Name: Formadoras de Colônias celular Assay (CFC) para células hematopoiéticas humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Aprenda o ensaio de formação de colônias celulares (CFC) para avaliar a proliferação e diferenciação de células-tronco hematopoiéticas humanas CD34+ em meio semi-sólido. Este método permite estudar os efeitos de oncogenes na hematopoiese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos ao Alvin J. Siteman Cancer Center, em Washington University School of Medicine e Barnes-Jewish Hospital, em St Louis, MO, para o uso da Alta Velocidade Núcleo Sorter Cell, que forneceu equipamentos de citometria de fluxo e serviços de classificação. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grants R01 HL082549 e K02 HL084179 (NRY). O Siteman Cancer Center é suportado, em parte, por um suporte NCI Centro de Câncer Grant P30 CA91842.

1. PREPARAÇÃO DE REAGENTES <ol><li> Prepare estéril soluções estoque de 1000x Fms relacionados tirosina quinase 3 (FLT-3) ligando, estimulante de colônias de granulócitos / macrófagos factor (GM-CSF), fator de células tronco (SCF), trombopoietina (TPO), interleucina (IL) -3 e IL-6 de acordo com instruções do fabricante. Preparar a solução estoque estéril Retronectin (1mg/ml) também de acordo com instruções do fabricante. Dividir estas soluções estoque em pequenas alíquotas e manter a -20 ° C para evitar repetidos de congelamento e descongelamento. </li><li> Prepare FBS 2% em IMDM. </li><li> Prepare IMDM médio completo, com concentrações finais de FBS 20%, 2 mM de glutamina, 100 unidades / ml penicilina / estreptomicina (PS). Adicione o seguinte citocinas imediatamente antes da utilização: 100 ng / ml ligante FLT-3, 20 ng / ml GM-CSF, 100 ng / ml SCF, 100 ng / ml TPO, 50 ng / ml de IL-3, e 100 ng / ml IL-6. </li><li> Prepare BSA 1% em HBSS (Ca e Mg-livre, sem vermelho de fenol) e BSA 2% em D-PBS (Ca e Mg-free). Esterilizar as soluções, passando por filtros de 0,22 mm e seringa de armazenamento a 4 ° C. </li><li> Prepare EDTA 0,02% em HBSS e armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare-GALV pseudotyped retrovírus codificação do DNA de interesse e armazenamento em alíquotas a -80 ° C. Este procedimento está fora do escopo deste artigo, mas é descrita em outra parte (1-3). </li></ol> Para coloração Giemsa <ol start="7"><li> Imediatamente antes da utilização, filtrar a solução Wright / Giemsa duas vezes através de 1 mícron papéis de filtro dentro de uma garrafa de vidro limpa. </li><li> Imediatamente antes do uso, prepare Wright / Giemsa tampão pH 6,4, através da mistura de 50 ml da solução filtrada Wright / Giemsa e 200 ml de solução tampão fosfato, pH 6.4 - Giordano fórmula. </li><li> Preparar a solução tampão fosfato, pH 6,0, dissolvendo 27,3 g de KH 2 PO 4 e 4,62 g de Na 2 HPO 4 em 3,5 LH 2 O. </li><li> Prepare metanol a 50% em H 2 O. </li></ol> 2. PROCEDIMENTO Descongelamento e pré-ativação de células CD34 + <ol><li> Descongelar um frasco de congelados células CD34 + rapidamente a 37 ° C agitando até que um pequeno cristal de gelo última é para a esquerda e transferir a suspensão celular (1 ml) para um tubo de 50 ml. Suavemente enxaguar as células restantes do frasco com 1 ml de temperatura ambiente 2% FBS / IMDM e adicioná-lo gota a gota, ao tubo de 50 ml enquanto agita suavemente. Aguarde 3 minutos. Em seguida, adicionar lentamente 2 ml de 2% FBS / IMDM, enquanto misturando suavemente, e espere por 3 minutos. Repita o procedimento, adicionando 2% FBS / IMDM que é o mesmo volume da suspensão diluída de células em intervalos de 3 min, rodando suavemente entre adições, até que o volume final chega a 32 ml. </li><li> Centrifugar a 250 xg por 10 minutos em temperatura ambiente e remover o sobrenadante deixando para trás cerca de 0,5 ml. </li><li> Lave o pellet, suspendendo em 20 ml de 2% FBS / IMDM e centrifugação a 200 xg por 8 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Remover o sobrenadante e suspender as células em meio IMDM completa em aproximadamente 0,5 x 10 6 células / ml. Tomar 10 ml da suspensão de células em um microtubo mix, com o mesmo volume de solução de azul de Trypan (0,4%) e contar com um hemocitômetro. </li><li> Diluir as células a 0,1-0,15 X 10 6 células / ml, adicionando médio IMDM completo suplementado com citocinas (ver 1.3) </li><li> Cultura as células em um umidificado 37 ° C incubadora com 5% de CO 2 para 2 dias. </li></ol> Transdução retroviral por vírus pré-carregamento <ol start="7"><li> No dia de transdução, contagem de células antes de iniciar a pré-carga de vírus para determinar o número de poços a ser preparada. </li><li> Diluir a solução estoque Retronectin a 25 mg / ml e adicionar 400 mL em cada poço de uma placa de 24 poços de cultura de tecidos não-tratados. Incubar por 2 horas em temperatura ambiente na capa de biossegurança de fluxo laminar para o revestimento de pré-. </li><li> Remover a solução Retronectin e adicionar 400 mL de BSA 2% em D-PBS a cada poço. Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Descongelar soluções estoque de vírus e manter em gelo. Remover a solução BSA, adicionar 0,5 ml da preparação de vírus a cada poço, e centrifugar a 2200 xg, a 4 ° C por 15 minutos. </li><li> Remover o vírus solução de poços e repita o carregamento vírus descrito no 2,10 mais três vezes. </li><li> Enxágüe bem com o frio cada 0,5 ml HBSS (+ Ca e Mg) ou IMDM. </li><li> Recolher o pré-ativado células CD34 + por centrifugação a 200 xg por 8 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Volte a suspender as células em 0,1-0,15 x 10 6 células por 1,5 ml em meio IMDM completo com citocinas. </li><li> Adicione 1,5 ml de suspensão celular a cada poço e incubar em um umidificado 37 ° C incubadora com 5% de CO 2 para 2 dias. </li></ol> Separação de células e recolha de células transduzidas <ol start="16"><li> Suave mas completamente suspender as células do vírus-carregado acima da placas e filtrar através de um filtro de 50 mm de células CellTrics em um tubo cônico. Tomar 10 ml da suspensão de células em um microtubo mix, com um volume igual de solução de azul de Trypan e contar com um hemocitômetro. Enxágüe bem com cada 0,8 ml de frio 0,02% EDTA / HBSS (Ca e Mg-livre sem vermelho de fenol) e adicionar ao tubo de coleta mesma através de um filtro 50 mm de células CellTrics. </li><li> Centrifugar as células a 200 xg por 8 minutos a 4 ° C e lavar o pellet com frio HBSS (Ca e Mg-livre sem vermelho de fenol) por centrifugação a 200 xg por 8 minutos a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1% BSA / HBSS (Ca e Mg-livre sem vermelho de fenol) para uma concentração de 15 X 10 6 ml / ou um volume mínimo de 0.250 ml para separação de células. Manter as células no gelo no escuro. Prepare um tubo contendo 20% FBS frio / IMDM / Glutamina / PS médio para a coleta das células classificadas. Triagem é realizada no núcleo de alta velocidade Sorter Celular do J. Alvin Siteman Cancer Center, em Washington University School of Medicine utilizando um MoFlo classificador de alta velocidade (Dako, Glostrup, Dinamarca). </li></ol> CFC ensaio <ol start="19"><li> Descongelar o número necessário de 3 ml alíquotas de mídia ensaio CFC. Vortex vigorosamente para misturar e deixar os tubos de ficar pelo menos 5 min para que as bolhas existentes a subir para a superfície antes de adicionar células. </li><li> Para obter a concentração de células para cada amostra classificados, dividir o número de células fornecidas pela instalação de classificação pelo volume aproximado de células de suspensão. Tome-vírus 3000 transduzidas, células classificadas em um microtubo estéril contendo frio de 2% FBS / IMDM. Pré-ajustar o volume de 2% FBS / IMDM para que o volume final será de suspensão de aproximadamente 0,3 ml. </li><li> Suspender as células e transferência de toda a 0,3 ml de suspensão celular a uma alíquota de 3 ml de Methocult GF + H4435, que consiste em metilcelulose 1%, 30% FBS, BSA 1%, 10 -4 M 2-mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina, 50 ng / ml SCF, 20 ng / ml GM-CSF, 20 ng / ml de IL-3, 20 ng / ml de IL-6, 20 ng / ml G-CSF, e 3 unidades / ml em IMDM eritropoietina. Enriquecido Humanos Metilcelulose Media (R &amp; D Systems), que consiste de metilcelulose 1,3%, FBS 25%, BSA 1%, 5 x 10 -5 M 2-mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina, 50 ng / ml SCF, 20 ng / ml GM-CSF, 20 ng / ml de IL-3, 20 ng / ml de IL-6, 20 ng / ml G-CSF, e 3 unidades / ml em IMDM eritropoietina podem ser usados ​​também. </li><li> Vortex vigorosamente para fazer a mistura ascensão e queda total de 3-4 vezes. Deixe o tubo de ficar parado por 3 min. </li><li> Anexar uma agulha calibre 16 blunt-end para uma seringa de 3 ml e elaborar 2,2 ml. Não elaborar grandes bolhas; expulsá-los no início, empurrando para fora um par de vezes. Empurrar para fora 1,1 ml cada em dois 30 prato não tratados mm e espalhar a mistura uniformemente girando. </li><li> Coloque placas duplicadas em um prato de 100 mm, juntamente com um prato de água contendo 3 ml de água estéril. Cultura para 14-17 dias. </li><li> Caracterizar e marcar as colônias de acordo com sua morfologia com um microscópio invertido com ampliação de 40x em uma placa de cultura com uma grelha de pontuação. Para efeitos do nosso ensaio, as colônias são classificadas em três categorias: eritróide pura, mielomonocítica e mistos. Veja as instruções do fabricante de subclassificação colônia mais. </li><li> A placa de ensaio inteiro CFC pode ser digitalizado sem ampliação usando um scanner regular em 600 dpi, e de baixa potência (40x) fotomicrografias das colônias podem ser tomadas através de um microscópio invertido equipado com uma câmera de cor. </li><li> Para posterior análise da diferenciação e proliferação, as células da placa inteira CFC ensaio são recuperados através da suspensão de vários volumes de temperatura ambiente 2% FBS / IMDM. Após centrifugação a 300 xg por 10 min a 4 ° C, as células são ressuspendidas em 2% FBS / IMDM, contados, e quer coradas com anticorpos por citometria de fluxo ou transferidos para slides usando uma centrífuga para Cytospin Giemsa. </li></ol> Coloração de anticorpos e citometria de fluxo <ol start="28"><li> Células Centrifugar a 200 xg por 8 min a 4 ° C e ressuspender em soro de rato frio 50% normal em HBSS (Ca e Mg-livre sem vermelho de fenol). </li><li> Coloque cerca de 5 x 10 5 células em 80 mL por tubo (12 x 75 mm de fundo redondo de tubos) e manter em gelo. Adicione a mistura de anticorpos (aproximadamente 20 mL mistura ou solução de controle negativo para anticorpos não-controles) e misturar batendo levemente os tubos. Prepare os tubos de controle de calibração sem anticorpos ou com um anticorpo anti-CD45 para cada fluorocromo. Colocar os tubos no gelo, no escuro e incubar por 20 minutos. Mix batendo levemente tubos após os primeiros 10 minutos. Após a incubação de 20 minutos, encher os tubos com HBSS fria e centrifugação a 200 xg por 8 min a 4 ° C. Ressuspender o sedimento em 0,5% paraformaldeído frio / HBSS. Seguintes misturas de anticorpos são normalmente utilizados para nossa análise. Para a diferenciação mielóide: CD11b (ficoeritrina conjugada clone ICRF44) / CD33 (allophycocyanin conjugada clone WM53) / CD45 (ficoeritrina-Cy7-congjugated clone HI30). Para a diferenciação eritróide: CD71 (ficoeritrina conjugada clone M-A712) / CD235a (allophycocyanin conjugada clone GA-R2) / CD45 (ficoeritrina-Cy7-congjugated clone HI30). </li><li> Citometria de fluxo é realizada no núcleo de alta velocidade Sorter Celular do J. Alvin Siteman Cancer Center, em Washington University School of Medicine em um citômetro de fluxo FACScan atualizado para 5 cores e dois lasers (BD Biosciences) e analisados ​​utilizando CellQuest (BD Biosciences) ou programa FlowJo v7.2.4 (Árvore Star, Inc., Ashland, OR, EUA) software. </li></ol> Giemsa <ol start="31"><li> Cerca de 30.000 células recuperado de placas CFC ensaio descrito acima são suspensas em 0,3 ml de 2% FBS / IMDM e transferidos para um slide usando uma centrífuga Cytospin a 1.000 rpm por 10 min em temperatura ambiente. </li><li> Configurar nove navios coloração contendo soluções na seguinte ordem. <ol><li> Metanol absoluto </li><li> Wright / Giemsa solução estoque </li><li> Wright / Giemsa tampão, pH 6,4 </li><li> Metanol 50% em H 2 O </li><li> H 2 O </li><li> H 2 O </li><li> Tampão fosfato, pH 6,0 </li><li> H 2 O </li><li> H 2 O </li></ol></li><li> Coloque os slides em uma transportadora de slide e mergulho em metanol absoluto (# 1) por 2 min e blot off metanol em excesso. </li><li> Imediatamente, mergulhe a transportadora de slides em Wright / Giemsa solução estoque (# 2) por 5 min. </li><li> Transferência do transportador em Wright / Giemsa, pH 6.4 (# 3) e incubar por 10 min. </li><li> Mergulhe a transportadora duas vezes em metanol a 50% (# 4), 10 vezes em H 2 O (# 5), mais 10 vezes em H 2 O (# 6), e depois 5 vezes em tampão fosfato, pH 6.0 (# 7) . </li><li> Transferência do transportador em H 2 O (# 8) e incubar por 2 min. Repita o lava-H 2 O (# 9). </li><li> Permitir que as lâminas ao ar secar completamente no suporte. Retire cada slide e limpe a parte de trás da lâmina com metanol embebido Kimwipes para remover manchas. Coloque uma gota de Cytoseal 60 e uma tampa de vidro para selar. </li><li> A contagem diferencial de 500 células é realizada para cada slide corados pelo Giemsa usando um microscópio Olympus BX51. As células são divididas em cinco categorias: células primitivas incluem explosões e promielócitos; células mielóides intermediária incluem mielócitos e metamielócitos; células mielóides maduras incluem bandas, neutrófilos segmentados, monócitos e macrófagos, células intermediárias eritróide incluem células com hemoglobinization intermediária e células maduras eritróide incluem células com hemoglobinization completo. Fotomicrografias são tomadas com uma câmera Olympus DP71 com um objetivo de petróleo 60x. </li></ol> 3.0) Os resultados representativos: <ol><li> Ensaio CFC: Alguns da população celular de entrada irão proliferar, diferenciar e formam colônias no meio semi-sólido durante o período de incubação de 14-17-dia. Neste experimento, é evidente que a expressão do oncogene NUP98-HOXA9 causou a formação de vermelho proeminente (eritróide colônias) (Figura 1) (3). </li><li> Coloração de anticorpos e citometria de fluxo: imunofenotipagem por citometria de fluxo de células coletadas de placas CFC ensaio fornece informações sobre o estado de diferenciação da população celular. Pelo uso combinado de anticorpos contra certos marcadores de diferenciação, a linhagem eo grau de maturação das células pode ser avaliado. Neste caso CD235a foi utilizado para identificar células eritróides. Conforme mostrado na Figura 2A, NUP98-HOXA9 causou um aumento da percentagem de células CD235a + eritróide, mas o brilho de expressão CD235a por estas células foi diminuído em comparação com controles, indicando inibição da maturação eritróide. Na Figura 2B, células mielóides são identificados em virtude de sua positividade CD33. NUP98-HOXA9 causou uma diminuição no número de células CD33 +, com uma diminuição no brilho da expressão CD11b, consistente com a inibição da maturação mielóide (3). Assim, os resultados mostram que a citometria de fluxo NUP98-HOXA9 causou uma hiperplasia eritróide com a inibição da maturação tanto mielóide e eritróide. </li><li> Coloração Giemsa: análise morfológica de células coletadas de placas CFC ensaio fornece informações sobre a linhagem eo grau de maturação da população celular. As conclusões obtidas morfologicamente podem diferir daqueles obtidos por estudos de citometria de fluxo e, portanto, estes métodos são complementares entre si (3). O experimento é repetido pelo menos 3 vezes, e cada vez que uma contagem diferencial de 500 células é realizada para distinguir cinco categorias de células, como descrito acima. Exemplos dessas células são apontados na Figura 3. Os resultados são tabulados e analisados, a fim de determinar se existem diferenças estatisticamente significativas entre o oncogene-transduzidas amostra e do controle. Neste caso, os resultados mostraram que NUP98-HOXA9 causou um aumento global do números de células, com hiperplasia eritróide e inibição de ambos os eritróide e maturação mielóide (3) (não mostrados). </li></ol> LEGENDS FIGURA <img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Os efeitos da NUP98-HOXA9 na morfologia CFC humana. Humanos primários células CD34 + foram retrovirally transduzidas com qualquer controle de vetores MSCV-IRES-GFP ou vetor expressando NUP98-HOXA9, e as células foram classificadas para a positividade GFP. Mil células foram semeadas em cada uma das duas placas duplicadas para ensaio de CFC eo experimento foi repetido 3 4 tempos independentes. Placas representante sem ampliação (à esquerda) e fotomicrografias de baixa potência do representante colônias eritróides (direita) são mostrados (3). <img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: A citometria de fluxo mostra interrupção do humano CD34 + principal diferenciação celular por NUP98-HOXA9. (A) A citometria de fluxo para a diferenciação eritróide: Células das placas CFC (ver Figura 1) foram colhidos e corados com anticorpos para CD45 e CD235a. O CD235a + portão foi plotado em um (painel direito) histograma para mostrar a expressão de CD235a relação às células controle (B) A citometria de fluxo para a diferenciação mielóide: Células das placas CFC foram colhidos e corados com CD45 e CD33. O CD33 + portão foi plotado em um histograma para mostrar expressão CD11b comparado ao grupo controle (painel direito). As porcentagens de células caindo dentro de cada porta são mostradas (3). <img src="/files/ftp_upload/2195/2195fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: A morfologia mostra rompimento de diferenciação por NUP98-HOXA9 relação ao controle de vetores. Manchas Cytospin foram preparados a partir de placas CFC e corados com Giemsa. Fotomicrografias foram tiradas de áreas representativas com um objetivo de petróleo 60x. B: explosão; MM: mielóides maduras, IM: intermediário mielóide, ME: eritróide maduro, IE: eritróide intermediária (3).

<ol><li>Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98-HOXA9+induces+long-term+proliferation+and+blocks+differentiation+of+primary+human+CD34%2B+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells.</a> Cancer Res. , 66-6628 (2006).</li>
<li>Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+NUP98-DDX10+oncogene+on+primary+human+CD34%2B+cells%3A+role+of+a+conserved+helicase+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif.</a> Leukemia. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+transformation+of+primary+human+hematopoietic+cells+by+the+oncogene+NUP98-HOXA9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9.</a> PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).</li>
<li>Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hematopoietic+colonies+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Haematol%22%5BJournal%5D)">Human hematopoietic colonies in health and disease.</a> Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).</li>
<li>Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+colony-forming+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic colony-forming cell assays.</a> Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).</li>
<li>Coulombel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%3A+strength+and+drawbacks+of+functional+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays.</a> Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).</li>
<li>Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection%2C+maintenance%2C+and+differentiation+of+primitive+human+hematopoietic+cells+in+cultures+containing+murine+fibroblasts+engineered+to+produce+human+steel+factor%2C+interleukin-3%2C+and+granulocyte+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor.</a> Blood. 88, 3765-3773 (1996).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O ensaio de CFC tem sido amplamente utilizado para determinar a proliferação e os padrões de diferenciação de células progenitoras hematopoéticas e estudar os efeitos dos oncogenes (4, 5). Tem a vantagem sobre culturas líquidas de ser um ensaio clonal, de tal forma que as colônias representam a progênie de um único progenitor e podem ser removidos individualmente para análise posterior. A limitação do ensaio CFC é que ele não é adequado para a detecção de células progenitoras imaturas ou mais células-tronco hematopoétic...

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440</td><td></td></tr><tr><td>SFB</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>06150</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (PS)</td><td>Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Ligante FLT-3</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>IL3</td><td>PeproTech Inc</td><td>200-03</td><td></td></tr><tr><td>IL6</td><td>PeproTech Inc</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>Albumina Sérica Bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Retronectina</td><td>Takara Bio Inc</td><td>T100A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Azul de Tripano (0,4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Methocult GF+ H4435</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>04445</td><td></td></tr><tr><td>Meio Enriquecido com Metilcelulose Humano</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>HSC005</td><td></td></tr><tr><td>Coloração de Wright/Giemsa</td><td>Harleco</td><td>64571</td><td></td></tr><tr><td>Solução Tampão Fosfato, pH 6,4 - fórmula Giordano</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>1450</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>8310</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Camundongo Normal</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>D208</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Humano CD11b conjugado com fito&amp;#8211;eritrina</td><td>BD Biosciences</td><td>555388</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Humano CD33 conjugado com aloficocianina</td><td>BD Biosciences</td><td>551378</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Humano CD45 conjugado com fito&amp;#8211;eritrina-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Humano CD71 conjugado com fito&amp;#8211;eritrina</td><td>BD Biosciences</td><td>555537</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Humano CD235a conjugado com aloficocianina</td><td>BD Biosciences</td><td>551336</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Humano CD45 conjugado com fito&amp;#8211;eritrina-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de 24 poços não tratadas</td><td>BD Biosciences</td><td>35-1147</td><td></td></tr><tr><td>Placa não tratada de 30 mm</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27150</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Placas com grade para contagem</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27500</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 15 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>35-2097</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>35-2070</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de 3 ml</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>Agulha romba de 16 gauge, 1&amp;frac12; polegada</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>28110</td><td></td></tr><tr><td>Filtro celular CellTrics de 50 &amp;mu;m</td><td>Partec</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>Câmaras de amostra TPX</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>A78710018</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas Microscópicas Fisherbrand Superfrost/Plus, Pré-limpas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cartões filtro Shandon</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>5991022</td><td></td></tr><tr><td>Suporte para lâminas Shandon Cytospin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>59920063</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto Completo de Coloração Shandon 100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>100</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Papel filtro de 1 &amp;mu;m</td><td>VWR international</td><td>28307-134</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Nikon Instruments</td><td>Diaphot</td><td></td></tr><tr><td>Câmera de microscópio</td><td>Nikon Instruments</td><td>DS-F11</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Câmera de microscópio</td><td>Olympus Corporation</td><td>DP71</td><td></td></tr><tr><td>Scanner</td><td>Microtek</td><td>Scanmaker 4</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de tecidos</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin</td><td>Shandon, Inc.</td><td>Cytospin 2</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada</td><td>Eppendorf</td><td>5810-R</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de purificação de água</td><td>Barnstead</td><td>Nanopure-Diamond</td><td></td></tr></tbody></table>

formadoras de colônias celular assay (cfc) para células hematopoiéticas humanas

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Humano-tronco hematopoiéticas / progenitoras células são normalmente obtidas da medula óssea, sangue do cordão umbilical ou sangue periférico e são usados ​​para estudar a hematopoiese e leukemogenesis. Eles têm a capacidade de se diferenciar em linhagens linfóide e mielóide. O ensaio de células formadoras de colônia (CFC) é utilizado para estudar o padrão de proliferação e diferenciação de células progenitoras hematopoéticas por sua capacidade de formar colônias em meio semi-sólido. O número ea morfologia das colônias formadas por um número fixo de células de entrada fornecer informações preliminares sobre a capacidade dos progenitores para se diferenciar e proliferar. As células podem ser colhidas a partir de colônias individuais ou de toda a placa para melhor avaliar os seus números e os estados de diferenciação por citometria de fluxo e avaliação morfológica de Giemsa-manchada slides. Este ensaio é útil para avaliar a diferenciação mielóide, mas não linfóides. O mielóide termo neste contexto é usada em seu sentido mais amplo para abranger linhagens granulocítica, monocítica, eritróide e megacariocítica. Temos utilizado neste ensaio para avaliar os efeitos de oncogenes na diferenciação de humanos primários células CD34 + derivadas do sangue periférico. Para este fim são as células transduzidas com qualquer construção de controle retroviral ou uma construção expressando o oncogene de interesse, neste caso NUP98-HOXA9. Nós empregamos um vetor retroviral comumente usados, MSCV-IRES-GFP, que expressa um mRNA bicistronic que produz o gene de interesse e um marcador GFP. Células são pré-ativado pelo crescimento na presença de citocinas por dois dias antes de transdução retroviral. Após mais dois dias, as células GFP + são isolados por fluorescência-activated cell sorting (FACS) e misturado com um meio de metilcelulose contendo semi-sólido suplementado com citocinas e incubados até colônias aparecem na superfície, geralmente 14 dias. O número e morfologia das colônias são documentados. Células são então removidas das placas, lavados, contados, e submetido a citometria de fluxo e análise morfológica. Citometria de fluxo com anticorpos específicos para os marcadores de superfície celular, expressas durante a hematopoiese fornece informações sobre a linhagem e maturação. Estudos morfológicos de células individuais sob um microscópio após Wright-Giemsa coloração fornecer informações adicionais em relação a linhagem e maturação. Comparação das células transduzidas com controle de vetores vazios aos transduzidas com um oncogene revela os efeitos do oncogene na diferenciação hematopoiética.

O ensaio de células formadoras de colônia (CFC) é um ensaio in vitro em que células progenitoras hematopoéticas formar colônias em meio semi-sólido. Uma combinação de morfologia da colônia, morfologia celular e citometria de fluxo são utilizados para avaliar a capacidade dos progenitores a proliferar e se diferenciar ao longo dos diferentes linhagens hematopoiéticas.

Formadoras de Colônias celular Assay (CFC) para células hematopoiéticas humanas

As células-tronco/progenitoras hematopoéticas humanas são geralmente obtidas da medula óssea, do sangue do cordão umbilical ou do sangue periférico e são utilizadas para estudar a hematopoese e...

Este procedimento avalia, em um meio semi-sólido, a capacidade dos progenitores hematopoiéticos de proliferar e se diferenciar ao longo de diferentes linhagens hematopoiéticas para iniciar o cultivo. Células positivas para CD34 recém-descongeladas são mantidas na presença de citocinas para promover a ativação após dois dias. Realize a transdução retroviral de uma construção teste que expressa GFP adicionando as células positivas para CD34 ativadas a uma placa previamente carregada com vírus.48 horas depois, isole as células GFP positivas por fax, em seguida plaque essas células em meio semissólido de metilcelulose suplementado com fatores de crescimento e incube por aproximadamente duas semanas até que colônias apareçam na superfície. Por fim, recolha as colônias, imobilize as células em lâminas utilizando citosina e contra-estaine com right giza para a determinação microscópica da linhagem hematopoética e estágio de maturação. Este método pode fornecer insights mecanicistas em estudos de leucemogênese, notadamente os efeitos de oncogenes na diferenciação hematopoética.Para observar uma cultura, descongele rapidamente um frasco de células congeladas positivas para CD34 a 37 graus Celsius, agitando suavemente até que reste apenas um pequeno cristal de gelo, e transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros. Enxágue suavemente as células remanescentes do frasco com um mililitro de meio F-B-S-I-M-D-M a 2% na temperatura ambiente e adicione-o gota a gota ao tubo de 50 mililitros, ao mesmo tempo em que o gira suavemente. Aguarde agora por três minutos.Continue adicionando lentamente dois mililitros de meio enquanto mistura suavemente e, novamente, equilibre por três minutos. Repita este procedimento de adicionar meio de volume igual à suspensão celular diluída em intervalos de três minutos, agitando suavemente entre as adições, até que o volume final atinja 32 mililitros. Para coletar as células, centrifugue a 250 G durante 10 minutos à temperatura ambiente e remova o sobrenadante, deixando cerca de 0,5 mililitro de meio acima do pellet. Prossiga com a lavagem das células uma vez, ressuspendendo o pellet em 20 mililitros de meio e centrifugando a 200 G durante oito minutos à temperatura ambiente. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em meio IMDM completo na concentração aproximada de meio milhão de células por mililitro.Por fim, para determinar a concentração celular, retire 10 microlitros da suspensão para um tubo microcêntrifuga e misture com o mesmo volume de solução de azul de tripano a 0,4% e realize a contagem. Utilizando um hemocitômetro, dilua as células até 10 à quinta potência de células por mililitro, adicionando meio IMDM completo suplementado com a mistura de citocinas ativadoras. Incube as células em um incubador umidificado a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por dois dias. No dia da transdução, conte as células antes de iniciar o pré-carregamento do vírus para determinar o número de poços a serem preparados, a fim de pré-revestir uma placa de cultura de tecidos de 24 poços não tratada. Adicione 400 microlitros de solução de retro-actina a 25 microgramas por mililitro a cada poço e incube por duas horas à temperatura ambiente em capela de fluxo laminar com biossegurança.Remova a solução retro-actina e bloquee cada poço com BSA 2% mediante incubação de 30 minutos à temperatura ambiente. Enquanto isso, descongele as soluções do estoque viral e armazene no gelo. Em seguida, aspire a solução de BSA, adicione o vírus adicionando 0,5 mililitro da preparação viral a cada poço e centrifugue a 2.200 ×g a quatro graus Celsius por 15 minutos.Remova a solução de vírus dos poços e repita a carga de vírus outras três vezes. Por fim, lave cada poço com meio IMDM frio. Agora, colete as células CD34 positivas pré-ativadas por centrifugação e re-suspenda as células em meio IMDM completo fresco suplementado com citocinas. Aliquote 0,15 milhões de células CD34 positivas em cada um dos poços codificados com vírus e incube em um incubador umidificado a 37 °C com 5% de dióxido de carbono por dois dias, a fim de coletar as células transduzidas de forma suave, mas completa.Suspenda as células das placas com vírus flutuantes e filtre a suspensão através de um filtro celular de 50 microns em um tubo cônico. Transfira 10 microlitros da suspensão celular para um tubo micro. Misture com volume igual de solução de azul de triano e conte as células utilizando um hemocitômetro.Lave cada poço com 0,8 mililitro de HBSS frio com 0,02% de EDTA e adicione ao mesmo tubo de coleta por meio de um filtro celular CEL Trix de 50 mícrons. Peliculize as células por centrifugação e lave uma vez com HBSS frio. Re suspenda o pellet celular final em HBSS com 1% de BSA e mantenha as células em gelo, no escuro, para posterior separação celular, que normalmente é realizada em uma instalação central de sorteador celular de alta velocidade, conforme o delineamento experimental.Descongele o número necessário de alíquotas do meio de ensaio CFC, agite vigorosamente para homogeneizar e deixe o tubo em repouso por pelo menos cinco minutos para que as bolhas subam à superfície antes de adicionar as células. Em seguida, transfira 3000 células ordenadas transduzidas por vírus para um tubo microcêntrico estéril contendo meio IMDM-F-B-S a 2% frio e ajuste o volume final da suspensão para 0,3 mililitros. Suspenda as células e transfira toda a suspensão celular para uma alíquota de três mililitros de meio de crescimento methylcult.Crie uma suspensão celular homogênea agitando vigorosamente no vórtex. Deixe o tubo em repouso por três minutos. Para semear as células, acople uma agulha romba de calibre 16 a uma seringa de três mililitros e aspire 2,2 mililitros.Tendo cuidado para evitar a aspiração de bolhas grandes, expelir 1,1 mililitro em cada um de dois recipientes de cultura tecidual não tratados de 30 milímetros e distribuir uniformemente a mistura girando o recipiente; posicionar as placas duplicadas em uma placa de 100 milímetros junto com um recipiente contendo água. Continuar com três litros de água estéril por duas semanas. Caracterizar e pontuar as colônias de acordo com sua morfologia utilizando um microscópio invertido com ampliação de 40 x em uma placa de cultura marcada com uma grade de pontuação.Para documentar os resultados do cultivo, escaneie toda a placa do ensaio CFC usando um scanner comum com resolução de 600 DPI e capture microfotografias em baixa ampliação de colônias representativas usando um microscópio invertido equipado com câmera colorida para análise adicional da diferenciação e proliferação. As células provenientes de toda a placa do ensaio CFC são recuperadas por suspensão em vários volumes de 2%F-B-S-I-M-D-M à temperatura ambiente, lavadas e contadas para análises morfológicas. Transfira 30.000 células recuperadas das placas do ensaio CFC para uma lâmina. Utilizando uma centrífuga STOs spin, seque as lâminas ao ar durante a noite para coloração eficiente das lâminas.Monte uma linha de montagem com nove recipientes de coloração contendo as soluções na seguinte ordem: metanol absoluto, solução estoque de azul de gema, tampão de azul de gema, metanol a 50% e água, dois recipientes com tampão fosfato de pH seis e, finalmente, dois recipientes com água. Coloque as lâminas em um porta-lâminas e mergulhe no metanol absoluto por dois minutos, removendo o excesso de metanol.Mergulhe imediatamente o porta-objetos no corante de Giemsa em solução estoque por cinco minutos. Transfira o porta-objetos para o tampão de Giemsa correto com pH 6,4 e incube por 10 minutos. Mergulhe o porta-objetos duas vezes em metanol a 50%, 10 vezes em água e outras 10 vezes em outro recipiente com água, e então cinco vezes em tampão fosfato.pH 6,0. Transfira o suporte para a água e incube por dois minutos. Repita a lavagem no último recipiente com água.Agora, deixe as lâminas secarem completamente no porta-lâminas. Retire cada lâmina e limpe o verso com lenços Kim embebidos em metanol para remover manchas. Coloque uma gota de cyto seal 60 e uma lamínula para selar.Realize uma contagem diferencial de 500 células para cada lâmina de GM mantida usando um microscópio. Para os propósitos deste experimento, as células são divididas em cinco categorias: células primitivas, células mieloides intermediárias, células mieloides maduras, células ertróides intermediárias e células ertróides maduras. Por exemplo, quando comparada à expressão controle dos novos 98 falcões, um oncogene nove aumentou a formação de colônias ertróides vermelhas.O impacto no mercado do oncogene é claramente evidente quando as colônias são observadas em baixa ampliação. Um exame morfológico adicional por GEM sustentado fornece informações sobre a linhagem e o grau de maturação da população celular. Neste exemplo, a introdução de novos 98 Hawks, um nove, causou um aumento geral no número de células com hiperplasia eritróide e inibição da maturação eritróide e mieloide.Este SA fornece informações sobre a diferenciação de células hematopoiéticas ao medir a capacidade de uma preparação celular de entrada de proliferar, diferenciar-se e formar colônias em um meio semissólido.

colony-forming-cell-cfc-assay-for-human-hematopoietic-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Endotelial colônia formando células progenitoras (ECFCs) são uma ferramenta promissora para o estudo da homeostase vascular e reparação.

Isolamento e expansão em grande escala de Adulto Humanos endotelial Colony Células Progenitoras Forming

Células endoteliais que formam colônias (ECFCs) estão circulando células endoteliais com potencial clonal proliferativa robusto que exibe...

Caracterização fenotípica e funcional das células endoteliais Formadoras de Colônias derivado do sangue do cordão umbilical humano

Este vídeo descreve o protocolo para unidade de formação de colônias à base de metilcelulose ou ensaio UFC, que ajuda a identificar e contar o número de colônias formadas por células leucêmicas em resposta ao tratamento com compostos anticancerígenos.

Ensaio de UFC à base de metilcelulose: um método para determinar o efeito de compostos anticancerígenos na formação de colônias em células leucêmicas

Este protocolo descreve a indução eficiente de endotélio hemogênico e progenitores hematopoiéticos multipotenciais a partir de células-tronco pluripotentes humanas por meio da expressão forçada de fatores de transcrição.

A indução direta de hegemônicos endotélio e sangue por sobre-expressão de fatores de transcrição na pluripotentes humanas Células-Tronco

Aqui, apresentamos pluripotentes humanas de protocolos de cultura de células-tronco (hPSC), usados para diferenciar hPSCs em CD34+ progenitores hematopoiéticos. Este método usa a manipulação de estágio específico de WNT canônico sinalização para especificar células exclusivamente para ambos o programa hematopoiética definitivo ou primitivo.

Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

Aqui, descrevemos os protocolos de validação genética e química de c-Fos e Dusp1 como um destino de droga em leucemia utilizando modelos in vitro e in vivo do mouse genética e humanizado. Esse método pode ser aplicado para qualquer destino para validação genética e desenvolvimento terapêutico.

Métodos para avaliar o papel de c-Fos e Dusp1 em dependência do Oncogene

Aqui, nós apresentamos um protocolo para formar precisamente o endotélio hemogenic das pilhas de haste pluripotentes humanas em uma condição do alimentador-e do Xeno-livre. Este método terá amplas aplicações na modelagem de doenças e triagem para compostos terapêuticos.

Diferenciação do endotélio hemogênico de células-tronco pluripotentes humanas em um alimentador-e condição definida livre de Xeno

Aqui descrevemos um método confiável para medir a massa mitocondrial e o potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas cultivadas ex vivo e células T.

Medição da massa mitocondrial e potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas e células T por citometria flow

Aqui, descrevemos um novo método citométrico de fluxo para isolamento prospectivo de progenitores eritróides de unidade formadora de explosão precoce (BFU-e) e eritróides de unidade formadora de colônias (UFC-e) diretamente da medula óssea e do baço frescos de camundongos. Este protocolo, desenvolvido com base em dados transcriptômicos de célula única, é o primeiro a isolar todos os progenitores eritróides do tecido com alta pureza.

Identificação e Isolamento de Progenitores Eritróides da Unidade Formadora de Explosão e da Unidade Formadora de Colônias de Tecido de Camundongo por Citometria de Fluxo

Apresentamos aqui uma técnica baseada em citometria de fluxo que permite medir simultaneamente o número de divisões celulares, o fenótipo celular de superfície e o parentesco celular. Essas propriedades podem ser testadas estatisticamente usando uma estrutura baseada em permutação.

Avaliação Simultânea de Parentesco, Número de Divisão e Fenótipo por Citometria de Fluxo para Células-Tronco Hematopoéticas e Progenitoras

Aprenda o ensaio de formação de colônias celulares (CFC) para avaliar a proliferação e diferenciação de células-tronco hematopoiéticas humanas CD34+ em meio semi-sólido. Este método permite estudar os efeitos de oncogenes na hematopoiese.

Formadoras de Colônias celular Assay (CFC) para células hematopoiéticas humanas

Explorar mais vídeos