Formadoras de Colônias celular Assay (CFC) para células hematopoiéticas humanas

O ensaio de células formadoras de colônia (CFC) é um ensaio in vitro em que células progenitoras hematopoéticas formar colônias em meio semi-sólido. Uma combinação de morfologia da colônia, morfologia celular e citometria de fluxo são utilizados para avaliar a capacidade dos progenitores a proliferar e se diferenciar ao longo dos diferentes linhagens hematopoiéticas.

Este procedimento avalia em meio semissólido, a capacidade dos progenitores hematopoiéticos de proliferar e se diferenciar ao longo de diferentes linhagens hematopoiéticas para iniciar a cultura. Células positivas para CD 34 recém-descongeladas na presença de citocinas para promover a ativação após dois dias. Realize a transdução retroviral de uma construção de teste que expressa GFP adicionando as células positivas CD 34 ativadas a uma placa pré-carregada com vírus.

48 horas depois, isolar as células positivas para GFP por fax e, em seguida, colocar essas células em meio de metilcelulose semissólido suplementado com fatores de crescimento e incubar por aproximadamente duas semanas até que as colônias apareçam na superfície. Por fim, colher as colônias, imobilizar as células em lâminas com citosina e corar com giza direita para determinação microscópica da linhagem hematopoiética e estágio de maturação. Este método pode fornecer informações mecanicistas em estudos de leucemogênese, ou seja, os efeitos dos oncogenes na diferenciação hematopoiética.

Para ver uma cultura, descongele rapidamente um frasco de células positivas para CD 34 congeladas a 37 graus Celsius, agitando suavemente até que reste um último pequeno cristal de gelo e transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros. Enxágue suavemente as células restantes do frasco com um mililitro de meio à temperatura ambiente, 2%F-B-S-I-M-D-M e adicione-o gota a gota ao tubo de 50 mililitros enquanto gira suavemente. Agora espere três minutos.

Continue adicionando lentamente dois mililitros de mídia enquanto mistura suavemente e equilibre novamente por três minutos. Repita este procedimento de adicionar meios de igual volume à suspensão de células diluídas em intervalos de três minutos, girando suavemente entre as adições até que o volume final atinja 32 mililitros para coletar as células, centrifugar a 250 G por 10 minutos em temperatura ambiente e remover o supernat, deixando para trás cerca de 0,5 mililitro de meio acima do pellet. Proceda à lavagem das células uma vez, suspendendo o pellet em 20 mililitros de meio e centrifugando a 200 G por oito minutos À temperatura ambiente, remova o sane e suspenda as células em meio IMDM completo a aproximadamente meio milhão de células por mililitro.

Finalmente, para determinar a concentração celular, coloque 10 microlitros da suspensão em um microtubo misturado com o mesmo volume de solução de azul de 0,4% trian e conte. Usando um hemocitômetro, dilua as células para 10 elevado ao quinto de células por mililitro, adicionando meio IMDM completo suplementado com a mistura de cultura de citocinas ativadoras, as células em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por dois dias no dia da transdução contam as células antes de iniciar a pré-carga do vírus para determinar o número de poços a serem preparados para a placa de cultura de tecidos não tratada de 24 poços. Adicione 400 microlitros de 25 microgramas por mililitro, solução de retro actina a cada poço e incube por duas horas em temperatura ambiente na capela de biossegurança de fluxo laminar.

Remova a solução de retro actina e codifique cada poço com 2% BSA incubando por 30 minutos em temperatura ambiente. Enquanto isso, descongele as soluções de estoque de vírus e guarde no gelo. Em seguida, aspire o vírus de carga da solução BSA adicionando 0,5 mililitro de preparação do vírus a cada poço e centrifugue a 2.200 G a quatro graus Celsius por 15 minutos.

Remova a solução de vírus dos poços e repita o carregamento do vírus mais três vezes. Por fim, enxágue cada poço com meio IMDM frio. Agora colete as células positivas CD 34 pré-ativadas por centrifugação e ressuspenda as células em meio IMDM completo fresco suplementado com citocinas alíquota de 0,15 milhão de células positivas CD 34 em cada um dos poços codificados pelo vírus, poços e incube em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por dois dias para colher as células transduzidas suavemente, mas completamente.

Suspenda as células das placas flutuantes do vírus e filtre a suspensão através de um filtro de células de 50 mícrons em um tubo cônico. Leve 10 microlitros da suspensão celular para um microtubo. Misture com um volume igual de solução de azul trian e conte as células usando um hemocitômetro.

Enxágue cada poço com 0,8 mililitro de HBSS frio com 0,02% EDTA e adicione ao mesmo tubo de coleta através de um filtro de célula CEL Trix de 50 mícrons. Pulverize as células por centrifugação e lave uma vez com HBSS frio. Suspenda novamente o pellet celular final em HBSS com 1% BA e mantenha as células no gelo no escuro para a classificação subsequente das células, que normalmente é realizada em uma instalação de núcleo classificador de células de alta velocidade com base no projeto experimental.

Descongele vigorosamente o número necessário de alíquotas de vórtice de meio de ensaio CFC para misturar e deixe o tubo repousar durante pelo menos cinco minutos para permitir que as bolhas subam à superfície antes de adicionar células. Agora pegue 3000 células classificadas transduzidas por vírus em um microtubo estéril contendo meio frio 2%F-B-S-I-M-D-M e ajuste o volume final da suspensão para 0,3 mililitros. Suspender as células e transferir toda a suspensão celular para uma alíquota de três mililitros de meio de cultura de cultura de cultura metila.

Crie uma suspensão celular homogênea por vórtice vigorosamente. Deixe o tubo parado por três minutos. Para colocar as células, conecte uma agulha de ponta romba de calibre 16 a uma seringa de três mililitros e extraia de 2,2 mililitros.

Tomando cuidado para evitar a absorção de bolhas grandes, empurre 1,1 mililitro cada em duas placas de cultura de tecidos não tratadas de 30 milímetros e espalhe a mistura uniformemente girando as placas duplicadas em uma placa de 100 milímetros junto com uma placa de água. Continuando três litros de cultura de água estéril por duas semanas. Caracterizar e pontuar as colônias de acordo com sua morfologia com microscópio invertido com aumento de 40x em uma placa de cultura marcada com uma grade de pontuação.

Para documentar os resultados da cultura, escaneie toda a placa de ensaio CFC usando um scanner comum a 600 DPI e faça micrografias fotográficas de baixa potência de colônias representativas usando um microscópio invertido equipado com uma câmera colorida para análise posterior de células de diferenciação e proliferação de toda a placa de ensaio CFC são recuperadas suspendendo em vários volumes de temperatura ambiente 2%F-B-S-I-M-D-M lavado e contado para análises morfológicas. Transfira 30.000 células que foram recuperadas de placas de ensaio CFC para uma lâmina. Usando uma centrífuga giratória STOs, seque as lâminas ao ar durante a noite para tingi-las com eficiência.

Montar uma linha de montagem de nove recipientes de coloração contendo soluções na seguinte ordem. Metanol absoluto solução estoque gemsa direito tampão gemsa direito, 50% de metanol e água, dois recipientes de tampão fosfato de água pH seis e, finalmente, dois vasos de água. Coloque as lâminas em um suporte de lâminas e mergulhe em metanol absoluto por dois minutos e retire o excesso de metanol.

Mergulhe imediatamente o suporte de lâminas e escreva a solução de estoque gemsa por cinco minutos. Transfira o transportador para o tampão gemsa direito pH 6,4 e incube por 10 minutos. Mergulhe o transportador duas vezes em 50% de metanol 10 vezes em água e outras 10 vezes no próximo recipiente de água e depois cinco vezes em tampão fosfato.

pH 6,0. Transfira o transportador para a água e incube por dois minutos. Repita a lavagem no último recipiente de água.

Agora deixe as corrediças secarem completamente no transportador. Remova cada lâmina e limpe a parte de trás da lâmina com lenços umedecidos em metanol para remover manchas. Coloque uma gota de cyto seal 60 e uma tampa de vidro para selar.

Realize uma contagem diferencial de 500 células para cada lâmina sustentada GM usando um microscópio. Para os propósitos deste experimento, as células são divididas em cinco categorias, células primitivas, células mielóides intermediárias, células mielóides maduras, células eritróides intermediárias e células eritróides maduras. Por exemplo, quando comparado à expressão de controle dos novos 98 falcões, um oncogene nove aumentou a formação de colônias eritróides vermelhas.

Esse impacto do oncogene no mercado é claramente evidente quando as colônias são observadas sob baixa ampliação. Um exame morfológico adicional por sustentação GEM fornece informações sobre a linhagem e o grau de maturação da população de células. Neste exemplo, a introdução de novos 98 Hawks, um nove causou um aumento geral no número de células com hiperplasia eritróide e inibiu a inibição da maturação eritróide e mielóide.

Este SA fornece informações sobre a diferenciação de células hematopoiéticas, medindo a capacidade de uma preparação de células de entrada de proliferar, diferenciar e formar colônias em um meio semissólido.