Microscopia Confocal de córnea: uma técnica não-invasiva Novel para Quantificar Pequenas Fibre Patologia em neuropatias periféricas

Este vídeo demonstra um procedimento para obter imagens de fibras C corneanas utilizando a técnica não invasiva de microscopia confocal corneana ou CCM, permitindo a quantificação de danos aos nervos. Primeiro, o plano focal da lente no CCM é ajustado e gel lacrimal viscoso é aplicado na lente antes da colocação da tampa descartável. Gotas anestésicas e gel lacrimal viscoso são então aplicadas no olho.

Em seguida, a câmera é ajustada para estabelecer o contato entre o gel na frente da lente e a córnea do paciente. Por fim, a profundidade do plano de foco é ajustada e são capturadas imagens das fibras nervosas corneanas da região central da camada de Bowman. Alterações morfológicas nas fibras nervosas corneanas podem ser observadas para quantificar a neuropatia.

Esta é uma técnica muito nova que, na verdade, já foi utilizada anteriormente no campo da optometria e oftalmologia, mas, nos últimos oito anos, aproximadamente, temos a empregado de forma muito eficaz para estudar e avaliar a neuropatia diabética e outras neuropatias periféricas. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite quantificar danos nas fibras pequenas em estágio muito precoce e, em seguida, estratificar a gravidade da neuropatia nos pacientes de maneira totalmente não invasiva, o que podemos fazer rapidamente com um exame de dois minutos, que pode então ser quantificado em termos da severidade da neuropatia. Assim, esperamos que este método supere algumas das outras técnicas muito mais invasivas, como a biópsia de pele e a biópsia de nervo. Embora pareça, em geral, uma técnica simples, na realidade, exige etapas definidas pelas quais se captura a imagem de forma ideal e, em seguida, se quantifica a imagem.

E realmente queremos tornar todo esse processo claro e evidente para qualquer outra pessoa que deseje utilizar esta técnica. O passo inicial no exame com o microscópio confocal corneano HRT é a preparação da ponta da lente objetiva no tubo do objetivo da câmera de varredura a laser. Ajuste a refração para +12 dioptrias e, em seguida, posicione a câmera na altura mais baixa e fixe a lente girando-a no sentido anti-horário.

Aplicar uma grande gota de tamanho P de lágrimas viscosas, homogênea e sem bolhas, sobre a ponta da lente. Retirar uma tampa tomo do seu recipiente estéril e colocá-la sobre a ponta da lente o mais longe possível sobre o suporte, de modo que o gel forme um menisco entre a lente objetiva e a tampa. Ter cuidado para não tocar a superfície frontal da tampa tomo durante a colocação.

Agora, mova a câmera de varredura a laser o mais para trás possível no suporte da câmera, em relação à superfície interna e externa da tampa do tomógrafo. Ambas aparecem como um reflexo luminoso do laser no monitor de exibição. Ajuste a roda de ajuste do plano focal até observar um reflexo brilhante, indicando que a lente está focada na parte frontal da tampa.

O valor de profundidade exibido na tela de posição de foco deve agora estar entre menos 150 micrômetros e mais 150 micrômetros. Reinicie a configuração de profundidade para zero. Agora vamos ver como preparar o paciente.

Após anestesiar os olhos do sujeito com uma gota de cloridrato de proparcaína a 0,4%, lubrifique a parte frontal do olho com lágrimas viscosas. Posicione o sujeito confortavelmente com o queixo no apoio de queixo, garantindo que sua testa esteja pressionada firmemente contra a barra frontal. O exame é facilitado ao instruir o paciente a fixar o olhar na luz de fixação externa.

Com o olho não examinado, o tamanho compacto da cabeça do microscópio garante que o olho contralateral do sujeito não fique obstruído, permitindo o uso de alvos distantes. Posicione a câmera CCD de modo que seu eixo óptico seja perpendicular ao eixo óptico da câmera de varredura a laser.

A câmera deve estar no lado direito do paciente ao imaginar o olho direito e vice-versa. Nessa posição, a superfície frontal da cápsula de tomografia é vista no centro da câmera CCD. Imagem em tempo real.

Mova a câmera de varredura a laser em direção ao paciente até que a córnea do paciente esteja a uma distância de cerca de cinco a dez milímetros do tomo cap. Em seguida, use os botões de ajuste vertical e horizontal no suporte da câmera para mover a câmera de varredura a laser para cima e para baixo e para a esquerda e direita até que o tomo cap esteja posicionado no centro da córnea do paciente. Agora, peça ao paciente para abrir os olhos o máximo possível.

Mova lentamente a câmera de varredura a laser em direção ao paciente até que a cápsula tomográfica entre em contato com a córnea do paciente. Nesta etapa, verifique se a luz vermelha do laser está no centro da córnea e se o reflexo do feixe de laser na córnea ocorre exatamente no polo anterior da córnea. Há contato mínimo entre a lente e a córnea com ajuste ideal.

Uma fina ponte de gel entre a cápsula de tomografia e a córnea é visível na imagem em tempo real da câmera CCD. Se houver pressão excessiva entre a cápsula de tomografia e a córnea, a córnea apresentará uma aparência achatada na imagem da câmera CCD. A imagem em tempo real e o strayer aparecem na imagem de CCM.

Após ajustar o paciente, ligue a câmera a laser HR três, e a janela de aquisição de imagem aparecerá na tela. Use a imagem CCD para posicionar a cápsula de tomografia e a luz laser na córnea do paciente. O CCM possui três opções para capturar imagens.

A varredura de sequência permite a aquisição de até 100 imagens com uma taxa de quadros ajustável. Seleciona-se uma taxa de quadros entre 30 e um quadro por segundo. Com base nisso, pode-se adquirir um vídeo com duração de três a 100 segundos.

No modo de varredura volumétrica, a câmera adquire automaticamente uma série de 40 imagens em planos focais consecutivos. Uma profundidade total de 85 micrômetros pode ser varrida, e a distância focal entre duas imagens consecutivas é de aproximadamente 2,1 micrômetros. A última opção é o modo de corte, que será utilizado para este experimento.

Este modo permite uma imagem ideal com imagens únicas nítidas adquiridas e armazenadas cada vez que o pedal é pressionado. Este modo é utilizado para capturar imagens de toda a camada corneana, incluindo a camada de Bowman no centro da córnea. Após capturar um número suficiente de imagens, outros modos podem ser utilizados, incluindo sequência e volume.

Após algumas varreduras, o plano focal da lente pode ser alterado para medir a profundidade de uma camada de células corneanas em relação à superfície corneana, trazendo a camada de células epiteliais para o foco e, em seguida, clicando no botão de reinicialização para definir o valor de profundidade como zero. Após a conclusão do exame, desligue a câmera clicando no botão de energia da câmera na janela de aquisição. Informe ao paciente que ele não deve esfregar os olhos até que a anestesia local tenha desaparecido.

Remova a tampa do obturador da câmera, descarte-a e, em seguida, limpe a lente do microscópio com um cotonete umedecido com água destilada. Agora vamos ver como analisar uma imagem e quantificar parâmetros das fibras nervosas para revisar e analisar exames existentes. Primeiro, selecione o registro adequado do paciente na janela do banco de dados.

A janela de visualização de imagens fornece uma visão geral dos exames de córnea existentes para o paciente selecionado. Os exames realizados em dias diferentes são armazenados em abas de visita separadas. Os três diferentes tipos de varredura são representados por três ícones distintos. Na aba de visita da córnea HRT três do HRT, na janela de visualização de imagens do Heidelberg Eye Explorer.

Para examinar a imagem da córnea, clique duas vezes no ícone da imagem apropriado e, em seguida, pressione mostrar agora para exportar as imagens adequadas para análise adicional; clique em exportar na barra de ferramentas e selecione a pasta onde as imagens serão salvas. Como o foco principal desta pesquisa está na camada de Bowman e nos nervos corneanos, somente as imagens dessa camada serão analisadas. De cinco a seis quadros da camada de Bowman são selecionados para cada indivíduo em diferentes profundidades da córnea.

A análise de imagem é realizada com um software especializado desenvolvido pelo nosso grupo chamado CCM Image Analysis Tools, versão 0.64. Os principais parâmetros para os nervos corneanos são medidos com o auxílio do software: a densidade das fibras nervosas, definida como o número de nervos principais por quadro. A densidade de ramificação nervosa é o número total de ramificações principais por quadro.

O comprimento da fibra nervosa é o comprimento total dos nervos principais e de seus ramos principais por quadro de fibra nervosa. A tortuosidade é a sinuosidade dos nervos principais por quadro. Para abrir uma imagem de CCM, vá até o arquivo e depois selecione abrir.

Uma vez que a imagem é carregada, seu tamanho e tipo são exibidos na caixa de informações da imagem no canto superior esquerdo do painel de controle, e a escala padrão é exibida na linha de edição das informações da imagem. Se a escala for diferente, modifique o número na linha de edição. Para iniciar a análise da imagem, selecione o parâmetro que deseja medir na caixa de métricas no canto superior direito do painel de controle.

Na caixa de resultados na parte inferior da página, NFD e MBD são apresentados como um número real. NFL é apresentado em milímetros e a tortuosidade como um coeficiente de tortuosidade. Os resultados podem ser exportados para uma planilha do Excel.

Quando você abrir a página do Excel, os resultados serão apresentados em número por milímetro quadrado para NFD e MBD, milímetros por milímetro quadrado para NFL e coeficiente de tortuosidade para NFT. Para realizar essas medições, comece marcando cada nervo principal, depois marque cada ramo do nervo principal. Finalmente, trace cada nervo no quadro.

Uma caneta digital pode ser usada para obter maior precisão. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em um minuto, desde que seja executada corretamente ao tentar este procedimento. É importante seguir as instruções detalhadas.

Após assistir a este vídeo, esperamos que você tenha uma boa compreensão de como trabalhar e capturar imagens da camada de movimento da córnea com microscopia confocal da córnea, e quantificar e analisar as imagens dessa camada em pacientes com neuropatia periférica, em particular neuropatia diabética. E não se esqueça de que trabalhar com CCM exige experiência e recomenda-se que profissionais treinados em exame ocular realizem o procedimento.