100 </td><td></td></tr><tr><td> Diposable 1,5 RNAse-free Pestle </td><td> Ferramenta de precisão do Sul Jersey e Mold, Inc. </td><td> 749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> RNasin </td><td> Promega </td><td> N261A </td><td></td></tr><tr><td> Tris [hidroximetil] aminometano </td><td> Sigma </td><td> T3069 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (ácido etilenodiaminotetracético sal dissódico hidratado </td><td> Sigma </td><td> # E7889 </td><td></td></tr></tbody></table> Quantificação de RNA <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Catálogo / Número modelo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> RiboGreen Assay </td><td> Invitrogen </td><td> R11491 </td><td></td></tr><tr><td> Levedura tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 mL tubos de centrífuga </td><td> EUA Scientific </td><td> 16155500 </td><td></td></tr><tr><td> De 96 poços da placa do teste de fluorescência </td><td> Nunc </td><td> DK-4000 </td><td></td></tr><tr><td> De 96 poços leitor de placas fluorescentes </td><td> Tecan </td><td> Safire II </td><td></td></tr></tbody></table> PCR quantitativo <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Catálogo / Número modelo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> iScript kit de transcrição reversa </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8891 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green </td><td> Invitrogen </td><td> S7563 </td><td></td></tr><tr><td> Polimerase Taq Platinum </td><td> Invitrogen </td><td> RNA Ultrasense 11732-927 </td><td></td></tr><tr><td> iCycler termociclador </td><td> Bio-Rad </td><td> iCycler Módulo Óptico </td><td></td></tr><tr><td> iCycler software do sistema </td><td> Bio-Rad </td><td> v. 3.1 </td><td></td></tr></tbody></table> PCR quantitativo para Microarrays <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Catálogo / Número modelo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> RNase Fora </td><td> Bioprodutos Molecular </td><td> # 7000 </td><td></td></tr><tr><td> RT 2 Kit First Strand </td><td> SABiosciences </td><td> C-03 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green PCR baseado mix </td><td> SABiosciences </td><td> PA-011 </td><td> Específicas para iCycler </td></tr><tr><td> RT 2 Profiler Matriz PCR </td><td> SABiosciences </td><td> Parn-011A </td><td></td></tr></tbody></table> Ensaio proteômica <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Equipamentos </td><td> Companhia </td><td> CatálogoNúmero / Modelo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Kit lise celular </td><td> Bio-Rad </td><td> 171-304011 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrífuga </td><td> Fisher Scientific </td><td> Micro 7 </td><td></td></tr><tr><td> BSA estoque de proteína </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0007 </td><td></td></tr><tr><td> BCA kit ensaio de proteína </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td><td></td></tr><tr><td> Imuno 96 poços da microplaca </td><td> Nunc </td><td> 449824 </td><td></td></tr><tr><td> Fita de vedação </td><td> Bio-Rad </td><td> 2239444 </td><td></td></tr><tr><td> De 96 poços leitor de placas </td><td> Perkin Elmer </td><td> 1420-mulilabel counter </td><td></td></tr><tr><td> Bioplex Rat dosagem de citocinas TNF-α </td><td> Bio-Rad </td><td> X0000001T </td><td></td></tr></tbody></table> Imunomarcação <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Catálogo / Número modelo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Paraformaldeído 16% </td><td> Alfa Aesar </td><td> 43368 </td><td></td></tr><tr><td> Lisina </td><td> Sigma </td><td> L-6001 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S374-1 </td><td></td></tr><tr><td> Periodato de sódio </td><td> Sigma </td><td> S-1878 </td><td></td></tr><tr><td> Azida de sódio </td><td> Sigma </td><td> S-2002 </td><td></td></tr><tr><td> Peróxido de hidrogênio (30%) </td><td> Sigma </td><td> H1009 </td><td></td></tr><tr><td> Soro de cabra </td><td> Colorado Empresa Serum </td><td> CS 0920 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T-8787 </td><td></td></tr><tr><td> Pratos coloração </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 14511 </td><td></td></tr><tr><td> Placa Shaker </td><td> Lab-Line Instruments, Inc. </td><td> 3520 </td><td></td></tr><tr><td> # 1 papéis de filtro (185 mm) </td><td> Whatman </td><td> 1001-185 </td><td></td></tr><tr><td> 3,3-diaminobenzidina </td><td> Sigma </td><td> D8001 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Pharmco-AAPER </td><td> 111000200 </td><td></td></tr><tr><td> Xileno </td><td> Fisher Scientific </td><td> X3s-4 </td><td></td></tr><tr><td> Permount meios de montagem </td><td> Fisher Scientific </td><td> SP15-100 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Leica </td><td> 050 cm 3 S </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 27050 </td><td></td></tr><tr><td> Fina ponta pincel </td><td> Ted Pella </td><td> 11806 </td><td></td></tr><tr><td> Caneta PAP bloqueio </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> SFX sinal enhancer </td><td> Invitrogen </td><td> A31631 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar Antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

estratégias para estudo da neuroproteção de frio pré-condicionamento

Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning

Lesão neurológica é uma causa freqüente de morbidade e mortalidade da anestesia geral e relacionados com os procedimentos cirúrgicos que poderia ser atenuado pelo desenvolvimento de medidas eficazes, fácil de administrar e seguro pré-tratamentos. Procuramos definir a sinalização neural imunológico responsável por pré-condicionamento frio, como meios para identificar novos alvos para o desenvolvimento de terapias para proteger o cérebro antes do início da lesão. Baixo nível mediador pró-inflamatório sinalização mudanças ao longo do tempo são essenciais para a frio pré-condicionamento neuroproteção. Esta sinalização é consistente com os princípios básicos da hormese condicionado fisiológicas, as quais requerem que os estímulos irritativos alcançar uma magnitude limite de tempo suficiente para a adaptação aos estímulos para a proteção se torne evidente. Assim, o delineamento da sinalização imunes envolvidos na neuroproteção frio pré-condicionamento requer que os sistemas biológicos e manipulações experimentais mais capacidades técnicas são altamente reprodutíveis e sensíveis. Nossa abordagem é a utilização de culturas fatia hipocampal como um modelo in vitro que reflete suas contrapartes em vivo com multi-sinápticos de redes neurais influenciadas por macroglia maduro e quiescente / microglia. Este estado glial é particularmente importante para microglia uma vez que são a principal fonte de citocinas, que são operativas na faixa femtomolar. Além disso, culturas fatia pode ser mantida in vitro por várias semanas, que é tempo suficiente para evocar estímulos ativando e avaliar respostas adaptativas. Finalmente, as condições ambientais pode ser controlada com precisão usando culturas fatia para que citocina sinalização de frio pré-condicionamento pode ser medido, imitou, e modulados para dissecar os aspectos nó crítico. Análises de citocinas sistema de sinalização de exigir o uso de técnicas sensíveis e reprodutíveis multiplexados. Usamos PCR quantitativo para o TNF-α para a tela para ativação da microglia seguido de triagem quantitativa array real-time qPCR para avaliar mudanças nos tecidos de largura de citocinas. Este último é um meio mais sensível e reprodutível para medir sistema de sinalização de citocinas várias alterações em simultâneo. Mudanças significativas são confirmadas com qPCR alvo e, em seguida, a detecção da proteína. Nós sonda para o tecido baseado em alterações de citocinas proteína usando ensaios microesfera multiplexados por citometria de fluxo usando a tecnologia Luminex. Células específicas da produção de citocinas é determinada com o dobro de rótulo imuno-histoquímica. Tomados em conjunto, esta preparação tecido cerebral e estilo de uso, juntamente com as estratégias sugeridas de investigação, pode ser uma abordagem ideal para a identificação de alvos potenciais para o desenvolvimento de novas terapêuticas que possam imitar as vantagens de frio pré-condicionamento.

Procuramos definir a sinalização neural imunológico responsável por pré-condicionamento frio, como meios para identificar novos alvos para o desenvolvimento de terapias para proteger o cérebro antes do início da lesão. Apresentamos estratégias para esse trabalho que exigem sistemas biológicos, manipulações experimentais mais capacidades técnicas que são altamente reprodutíveis e sensíveis.

Estratégias para Estudo da neuroproteção de frio pré-condicionamento

A lesão neurológica é uma causa frequente de morbidade e mortalidade decorrentes de anestesia geral e procedimentos cirúrgicos relacionados, a qual poderia ser atenuada por...

A lesão neurológica é uma causa frequente de morbidade e mortalidade associada à anestesia geral. O objetivo do trabalho apresentado neste vídeo é examinar o efeito do pré-condicionamento frio na sinalização imunológica neural de ratos, com o intuito de identificar novos alvos terapêuticos para proteger o cérebro antes do início da lesão. Isso é alcançado pela produção de culturas de fatias hipocampais de ratos adultos saudáveis e de longa sobrevida.Os cultivos são expostos a um condicionamento prévio por frio para induzir neuroproteção baseada no sistema imunológico. Em seguida, a toxina anci é adicionada e os cultivos de fatias são analisados por imagem. A análise das imagens sugere que o condicionamento prévio por frio leva a uma redução acentuada no nível de perda neuronal seletiva.Meu nome é Richard Craig, e esta é Heidi Mitchell. Somos da Universidade de Chicago, do Departamento de Neurologia, e hoje vamos descrever como o preparo de culturas de fatias pode ser utilizado para responder perguntas sobre neuroproteção envolvendo sinalização imunológica pró-inflamatória de baixo nível como um meio de tornar o cérebro mais resistente às doenças cerebrais. De modo geral, indivíduos novos neste procedimento enfrentam dificuldades devido à necessidade de garantir viabilidade de longo prazo e culturas saudáveis, capazes de exibir sinalização pró-inflamatória de baixo nível.Heidi mostrará agora uma série de procedimentos que utilizamos no laboratório para superar esses obstáculos, de modo que a sinalização pró-inflamatória em baixo nível possa ser medida como um meio de desenvolver neuroprotetores para o cérebro. Os experimentos a seguir devem ser realizados usando um jaleco limpo e luvas estéreis esticadas sobre as mangas do jaleco. Comece colocando todos os itens necessários para o procedimento em uma cabine de fluxo laminar BSL nível 1, incluindo um cortador de tecidos McIlwain com inserções de teflon, uma lâmina de barbear, instrumentos cirúrgicos e placas de Petri para dissecação.O capuz deve ser instalado em uma sala de cultura com pressão positiva e filtro HIPAA, onde o ar é purificado por ventiladores autônomos de limpeza de ar com luz ultravioleta, pelo menos 30 minutos antes do início dos experimentos. Coloque uma placa fria de dissecação dentro do capuz e conecte-a a um banho-maria próximo no capuz de cultura celular. Coloque um inserto tipo MilliCell em cada poço de uma placa de seis poços e adicione 1,1 mililitro de meio de cultura a cada um.Coloque a bandeja em uma incubadora a 36 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade por pelo menos 20 minutos. Mantenha os filhotes de rato aquecidos até que sejam necessários, colocando-os sob uma lâmpada de calor. Anestesie o filhote colocando-o em dióxido de carbono a 100%. Após a anestesia, mergulhe o filhote em etanol a 100%, em seguida decapite-o e coloque o corpo em uma placa de Petri de 100 milímetros e a cabeça em outra.Em seguida, use uma tesoura curva para íris para abrir o crânio com uma incisão mediana, seguida por dois cortes laterais para a esquerda e para a direita atrás dos olhos. Use pinças anguladas para afastar o crânio sobrejacente e uma espátula para começar a remover o cérebro. Remova o cérebro cortando os nervos trigêmeos com a espátula e coloque o cérebro na metade inferior de uma placa de Petri de 60 milímetros contendo 10 mililitros de solução salina balanceada estéril e fria acrescida de glicose.Em seguida, utilize a pinça IOx número cinco sob uma espátula de íris número dois para dissecar os hipocampos de cada hemisfério e coloque-os sobre um disco de teflon para o cortador McIlwain. Usando a espátula, afaste o meio do tecido cerebral utilizando o cortador com espessura de corte ajustada entre 350 e 400 micrômetros. Seccione os hipocampos perpendicularmente ao seu eixo longo com um corte rápido de um mililitro.Lave as fatias recém-cortadas dos insertos de teflon e coloque-as na metade superior de uma placa de Petri de 60 milímetros contendo BSS gelado. Coloque as fatias sob um microscópio estereoscópico e examine-as. Identifique quaisquer fatias que tenham um giro denteado intacto e uma camada celular parametal.Em seguida, coloque suavemente as três fatias maiores sobre um inserto, preparando um total de 12 fatias por pop. Coloque os insertos em uma bandeja de seis compartimentos e incube a 36 graus Celsius, trocando a cada três a quatro dias. Renove o meio de crescimento substituindo o meio antigo por meio novo e aquecido.Retorne as células ao incubador a 36 graus após sete dias. Substitua o meio por 1,1 mililitros de meio neurobasal suplementado livre de soro. No dia 18, examine a vitalidade das culturas de fatias.Inicie colocando 1,1 mililitros de ox poel em placas de cultura de seis poços. Coloque a placa no incubador para aquecê-la até 36 graus Celsius. Enquanto isso, ligue uma fonte de luz fluorescente com filtro fitzy para o microscópio e deixe aquecer por pelo menos 20 minutos.Isso garantirá intensidade luminosa uniforme. Em seguida, use pin&ccedil;as para colocar os insertos de cultura de fatias no meio inox por 10 minutos. Depois, transfira-os novamente para o meio livre de SIM.Coloque o inserto de cultura na platina do microscópio e marque a orientação para rastrear lesões parametálicas irreversíveis. Posicione as culturas sobre uma superfície asséptica de um microscópio invertido com aumento de cinco vezes, mantendo as fatias em uma orientação semelhante à utilizada no pré-rastreamento.Alterne para o cubo de emissão de citação FIT CX. Selecione culturas que tenham menos de 30 células positivas para cytx na área ca um para o pré-condicionamento a frio. Coloque 1,1 mililitro de meio livre de soro em uma placa de cultura de seis poços e coloque a placa em um incubador a 30 graus com 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade por pelo menos 20 minutos para equilibrar o meio após o transcurso de 20 minutos.Remova o meio de equilíbrio do incubador. Transfira os insertos de cultura com as fatias do meio livre de soro normal para o meio a 30 graus. Em seguida, coloque-os no incubador a 30 graus por 90 minutos após a incubação.Retorne as culturas de fatias ao meio normal sem soro e incube a 36 graus por 24 horas. Inicie o pré-rastreamento para uso experimental de culturas de fatias transferindo os insertos de cultura para o meio citoplasmático durante 20 minutos. Enquanto as fatias estão em incubação, ligue a lâmpada ultravioleta e a câmera CCD e deixe-as aquecerem por 20 minutos.Se necessário, utilize o software para limpar o CCD expondo-o à luz por 50 ciclos. Em seguida, pipete uma solução de 10 microlitros de fluoresceína em 90 microlitros de PBS sobre um hemocitômetro com profundidade de 100 micrômetros e coloque-o na platina do microscópio. Utilizando o software, ajuste o tempo de exposição para que a faixa dinâmica seja de 1000 de 4.096.Em seguida, coloque o recipiente com culturas de fatias pré-condicionadas a frio no microscópio e adquira as imagens. Essas imagens serão usadas para determinar o nível de fluorescência de fundo, que será subtraído da fluorescência emitida pelas fatias lesadas. Se o pré-condicionamento a frio em si tiver causado lesão, células com aumento da fluorescência serão observadas a seguir.Para examinar o efeito da lesão por ExoToxina, transfira os inserts para meio livre de soro contendo 20 a 50 micromolar e MDA que tenha sido equilibrado a 36 graus Celsius por pelo menos 20 minutos. Incube por 60 minutos a 36 graus Celsius; o NMDA imita os efeitos do neurotransmissor glutamato após a incubação. Remova o NMDA dos inserts mergulhando cada um três vezes em três placas separadas de 60 milímetros.Cada um contendo 10 mililitros de meio neurobasal aquecido a 36 graus Celsius. Não utilize mais de três insertos para cada conjunto de placas de 360 milímetros. Após a lavagem, coloque os insertos em uma bandeja contendo meio fresco e retorne-os ao incubador de 36 graus.Após 24 horas, calibre a câmera com um padrão de fluoresceína como antes. Em seguida, coloque as culturas em meio OX por 20 minutos antes das imagens. Se os níveis de lesão forem baixos um dia após a lesão, prolongue o experimento de dois a três dias, conforme necessário, para quantificar a lesão utilizando o software metamorph.Defina uma área de interesse ao redor da região CA1 para medir a intensidade de uma região selecionada para lesão. Copie e cole a área de interesse da lesão para a imagem de fundo. Em seguida, insira os valores de lesão e fundo no Excel usando software estatístico.Quantifique o numerador subtraindo o fundo para as culturas controle e as submetidas à pré-condição fria, e realize o teste estatístico apropriado para comparar a lesão no grupo experimental com o grupo controle, que sempre deve ser incluído em cada execução experimental. Esta imagem mostra uma coloração típica de cultura de fatias hipocampais maduras após 21 dias de cultivo in vitro. A marcação por end-labeling novo, mostrada em verde, é utilizada para ilustrar a arquitetura celular dos neurônios principais.Neurônios parametais são mostrados nas áreas CA1 e CA3 do hipocampo e neurônios do giro denteado ou DG são vistos à esquerda aqui. A área CA1 mostrada em maior aumento ilustra a qualidade ramificada da microglia quiescente. Em culturas de fatias maduras, as células foram marcadas com o marcador de superfície da microglia CD11b. Esta figura mostra os efeitos do pré-condicionamento frio, neuroproteção e culturas de fatias hipocampais incubadas com o marcador verde cytx para células mortas.As imagens de pré-avaliação à esquerda mostram nenhuma lesão aparente aqui. Culturas controle simuladas são mostradas na parte superior e culturas com condicionamento térmico são mostradas na parte inferior. As imagens da linha do meio mostram a lesão relativa da cultura de fatias 24 horas após a exposição a 20 micromolares de NMDA.Observe que a lesão do controle simulado é maior do que a das culturas expostas à precondicionamento frio, identificadas como cp. A escala de calibração de cor da lesão relativa é mostrada na imagem superior esquerda. Tradicionalmente, as culturas são então expostas a um nível máximo de lesão, como 20 micromolar e MDA durante a noite, para maximizar os níveis de lesão neuronal CA1 e a lesão relativa do precondicionamento frio em comparação com o simulado, indicada como uma razão entre a lesão e a lesão máxima.No entanto, a exposição a estímulos de lesão máximos pode não ser suficiente para superar a neuroproteção conferida pelo condicionamento prévio. Assim, o uso de razões entre lesão e lesão máxima pode não refletir com precisão a neuroproteção proporcionada pelo condicionamento prévio. Isso é evidente nas imagens do lado direito, que mostram que os níveis máximos de condicionamento prévio a frio são menores do que os dos controles simulados.Neste estudo, verificou-se que o uso de razões entre lesão e lesão máxima pode ocultar a neuroproteção conferida pelo pré-condicionamento frio. Isso pode ser observado no esquema onde a lesão simulada é mostrada em vermelho e a lesão após pré-condicionamento frio em azul, um dia após a exposição ao NMDA: após o pré-condicionamento frio, o nível de lesão foi determinado como três, comparado ao nível cinco observado no controle simulado. Isso é consistente com 40% de neuroproteção.No entanto, se for utilizado um formato tradicional com razões, como lesão em relação à lesão máxima, nenhuma proteção é evidente. Em outras palavras, 50% para o grupo controle versus 50% para o pré-condicionamento térmico. A PCR quantitativa foi realizada utilizando amostras de mRNA conforme mostrado aqui.Os níveis de TNF alfa após o pré-condicionamento frio, representados pela linha azul, foram mais altos do que os controles, representados pelas linhas verde, amarela e roxa. Isso sugere que o pré-condicionamento frio induz um aumento na produção de TNF alfa no cérebro; para confirmar os resultados de PCR quantitativa e matriz de PCR quantitativa, realizou-se coloração imuno-histoquímica. Este cultivo de fatias foi processado para interleucina 11, mostrada em vermelho, e um novo final para mostrar os neurônios, mostrados em verde.Observe que alguns neurônios parametais, indicados pelas setas, mostram marcação dupla para interleucina 11 e novo fim, e são exibidos em amarelo. As setas apontam para algumas células menores que se presume serem astrócitos e que mostram apenas aumento da marcação para interleucina 11. Ao delinear o sistema de sinalização de citocinas envolvido na neuroproteção pela pré-condicionamento ao frio, é importante observar alguns conceitos fundamentalmente importantes.Embora as citocinas estejam em concentrações extremamente baixas no cérebro normal, pequenas alterações nas concentrações de citocinas modificam a expressão gênica. Assim, mesmo em baixas concentrações, as citocinas têm um potencial imenso para alterar a estrutura e a função cerebrais e, portanto, o fenótipo de um organismo. Esse conceito é representado aqui pela inversa da distância, começando por um bigode de gato como ponto de referência e comparando sódio, potássio, pH e cálcio com a TNF alfa.É também importante ter em mente que as citocinas são altamente redundantes e pleiotrópicas: múltiplas citocinas podem ter efeitos semelhantes e uma única citocina pode ter efeitos variáveis. Assim, para estabelecer com precisão a base inata de citocinas para a neuroproteção conferida pelo condicionamento térmico, é necessário determinar uma análise composta de variáveis relacionadas de sinalização. Isso é realizado por meio de estratégias de ensaio multiplex, que estabelecerão o perfil de citocinas associado à neuroproteção pelo condicionamento térmico. Uma vez dominadas, essas culturas podem ser preparadas em aproximadamente três horas e utilizadas em manipulações para estudo.A resposta do pré-condicionamento ao frio pode ser realizada ao longo de aproximadamente três dias enquanto esses procedimentos são executados; é essencial lembrar que técnicas estéreis e manipulação mínima são necessárias para preservar a capacidade de detectar sinalização pró-inflamatória de baixo nível após esses procedimentos. Outros métodos, como análises proteômicas e biológicas moleculares, podem ser aplicados às culturas para decifrar os mecanismos pelos quais o pré-condicionamento ao frio exerce seu efeito nutritivo e protetor sobre o cérebro.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Existem evidências, que o pré-condicionamento isquêmico (PC) - um desafio isquêmico não-prejudicial ao cérebro - confere uma proteção transitória a um insulto isquêmico prejudicial subseqüente. Nós estabelecemos a oclusão da artéria carótida comum bilateral (BCCAO) como um estímulo pré-condicionamento isquémico para induzir tolerância precoce (TI) para a isquemia cerebral focal transiente (induzida pela oclusão da artéria cerebral média, MCAO) em C57BL6 / J mice.

Oclusão bilateral artéria carótida comum como um estímulo pré-condicionamento adequados para induzir a tolerância isquêmica início da Isquemia Cerebral Focal

Fonte: Zheng, Y., et al. Modelos experimentais para estudar a neuroproteção do pós-condicionamento ácido contra isquemia cerebral. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a aplicação do pós-condicionamento ácido (APC) para avaliar seus efeitos neuroprotetores contra lesão isquêmica em um modelo de camundongo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO). Ele descreve as etapas envolvidas na reperfusão no modelo MCAO e a aplicação de APC durante a reperfusão para mitigar a excitotoxicidade, o...

 Avaliação dos efeitos neuroprotetores do pós-condicionamento ácido em um modelo de camundongo com isquemia cerebral

Fonte: Poinsatte, K., et al., Quantificação da proteção neurovascular após pré-condicionamento hipóxico repetitivo e oclusão transitória da artéria cerebral média em camundongos. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o método de pré-condicionamento hipóxico repetitivo (RHP) expondo um camundongo a ciclos de hipóxia controlados antes de induzir um acidente vascular cerebral isquêmico. O experimento avalia seus efeitos na estabilidade da barreira hematoencefálica, adaptação neuronal e...

Adaptação neuronal ao pré-condicionamento hipóxico repetitivo em camundongos

Fonte: Brandli, A. Pré-condicionamento isquêmico de membros remotos: uma técnica neuroprotetora em roedores. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra um protocolo não invasivo de pré-condicionamento isquêmico de membros em ratos para induzir neuroproteção sistêmica. O procedimento envolve oclusão e reperfusão arterial controladas, desencadeando vias de estresse celular que liberam fatores de proteção. Esses fatores aumentam a resistência a lesões isquêmicas e metabólicas em órgãos distantes,...

Pré-condicionamento isquêmico não invasivo de membros em modelo de rato para neuroproteção

Pré-condicionamento isquémico remoto (RIP) é um método de tecidos condicionado contra o stress prejudicial. Nós estabelecemos um método de isquemia remoto no membro posterior, inflando um manguito de esfigmomanômetro para 5-10 min. As capacidades neuroprotectoras de PIR foi demonstrada num modelo de degeneração da retina em roedores.

Membro Remoto Pré-Condicionamento Isquêmico: A Técnica neuroprotetor em roedores

Este protocolo descreve o pré-condicionamento hipóxico repetitivo ou breves exposições à hipóxia sistêmica que reduzem os volumes de infarto e a ruptura da barreira hematoencefálica após oclusão transitória da artéria cerebral média em camundongos. Ele também detalha a quantificação dupla do volume do infarto e da ruptura da barreira hematoencefálica após o AVC para avaliar a eficácia da proteção neurovascular.

Quantificação de Proteção Neurovascular sequência repetitiva Hypoxic Pré-condicionamento e Transient Oriente oclusão da artéria cerebral em ratos

oclusão cirúrgica de um ramo distal da artéria cerebral média (MCAo) é um modelo usado com freqüência em pesquisa acidente vascular cerebral experimental. Este manuscrito descreve a técnica básica de MCAo permanente, combinada com a inserção de uma janela craniana lateral, que oferece a oportunidade para microscopia intravital longitudinal em ratinhos.

Lateral Crônica Cranial Janela Preparação Ativa In Vivo Observação Após Distal Middle Cerebral Oclusão da Artéria em Ratos

O pós-condicionamento ácido protege contra a isquemia cerebral. Aqui apresentamos dois modelos para executar a APC. Eles são obtidos, respectivamente, transferindo fatias corticostriatais para o tampão ácido após a privação de oxigênio-glicose in vitro e pela inalação de 20% de CO 2 após a oclusão da artéria cerebral média in vivo .

Modelos experimentais para estudar a neuroproteção do pós-condicionamento ácido contra a isquemia cerebral

Complexa locomoção em ambientes naturalísticos que exigem coordenação cuidadosa dos membros envolve regiões do córtex parietal. O seguinte protocolo descreve o uso de desativação reversível induzida pelo resfriamento, para demonstrar o papel da área parietal 5 a evitar o obstáculo memória guiadas no gato ambulante.

Reversíveis induzida pelo resfriamento desativações para estudar Cortical contribuições para a memória do obstáculo o gato ambulante

Os efeitos distintos de diferentes graus de hipotermia na proteção do miocárdio não foram minuciosamente avaliados. O objetivo do presente estudo foi quantificar os níveis de morte celular após diferentes tratamentos de hipotermia em um modelo baseado em cardiomiócito humano, estabelecendo as bases para futuras pesquisas moleculares aprofundadas.

Avaliação in vitro da proteção do miocárdio após hipotermia-pré-condicionamento em um modelo de miócitos cardíacos humanos

Este artigo descreve dois métodos de indução de hipotermia de curto período em ratos. O primeiro método de indução rápida, emprega resfriamento ativo usando ventiladores e spray de etanol para uma rápida diminuição da temperatura. O segundo método é um método de resfriamento gradual. Isso é conseguido usando a combinação de anestesia isoflurane e a redução das configurações de temperatura no tapete de calor homeotémico. Isso resulta em uma diminuição gradual da temperatura corporal do núcleo...

Indução de hipotermia de curta duração em ratos usando modelos para estudos que examinam relevância clínica e mecanismos

Aprenda a usar culturas de fatias hipocampais de ratos para estudar neuroproteção por pré-condicionamento a frio. Este método revela mecanismos de sinalização imune neural envolvendo citocinas pró-inflamatórias.

Estratégias para Estudo da neuroproteção de frio pré-condicionamento

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