Name: Microscopia Confocal de córnea: uma técnica não-invasiva Novel para Quantificar Pequenas Fibre Patologia em neuropatias periféricas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Aprenda a usar microscopia confocal de córnea para quantificar danos em fibras nervosas periféricas. Esta técnica não invasiva permite avaliar alterações morfológicas e estratificar a gravidade da neuropatia em pacientes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado pela Juvenile Diabetes Research Foundation International (conceder 17-2008-1031) e os Institutos Nacionais de Saúde (concessão 1R01DK077903-01A1).

Introdução: A quantificação precisa de neuropatia periférica é importante definir em pacientes de risco, antecipar deterioração, e avaliar novas terapias. Métodos convencionais avaliar os déficits neurológicos e eletrofisiologia e testes sensoriais quantitativos quantifica as alterações funcionais para detectar a neuropatia. No entanto, os primeiros danos parece ser a de que as fibras pequenas e ainda esses testes principalmente avaliar a disfunção das fibras grandes e têm uma capacidade limitada para demonstrar regeneração e reparo. As técnicas que permitem que apenas um exame direto dos danos unmyelinated de fibras nervosas e de reparação são nervo sural com microscopia eletrônica de biópsia e pele-biópsia. No entanto, ambos são procedimentos invasivos e necessitam de procedimentos de laboratório longo e uma experiência considerável. A microscopia confocal de córnea é uma técnica não-invasiva clínicos que fornece in-vivo de imagens de fibras nervosas da córnea. HRT Módulo III-Rostock córnea (RCM) Manual de Operação 1. Preparação da Câmara O passo inicial no exame usando HRT é a preparação da ponta da lente objetiva. <ol><li> Primeiro objetivo no tubo da câmera de varredura a laser, defina a refração de 12 dioptrias e, em seguida, ajustar a câmera para a posição mais baixa. </li><li> Aplicar uma grande bolha, homogênea livre, queda de ervilha de tamanho, de Viscotears na ponta da lente. </li><li> Remover um TomoCap de seu recipiente estéril e montá-lo sobre a ponta da lente de modo que o gel forma um menisco entre a lente objetiva ea tampa. Empurrá-lo, tanto quanto possível sobre o titular. Tenha cuidado para não tocar a superfície frontal de TomoCap durante a montagem. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Preparação da ponta lente objetiva (em cima) aplicando viscotear gel (baixo) Aplicando a TomoCap. </li><li> Mover a câmera de varredura a laser, tanto para trás quanto possível sobre a montagem da câmera. </li><li> A superfície interna e externa do TomoCap ambos aparecem como uma reflexão do laser brilhante. A roda de ajuste de plano focal deve ser ajustado até que um reflexo luminoso é observado, indicando que a lente está focada na parte da frente do boné. O valor da profundidade mostrada no visor posição do foco agora deve estar entre -150 mm e 150 mM. </li><li> Redefinir a configuração de profundidade de zero. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Ajuste do plano focal. </li></ol> 2. Preparar o paciente Os olhos do sujeito estão anestesiados com uma queda de 0,4% de cloridrato de benoxinate e Viscotears é usado na parte da frente do olho para a lubrificação. O assunto está sentado confortavelmente, com o queixo no queixo e no resto solicitado a pressionar sua testa com firmeza contra o bar testa. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Preparar o paciente 3. Alinhando a Câmara Isso torna o exame mais fácil se você instruir o paciente para corrigir a luz de fixação externa com o olho não examinado. O tamanho compacto da cabeça microscópio significa que o olho contralateral do sujeito não é obscurecida, possibilitando o uso de alvos à distância. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Lente objetiva do módulo de córnea. <ol><li> A posição da câmera CCD de tal forma que seu eixo óptico é perpendicular ao eixo óptico da câmera de varredura a laser. A câmera deve estar no lado direito do paciente quando imagem do olho direito e vice-versa. Nesta posição, você deve ver a superfície frontal do TomoCap no centro da imagem da câmera CCD ao vivo. </li><li> Mover a câmera de varredura a laser em direção ao paciente até que a córnea do paciente é a uma distância de cerca de 5 a 10 mm da TomoCap, em seguida, mover a câmera de varredura a laser para cima / baixo e esquerda / direita usando os botões preto no suporte de câmera até o TomoCap está posicionado no centro da córnea do paciente. Nesta fase você pode verificar que a luz laser vermelho está no centro da córnea e para o ajuste fino, observe o reflexo do feixe de laser da córnea, que é visível na imagem da câmera CCD. Esta reflexão deve ocorrer exatamente no pólo anterior da córnea. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Alinhamento do feixe de laser no pólo anterior da córnea para capturar imagens centrais da córnea. </li><li> Peça ao paciente para abrir os olhos dele / dela o mais amplo possível. Mover a câmera de varredura a laser lentamente para a frente em relação ao paciente até que os contatos TomoCap córnea do paciente. Se for necessáriopara corrigir a posição da câmera de varredura a laser, em seguida, mover a câmera longe do primeiro paciente, fazer a correção, em seguida, movê-lo para a frente novamente entrar em contato com a córnea. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Demonstração da ponte gel fina entre o TomoCap ea córnea. </li><li> Contato mínimo entre a câmara ea córnea é suficiente. Em um ajuste ideal, uma ponte entre o gel fino TomoCap ea córnea é visível na imagem da câmara CCD ao vivo. </li></ol> Se você pressionar o TomoCap ou mover a córnea demasiado perto da câmera, então você vai ver a pressão sobre a córnea com uma aparência achatada na córnea através da imagem da câmera CCD ao vivo. Também nas imagens obtidas de uma linha mostrando a pressão vai aparecer, portanto, não aplique muita pressão para a córnea. Depois que o contato tenha sido estabelecido, não mova a posição do headrestto evitar deslizamento da córnea na TomoCap. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 7"> Figura 7 (à esquerda) Aparecimento de uma straie devido à aplicação de excesso de pressão sobre a córnea pela TomoCap;. (Direita) Uma imagem com aparência normal, sem excesso de pressão. 4. Examinar o paciente Após o campo de visão foi selecionado, o HRT III câmera laser é ligado ea janela de aquisição de imagem aparece na tela. Use a imagem CCD para posicionar o TomoCap e luz laser na córnea do paciente. Exame usando o modo selecionado pode então ser iniciado. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig8.jpg" alt="Figura 8" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Vendo modo no monitor durante a aquisição das imagens. O modo de aquisição No modo de seção, uma única imagem é adquirido e armazenado cada vez que você pressionar o pedal. Usamos este modo para capturar imagens de toda a camada córnea, incluindo camada de Bowman no centro da córnea. E, em seguida, depois de capturar um número suficiente de imagens, pode-se tentar outros modos incluindo seqüência e volume. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig9.jpg" alt="Figura 9" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 9"> Figura 9. Display com escolha para diferentes modos de aquisição de imagem. Com a verificação de seqüência, pode-se adquirir uma seqüência de até 100 imagens com uma taxa de frame ajustável. Você pode escolher uma taxa de quadros entre 30 e 1 frame frames por segundo (fps) e com base neste modo permite-lhe adquirir um filme com uma duração de 3 a 100 segundos. No modo de varredura volume, a câmera automaticamente adquire uma série de 40 imagens em planos consecutivos focal. A profundidade total de 85 mM podem ser digitalizados com a "400 m FOV" lente de campo ea distância focal entre duas imagens consecutivas será de aproximadamente 2,1 mM. Depois de um alguns scans do plano de focagem da lente pode ser alterado para medir a profundidade de uma camada de células da córnea em relação à superfície da córnea, trazendo a camada de células epiteliais em foco e, em seguida, clicar no botão Redefinir para definir o valor de profundidade a 0. Para efeitos de nosso estudo, obter imagens a partir da córnea central em diferentes profundidades. Portanto, não mover a câmera de varredura a laser ao redor da córnea horizontalmente ou verticalmente, basta mover para trás e para frente e capturar imagens de todas as profundidades da camada de Bowman no mesmo ponto da córnea. A distância entre cada imagem é de aproximadamente 1 mm; portanto, se a profundidade de Bowman é 10 mM, teremos 10 imagens. No entanto, para análise final, vamos selecionar as imagens a uma distância de cerca de 2-3 mM entre eles. Após o exame completo é desligar a câmera clicando no botão de energia da câmera na janela de aquisição. Tornar o paciente consciente de que ele ou ela não deve esfregar seus olhos até que a anestesia local tem desgastado fora. Como precaução, você pode desejar realizar um exame na lâmpada de fenda da córnea do paciente após o exame. Remover o TomoCap da câmera e eliminá-lo e depois limpar a lente do microscópio com um cotonete umedecido com água destilada. 5. Análise de um exame a. Selecionando os quadros Para rever e analisar os exames existentes, o registro do paciente apropriado (s) deve ser selecionado na janela banco de dados. A janela de visualização de imagem fornece uma visão geral de exames existentes córnea para o paciente selecionado. Exames realizados em dias diferentes são armazenadas em abas separadas visita. Os três tipos de scan diferentes são representadas por três diferentes ícones na guia visita HRT III córnea da janela de visualização de imagem do HeiDelberg Eye Explorer. Para o levantamento da imagem córnea, clique duas vezes no ícone de imagem adequada ea "Show" função abre a seguinte janela: <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig10.jpg" alt="Figura 10" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 10"> Figura 10. Exibição de todas as imagens capturadas após o exame. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig11.jpg" alt="Figura 11" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 11"> Figura 11. Exibição de imagem selecionada antes da exportação, com visão da câmera CCD do olho para mostrar alinhamento correto. Para exportar as imagens apropriadas para posterior análise, clique em "Export" na barra de ferramentas e selecione a pasta que você deseja salvar as imagens para. Obtemos e capturar imagens de todas as camadas da córnea de cada paciente, mas como o foco principal desta pesquisa é na camada de Bowman e os nervos da córnea, apenas as imagens desta camada será analisado. Nós selecionamos 5-6 frames da camada de Bowman para cada indivíduo em diferentes profundidades da córnea. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig12.jpg" alt="Figura 12" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 12"> Figura 12. Exibição de todas as camadas da córnea de um indivíduo saudável. Em média 5-6 frames da camada de Bowman no centro da córnea em diferentes profundidades são selecionados aleatoriamente para medições quantitativas e análise. b. Análise de imagens Para analisar as imagens captadas a partir da camada de Bowman da córnea central com HRT III, usamos um software especializado que tem sido desenvolvido dentro do nosso grupo chamado "Image Analysis Tools CCM v 0.6". Quatro parâmetros principais para os nervos da córnea são medidos com este software: <ul><li> Densidade de fibras nervosas (NFD), que é definido como o número de nervos main / frame. </li><li> Nervo ramo densidade numérica (NBD) de ramos principais / frame. </li><li> Comprimento da fibra nervosa (NFL), que é o comprimento total de todos os nervos / frame. </li><li> Tortuosidade de fibras nervosas (NFT) dos principais nervos / frame. </li></ul> Para abrir imagem CCM, vá para o arquivo&gt; abrir. <ul><li> Uma vez que a imagem é carregada, o seu tamanho e tipo é exibido no Box de Informações da imagem no topo do lado esquerdo do Painel de Controle. </li><li> A escala padrão é exibido na linha de edição de imagem da Informação. Se a escala é diferente, modifique o número na linha de edição. </li><li> Para começar a analisar a imagem, selecione o parâmetro que você quer medir a Caixa Metric no lado direito superior do painel de controle. </li><li> Na caixa de resultado na parte inferior da página o número de NFD, NBD é apresentado em número real, NFL em mm e tortuosidade como um Coeficiente de tortuosidade (TC). </li><li> No entanto depois de exportar os resultados para uma folha excel, os resultados serão apresentados em nenhum mm / 2 para NFD e NBD e mm / mm 2 para NFL. </li><li> Para este efeito, depois de terminar as medições clique em Adicionar medições, então vá ao menu Arquivo&gt; Salvar como e abra os resultados salvos com Excel. </li></ul><img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig13.jpg" alt="Figura 13" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 13"> Figura 13. Exibição da imagem nervosas da córnea com o rastreamento na ferramenta de análise usando "CCM Ferramenta de Análise de Imagem". 6. Resultados representativos: Temos demonstrado um progressivo aumento na degeneração dos nervos da córnea com a gravidade da neuropatia diabética 1 e danos nos nervos no início de diabetes, que precede a perda de fibras nervosas intraepidérmicas em biópsias de pele 2, juntamente com a estratificação de gravidade neuropática e reparação após o transplante do pâncreas em pacientes diabéticos 3. Temos também demonstrou lesão do nervo na neuropatia fibra idiopática pequenos 4 e doença de Fabry 5. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig14.jpg" alt="Figura 14" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 14"> Figura 14. Córnea imagens de microscopia confocal com HRT III da camada de Bowman corneana do (a) sujeito em relação ao controle (b) Paciente com neuropatia e lesões nervosas graves.

<ol><li>Abbott, C. A., Kallinikos, P., Marshall, A., Finnigan, J., Morgan, P., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Confocal+Microscopy%3A+A+Novel+Non-invasive+Test+to+Diagnose+and+Assess+Progression+of+Human+Diabetic+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Test to Diagnose and Assess Progression of Human Diabetic Neuropathy.</a> Diabetes Care. 33, 1792-1797 (2010).</li>
<li>Quattrini, C., Tavakoli, M., Jeziorska, M., Kallinikos, P., Tesfaye, S., Marshall, A., Finnigan, J., Boulton, A. J. M., Efron, N., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surrogate+Markers+of+Small+Fiber+Damage+in+Human+Diabetic+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Surrogate Markers of Small Fiber Damage in Human Diabetic Neuropathy.</a> Diabetes. 56, 2148-2154 (2007).</li>
<li>Mehra, S., Tavakoli, M., Efron, N., Boulton, A. J. M., Augustine, T., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Confocal+Microscopy+Detects+Early+Nerve+Regeneration+After+Pancreas+Transplantation+in+Patients+with+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Corneal Confocal Microscopy Detects Early Nerve Regeneration After Pancreas Transplantation in Patients with Type 1 Diabetes.</a> Diabetes Care. 30, 2608-2612 (2007).</li>
<li>Tavakoli, M., Marshall, A., Pitceathly, R., Fadavi, H., Gow, D., Roberts, M. E., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+confocal+microscopy%3A+A+novel+means+to+detect+nerve+fibre+damage+in+patients+with+impaired+glucose+tolerance+and+idiopathic+small+fibre+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Corneal confocal microscopy: A novel means to detect nerve fibre damage in patients with impaired glucose tolerance and idiopathic small fibre neuropathy.</a> Experimental Neurology. 223, 245-250 (2010).</li>
<li>Tavakoli, M., Marshall, A., Thompson, L., Kenny, M., Waldek, S., Efron, N., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+confocal+microscopy%3A+A+novel+technique+to+detect+small-fibre+neuropathy+in+patients+with+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Corneal confocal microscopy: A novel technique to detect small-fibre neuropathy in patients with Fabry disease.</a> Muscle & Nerve. 40, 976-984 (2009).</li>
</ol>

Figuras 4-6: Cortesia de Heidelberg Engenharia

Microscopia confocal da córnea (CCM) é uma técnica não-invasiva clínica que pode ser usado para detectar danos nos nervos cedo e quantificar pequenas fibras de patologia em neuropatias periféricas, incluindo diabetes, doença de Fabry e idiopática neuropatias de fibras pequenas (ISFN). O impacto imediato clínica desta técnica representa um grande salto em termos de nossa capacidade de diagnosticar, acompanhar a evolução e avaliar a resposta terapêutica em pacientes com neuropatia diabética e outras neuropatias periférica...

<table><tbody><tr><td>Máquina HRT III CCM - Módulo de Córnea de Rostock</td><td></td><td></td><td>Heidelberg Engineering</td></tr><tr><td>Software de análise de imagem CCM versão 0,6</td><td></td><td></td><td>Universidade de Manchester</td></tr></tbody></table>

microscopia confocal de córnea: uma técnica não-invasiva novel para quantificar pequenas fibre patologia em neuropatias periféricas

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

A quantificação precisa de neuropatia periférica é importante definir em pacientes de risco, antecipar deterioração, e avaliar novas terapias. Métodos convencionais avaliar os déficits neurológicos e eletrofisiologia e testes sensoriais quantitativos quantifica as alterações funcionais para detectar a neuropatia. No entanto, os primeiros danos parece ser a de que as fibras pequenas e ainda esses testes principalmente avaliar a disfunção das fibras grandes e têm uma capacidade limitada para demonstrar regeneração e reparo. As técnicas que permitem que apenas um exame direto dos danos unmyelinated de fibras nervosas e de reparação são nervo sural com microscopia eletrônica de biópsia e pele-biópsia. No entanto, ambos são procedimentos invasivos e necessitam de procedimentos de laboratório longo e uma experiência considerável. A microscopia confocal de córnea é uma técnica não-invasiva clínicos que fornece in-vivo de imagens de fibras nervosas da córnea. Demonstramos lesão do nervo precoce, o que precede a perda de fibras nervosas intraepidérmicas em biópsias de pele, juntamente com a estratificação de gravidade neuropática e transplante de pâncreas após reparo em pacientes diabéticos. Temos também demonstrou lesão do nervo na neuropatia fibra idiopática pequenas e doença de Fabry.

A microscopia confocal de córnea é uma técnica não-invasiva clínicos que podem ser utilizados para quantificar os danos da fibra C para diagnosticar e estratificar pacientes com maior gravidade neuropática.

Microscopia Confocal de córnea: uma técnica não-invasiva Novel para Quantificar Pequenas Fibre Patologia em neuropatias periféricas

A quantificação precisa da neuropatia periférica é importante para definir pacientes em risco, antecipar a deterioração e avaliar novas terapias. ...

Este vídeo demonstra um procedimento para obter imagens de fibras C corneanas utilizando a técnica não invasiva de microscopia confocal corneana ou CCM, permitindo a quantificação de danos aos nervos. Primeiro, o plano focal da lente no CCM é ajustado e gel lacrimal viscoso é aplicado na lente antes da colocação da tampa descartável. Gotas anestésicas e gel lacrimal viscoso são então aplicadas no olho.Em seguida, a câmera é ajustada para estabelecer o contato entre o gel na frente da lente e a córnea do paciente. Por fim, a profundidade do plano de foco é ajustada e são capturadas imagens das fibras nervosas corneanas da região central da camada de Bowman. Alterações morfológicas nas fibras nervosas corneanas podem ser observadas para quantificar a neuropatia.Esta é uma técnica muito nova que, na verdade, já foi utilizada anteriormente no campo da optometria e oftalmologia, mas, nos últimos oito anos, aproximadamente, temos a empregado de forma muito eficaz para estudar e avaliar a neuropatia diabética e outras neuropatias periféricas. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite quantificar danos nas fibras pequenas em estágio muito precoce e, em seguida, estratificar a gravidade da neuropatia nos pacientes de maneira totalmente não invasiva, o que podemos fazer rapidamente com um exame de dois minutos, que pode então ser quantificado em termos da severidade da neuropatia. Assim, esperamos que este método supere algumas das outras técnicas muito mais invasivas, como a biópsia de pele e a biópsia de nervo. Embora pareça, em geral, uma técnica simples, na realidade, exige etapas definidas pelas quais se captura a imagem de forma ideal e, em seguida, se quantifica a imagem.E realmente queremos tornar todo esse processo claro e evidente para qualquer outra pessoa que deseje utilizar esta técnica. O passo inicial no exame com o microscópio confocal corneano HRT é a preparação da ponta da lente objetiva no tubo do objetivo da câmera de varredura a laser. Ajuste a refração para +12 dioptrias e, em seguida, posicione a câmera na altura mais baixa e fixe a lente girando-a no sentido anti-horário.Aplicar uma grande gota de tamanho P de lágrimas viscosas, homogênea e sem bolhas, sobre a ponta da lente. Retirar uma tampa tomo do seu recipiente estéril e colocá-la sobre a ponta da lente o mais longe possível sobre o suporte, de modo que o gel forme um menisco entre a lente objetiva e a tampa. Ter cuidado para não tocar a superfície frontal da tampa tomo durante a colocação.Agora, mova a câmera de varredura a laser o mais para trás possível no suporte da câmera, em relação à superfície interna e externa da tampa do tomógrafo. Ambas aparecem como um reflexo luminoso do laser no monitor de exibição. Ajuste a roda de ajuste do plano focal até observar um reflexo brilhante, indicando que a lente está focada na parte frontal da tampa.O valor de profundidade exibido na tela de posição de foco deve agora estar entre menos 150 micrômetros e mais 150 micrômetros. Reinicie a configuração de profundidade para zero. Agora vamos ver como preparar o paciente.Após anestesiar os olhos do sujeito com uma gota de cloridrato de proparcaína a 0,4%, lubrifique a parte frontal do olho com lágrimas viscosas. Posicione o sujeito confortavelmente com o queixo no apoio de queixo, garantindo que sua testa esteja pressionada firmemente contra a barra frontal. O exame é facilitado ao instruir o paciente a fixar o olhar na luz de fixação externa.Com o olho não examinado, o tamanho compacto da cabeça do microscópio garante que o olho contralateral do sujeito não fique obstruído, permitindo o uso de alvos distantes. Posicione a câmera CCD de modo que seu eixo óptico seja perpendicular ao eixo óptico da câmera de varredura a laser.A câmera deve estar no lado direito do paciente ao imaginar o olho direito e vice-versa. Nessa posição, a superfície frontal da cápsula de tomografia é vista no centro da câmera CCD. Imagem em tempo real.Mova a câmera de varredura a laser em direção ao paciente até que a córnea do paciente esteja a uma distância de cerca de cinco a dez milímetros do tomo cap. Em seguida, use os botões de ajuste vertical e horizontal no suporte da câmera para mover a câmera de varredura a laser para cima e para baixo e para a esquerda e direita até que o tomo cap esteja posicionado no centro da córnea do paciente. Agora, peça ao paciente para abrir os olhos o máximo possível.Mova lentamente a câmera de varredura a laser em direção ao paciente até que a cápsula tomográfica entre em contato com a córnea do paciente. Nesta etapa, verifique se a luz vermelha do laser está no centro da córnea e se o reflexo do feixe de laser na córnea ocorre exatamente no polo anterior da córnea. Há contato mínimo entre a lente e a córnea com ajuste ideal.Uma fina ponte de gel entre a cápsula de tomografia e a córnea é visível na imagem em tempo real da câmera CCD. Se houver pressão excessiva entre a cápsula de tomografia e a córnea, a córnea apresentará uma aparência achatada na imagem da câmera CCD. A imagem em tempo real e o strayer aparecem na imagem de CCM.Após ajustar o paciente, ligue a câmera a laser HR três, e a janela de aquisição de imagem aparecerá na tela. Use a imagem CCD para posicionar a cápsula de tomografia e a luz laser na córnea do paciente. O CCM possui três opções para capturar imagens.A varredura de sequência permite a aquisição de até 100 imagens com uma taxa de quadros ajustável. Seleciona-se uma taxa de quadros entre 30 e um quadro por segundo. Com base nisso, pode-se adquirir um vídeo com duração de três a 100 segundos.No modo de varredura volumétrica, a câmera adquire automaticamente uma série de 40 imagens em planos focais consecutivos. Uma profundidade total de 85 micrômetros pode ser varrida, e a distância focal entre duas imagens consecutivas é de aproximadamente 2,1 micrômetros. A última opção é o modo de corte, que será utilizado para este experimento.Este modo permite uma imagem ideal com imagens únicas nítidas adquiridas e armazenadas cada vez que o pedal é pressionado. Este modo é utilizado para capturar imagens de toda a camada corneana, incluindo a camada de Bowman no centro da córnea. Após capturar um número suficiente de imagens, outros modos podem ser utilizados, incluindo sequência e volume.Após algumas varreduras, o plano focal da lente pode ser alterado para medir a profundidade de uma camada de células corneanas em relação à superfície corneana, trazendo a camada de células epiteliais para o foco e, em seguida, clicando no botão de reinicialização para definir o valor de profundidade como zero. Após a conclusão do exame, desligue a câmera clicando no botão de energia da câmera na janela de aquisição. Informe ao paciente que ele não deve esfregar os olhos até que a anestesia local tenha desaparecido.Remova a tampa do obturador da câmera, descarte-a e, em seguida, limpe a lente do microscópio com um cotonete umedecido com água destilada. Agora vamos ver como analisar uma imagem e quantificar parâmetros das fibras nervosas para revisar e analisar exames existentes. Primeiro, selecione o registro adequado do paciente na janela do banco de dados.A janela de visualização de imagens fornece uma visão geral dos exames de córnea existentes para o paciente selecionado. Os exames realizados em dias diferentes são armazenados em abas de visita separadas. Os três diferentes tipos de varredura são representados por três ícones distintos. Na aba de visita da córnea HRT três do HRT, na janela de visualização de imagens do Heidelberg Eye Explorer.Para examinar a imagem da córnea, clique duas vezes no ícone da imagem apropriado e, em seguida, pressione mostrar agora para exportar as imagens adequadas para análise adicional; clique em exportar na barra de ferramentas e selecione a pasta onde as imagens serão salvas. Como o foco principal desta pesquisa está na camada de Bowman e nos nervos corneanos, somente as imagens dessa camada serão analisadas. De cinco a seis quadros da camada de Bowman são selecionados para cada indivíduo em diferentes profundidades da córnea.A análise de imagem é realizada com um software especializado desenvolvido pelo nosso grupo chamado CCM Image Analysis Tools, versão 0.64. Os principais parâmetros para os nervos corneanos são medidos com o auxílio do software: a densidade das fibras nervosas, definida como o número de nervos principais por quadro. A densidade de ramificação nervosa é o número total de ramificações principais por quadro.O comprimento da fibra nervosa é o comprimento total dos nervos principais e de seus ramos principais por quadro de fibra nervosa. A tortuosidade é a sinuosidade dos nervos principais por quadro. Para abrir uma imagem de CCM, vá até o arquivo e depois selecione abrir.Uma vez que a imagem é carregada, seu tamanho e tipo são exibidos na caixa de informações da imagem no canto superior esquerdo do painel de controle, e a escala padrão é exibida na linha de edição das informações da imagem. Se a escala for diferente, modifique o número na linha de edição. Para iniciar a análise da imagem, selecione o parâmetro que deseja medir na caixa de métricas no canto superior direito do painel de controle.Na caixa de resultados na parte inferior da página, NFD e MBD são apresentados como um número real. NFL é apresentado em milímetros e a tortuosidade como um coeficiente de tortuosidade. Os resultados podem ser exportados para uma planilha do Excel.Quando você abrir a página do Excel, os resultados serão apresentados em número por milímetro quadrado para NFD e MBD, milímetros por milímetro quadrado para NFL e coeficiente de tortuosidade para NFT. Para realizar essas medições, comece marcando cada nervo principal, depois marque cada ramo do nervo principal. Finalmente, trace cada nervo no quadro.Uma caneta digital pode ser usada para obter maior precisão. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em um minuto, desde que seja executada corretamente ao tentar este procedimento. É importante seguir as instruções detalhadas.Após assistir a este vídeo, esperamos que você tenha uma boa compreensão de como trabalhar e capturar imagens da camada de movimento da córnea com microscopia confocal da córnea, e quantificar e analisar as imagens dessa camada em pacientes com neuropatia periférica, em particular neuropatia diabética. E não se esqueça de que trabalhar com CCM exige experiência e recomenda-se que profissionais treinados em exame ocular realizem o procedimento.

corneal-confocal-microscopy-novel-non-invasive-technique-to-quantify

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

A fim de estudar as alterações de fibras nervosas intra-epidérmica nociceptivos (IENFs) em neuropatias dolorosas (PN), protocolos que nós desenvolvemos pode examinar directamente as alterações morfológicas observadas tridimensionais em IENFs nociceptivos. Análise tridimensional de IENFs tem o potencial de avaliar as alterações morfológicas de IENF na PN.

Imagem tridimensional de nociceptivos Fibras Nervosas intraepidérmicos em biópsias de pele humana

O protocolo para a imagem latente longitudinal dinâmico e lesão seletiva a laser de terminações nervosas em repórter camundongos transgênicos é apresentado.

In Vivo Two-Photon Microscopia de terminações nervosas individuais em Pele

A junção neuromuscular (JNM) é alterada em uma variedade de condições que às vezes podem culminar em insuficiência sináptica. Este relatório descreve métodos baseados em microscópio de fluorescência para quantificar essas mudanças estruturais.

A Junção Neuromuscular: Synapse Medir o tamanho, Mudanças de fragmentação e em Synaptic Density proteína utilizando microscopia de fluorescência confocal

Este protocolo usa tridimensional (3D) de imagem e análise técnicas para visualizar e quantificar mitocôndrias nervo específico. As técnicas são aplicáveis a outras situações onde um sinal fluorescente é usado para isolar um subconjunto de dados de outro sinal fluorescente.

Imagem tridimensional e análise de mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas humana

Descrevemos o uso da microscopia de coerência óptica de campo total como método para avaliação de alta qualidade do estroma doador de córnea. Esse protocolo pode ser utilizado para identificar características indicativas de saúde ou doença, e visa melhorar a triagem e seleção de tecidos doados e, consequentemente, os resultados da ceratoplastia.

Microscopia de coerência óptica de campo total para análise histológica de características estromais em enxertos de córnea

A capacidade de detectar com precisão componentes de junção neuromuscular é crucial na avaliação de modificações em sua arquitetura devido a processos patológicos ou de desenvolvimento. Aqui apresentamos uma descrição completa de um método simples para obter imagens de alta qualidade de junções neuromusculares de montagem inteira que podem ser usadas para realizar medições quantitativas.

Dissecção de fibras musculares esqueléticas únicas para análises imunofluorescentes e morfométricas de junções neuromusculares de monte inteiro

Este protocolo descreve um método para análise morfométrica de junções neuromusculares por microscopia confocal combinada e STED que é usado para quantificar alterações patológicas em modelos de camundongos de SMA e CMS relacionada ao ColQ.

Caracterização de Junções Neuromusculares em Camundongos por Microscopia Confocal Combinada e Super-Resolução

O teste de sensibilidade da córnea fornece informações sobre a saúde dos nervos da córnea e ajuda a diagnosticar doenças da superfície ocular. Apresentamos um protocolo conciso para avaliar qualitativamente a sensibilidade da córnea que pode ser prontamente usado por oftalmologistas em ambientes clínicos.

Procedimento de teste de sensibilidade da córnea para pacientes oftalmológicos e optométricos

A capilaroscopia é uma ferramenta acessível para visualização direta, barata e não invasiva da microvasculatura. O objetivo deste protocolo é permitir que os pesquisadores usem a capilaroscopia para a visualização da morfologia microvascular periférica nos leitos ungueais de camundongos.

Visualização não invasiva da morfologia microvascular do leito ungueal em camundongos usando capilaroscopia

Este artigo demonstra a operação e o efeito da microscopia confocal in vivo no diagnóstico e tratamento do olho seco e investiga a aplicação e os resultados da microscopia confocal in vivo para fornecer uma base para pesquisas futuras.

In vivo Microscopia Confocal no Diagnóstico e Tratamento do Olho Seco: Um Foco em Protocolos de Imagem e Interpretação

Aprenda a usar microscopia confocal de córnea para quantificar danos em fibras nervosas periféricas. Esta técnica não invasiva permite avaliar alterações morfológicas e estratificar a gravidade da neuropatia em pacientes.

Microscopia Confocal de córnea: uma técnica não-invasiva Novel para Quantificar Pequenas Fibre Patologia em neuropatias periféricas (Vídeo) | JoVE Journal

Microscopia Confocal de córnea: uma técnica não-invasiva Novel para Quantificar Pequenas Fibre Patologia em neuropatias periféricas

Explorar mais vídeos