Name: Determinação do Número celular durante Cultura Celular usando o contador de células Scepter (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-26T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprenda a usar o contador de células Scepter para contagem automatizada em cultura celular. Este método portátil oferece precisão superior à hemocitometria manual, reduzindo tempo e viés do usuário em experimentos de biologia celular.

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1. A Importância da contagem de células <ol><li> As células de contagem é um passo necessário, mas tedioso para in vitro de cultura de células. </li><li> Concentrações de células consistente garantir a reprodutibilidade e precisão experimental. </li><li> Contagem de células são importantes para a vigilância da saúde e taxa de proliferação celular, avaliando imortalização ou transformação, para posterior semeadura células experimentos de transfecção, ou infecção, e preparação para celular baseado em ensaios. </li><li> Apesar da necessidade de velocidade e precisão na contagem de células, 71% de 400 pesquisadores entrevistaram contagem de células utilizando um hemocitômetro. Enquanto hemocytometry é barato, é trabalhoso e sujeito a viés de usuário e uso indevido, o que resulta na contagem imprecisa. </li><li> Fontes de erro em hemocytometry incluem: distribuição desigual de células na amostra, muitas ou poucas células na amostra, decisões subjetivas quanto a saber se uma determinada célula cai dentro da área de contagem definido, a contaminação do hemocitômetro, de usuário para usuário variação , variação e da taxa de hemocitômetro de enchimento. </li><li> Para aliviar o tédio associado com a contagem manual, 29% dos pesquisadores contagem de células usando dispositivos de células automatizado de contagem. No entanto, para a maioria dos pesquisadores, o preço associado a essas grandes instrumentos de bancada é uma barreira à sua utilização. </li><li> O contador de células Scepter é um dispositivo automático de mão que oferece a automação e precisão de contagem Coulter, a um custo relativamente baixo. </li><li> O sistema emprega o princípio Coulter de impedância baseado em detecção de partículas em um formato miniaturizado usando uma combinação de hardware analógico e digital para a detecção, processamento de sinais, dados, armazenamento e visualização gráfica. </li><li> O sensor disponível é projetado para receber uma microfabricated, zona de células-sensing que possibilita a discriminação por tamanho de célula e do volume celular em sub-micron e sub-picoliter resolução. </li><li> Reforçada com precisão líquido de manipulação de canais e eletrônica, o contador de células Scepter graficamente exibe estatísticas de população de células como um histograma. </li></ol> 2. Preparação de uma suspensão de células isoladas de Contagem <ol><li> Para usar o contador de células Scepter, comece diluindo uma suspensão única célula de células, em tampão fosfato salino. A concentração de células por mL 10,000-500,000 é o ideal. </li><li> Transferir 100 mL de células diluída para um microtubo de 1,5 mL. </li></ol> 3. Realizar a contagem de células usando o Scepter <ol><li> Ligar o contador de células Scepter pressionando e segurando a alternância na parte de trás do instrumento e aguarde as instruções na tela para aparecer. </li><li> Quando solicitado, conecte um sensor para o fim da unidade Scepter com o painel de eletrodo sensor de virada para a frente do instrumento. </li><li> Sensores cetro consistem em uma câmara de amostragem precisamente modulada, com uma zona de sensoriamento eletrônico e integrado de células-sensing eletrodos. Os sensores permitem discriminar tamanho da célula em sub-micron, resolução e volume de células em sub-picoliter resolução. </li><li> Sensor de engenharia consistente, garante que os volumes de amostra igual são contados e as medições são feitas tamanho exato. </li><li> Uma vez que o sensor é conectado, executar cada passo do processo de contagem de acordo com as instruções na tela da seguinte forma: </li><li> Quando a tela lê "Mantenha o êmbolo para começar", o êmbolo. A tela, então, ler "submergir o sensor." Submergir o sensor na solução de suspensão de células e solte o êmbolo para aspirar a suspensão celular para o sensor. </li><li> O êmbolo age como um sinal elétrico e vai chamar a amostra mais o volume morto no sensor. A velocidade ou precisão de mergulhar não importa como faz com pipetagem. Este processo vai demorar vários segundos. Quando estiver pronto, o instrumento emite um sinal sonoro, e "Amostra carregado" será exibido na tela. </li><li> Uma vez que a amostra é carregado no sensor, ela é puxada através da zona de detecção para avaliar o tamanho das células e volume da célula e, em seguida pelos microcanais. Uma vez que 50 mL de amostra é contado o sensor diz ao instrumento para parar a contagem. </li><li> Após a contagem estiver concluída, a tela do instrumento irá ler "contagem completa. Por favor, remova o sensor e descarte." Siga o prompt, e remover e descartar o sensor. </li><li> O instrumento irá exibir um histograma de tamanho de célula ou de diâmetro em sua tela, bem como a concentração de células por ml. </li></ol> 4. Análise de Dados <ol><li> Após a contagem é completo eo histograma é mostrada no aparelho, aplicar portas pressionando o botão de alternância. Selecione "gating auto" ou "último uso" quer definir automaticamente o portão com base no perfil do histograma, ou para usar as portas a partir da contagem anterior. </li><li> Independentemente da seleção, os portões podem ser movidos manualmente para ajustar os dados. Pressione o botão alternar novamente para selecionar a porta a esquerda e para rolar aggle para mover o portão, como desejado. </li><li> Em seguida, pressione a alternar novamente para ativar a porta à direita e percorrer a alternar para colocar o portão certo. Clique novamente, uma nova célula de concentração, o volume celular médio e diâmetro será exibida. </li><li> A alternância também pode ser movido para qualquer lado para alternar a exibição entre data, hora, a média do tamanho das células, ea média do volume da célula. </li><li> Até 72 histogramas podem ser armazenados no próprio instrumento. Para carregar os dados para um computador pessoal, anexe o instrumento através da porta USB do cabo na tela. </li><li> No PC, clique duas vezes sobre a Aplicação de Software Scepter para o lançamento do software, em seguida, clique em "connect". Todas as acusações serão automaticamente porta para o software. </li><li> O Software Aplicativo Scepter mostra o histograma detalhando a distribuição da população da cultura em volume ou diâmetro. Arquivos baixados poderão ser exportados para o Microsoft Excel, onde os dados brutos serão exibidos em caixas de diâmetros célula especificada ou volumes de células. </li></ol> 5. Resultados representante <ol><li> Dezenove diferentes linhagens celulares foram preparados para contagem e concentrações de partida teóricos foram determinados utilizando um contador Coulter. Estas suspensões de células foram então diluída para obter suspensões de células em concentrações célula teórica. </li><li> O contador de células Scepter foi então usada para determinar as concentrações de células. A Figura 1 mostra cinco diluições que foram medidos para cinco linhagens de células representante junto com a concentração de células teórica. </li><li> O alto grau de linearidade, conforme indicado pelos valores R2, demonstra que a contagem Scepter é um método confiável para as linhagens celulares testadas, através de uma ampla faixa operacional linear. </li><li> A precisão global relativa de contagem Scepter é demonstrado na Figura 2, em que os dados obtidos da contagem Scepter são comparados com as contagens obtidas Contando Coulter. </li><li> O log da contagem de células Scepter é plotado contra o log da contagem de Coulter, e mostra que, em todas as linhagens, conta Scepter coincidir com contagem de Coulter. </li><li> Contagem de 19 linhas de células foram realizadas usando um Z2 Coulter Counter, o contador de células Scepter, um contador automático baseado em visão, como Vi-Cell ou sistema de incontáveis, e um hemocytemeter. </li><li> As contagens foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante, usando a mesma célula de partida de suspensão e diluição idênticos. Os resultados mostrados na Figura 3 demonstram que as concentrações de células medido pela contagem Scepter coincidem com concentrações de células teórica com alta linearidade. </li><li> O percentual de variação, ou CV, foi calculado para cada diluição de cada linha de células para cada sistema de contagem. A Figura 4 mostra os currículos% em média mais de 19 linhagens de células com respeito à concentração de células e método de contagem. </li><li> Dentro da faixa de operação, o contador de células Scepter é mais preciso do que a visão baseada contagem hemocitômetro, exibindo menores desvios-padrão e menores coeficientes médios de variação. </li><li> Contagem cetro é dez vezes mais rápido que hemocytometry e mais rápido que outros contadores automáticos também. Na Figura 5, Sf9, MCF7 e HEK293 células foram contadas utilizando os métodos descritos neste vídeo. </li><li> O tempo médio necessário para medir a concentração de células foi registrada. Note-se que hemocytometry foi realizada apenas uma vez por amostra. </li><li> Cetro faz medições com base no tamanho da célula. Assim, quaisquer alterações na morfologia celular podem ser capturados no histograma. Culturas saudáveis ​​exibir um belo sino distribuição de Gauss em forma, enquanto as células saudáveis, lyse, e causar uma mudança no histograma para a esquerda (Figura 6, painel esquerdo). </li><li> Da mesma forma, quando uma população de 50% de células mortas foram misturados com 50% de células vivas, as mudanças histograma também foram observados (Figura 6, painel direito). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig1.jpg" alt="Figura 1"><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig2.jpg" alt="Figura 2"><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig3.jpg" alt="Figura 3"><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig4.jpg" alt="Figura 4"><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig5.jpg" alt="Figura 5"><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig6.jpg" alt="Figura 6"><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig7.jpg" alt="Figura 7">

<ol><li>Barghshoon, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarghshoon%2C+S+%22Cell+Counting+Survey%22">Cell Counting Survey</a>. , Millipore. (2009).</li>
<li>Tucker, K. G., Chalder, S., al-Rubeai, M., Thomas, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+hybridoma+cell+number%2C+viability%2C+and+morphology+using+fully+automated+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+Microb+Technol%22%5BJournal%5D)">Measurement of hybridoma cell number, viability, and morphology using fully automated image analysis.</a> Enzyme Microb Technol. 16 (1), 29-35 (1994).</li>
<li>Houwen, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHouwen%2C+B+%22Fifty+years+of+hematology+innovation%3A+the+Coulter+principle%22">Fifty years of hematology innovation: the Coulter principle</a>. , Medical Laboratory Observer. (2003).</li>
</ol>

Kathleen Ongena, Chandreyee Das, Janet L. Smith, Sónia Gil, e Grace Johnston são empregados por Millipore, que produz os instrumentos utilizados neste artigo.

Comparando o desempenho do contador de células Scepter com resultados de outros métodos de contagem, podemos concluir que este novo handheld, contador de células automatizado oferece contagens de células precisa, rápida e confiável através de uma ampla faixa operacional. A funcionalidade de contagem Scepter é um resultado da tecnologia de engenharia de precisão embutido na ponta do sensor ea instrumentação sofisticada contagem baseada no princípio de Coulter. A qualidade de desempenho sugere Scepter contando como método para aumentar a velocidade e melhorar a reprodutibilidade de ensaios baseados em células. O formato handheld permite tédio rápida direita livre contagem na capa de cultura de células.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do material </td><td> Companhia </td><td> Número Catálogo </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> Cetro 2,0 contador de células automatizado Handheld com 40 sensores Scepter mM </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCC20040 </td><td></td></tr><tr><td> Cetro 2,0 contador de células automatizado Handheld com 60 sensores Scepter mM </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCC20060 </td><td></td></tr><tr><td> Sensores cetro, 60 mm </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCC60050 </td><td> Pacote de 50 de sensores </td></tr><tr><td> Sensores cetro, 40 mM </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCC40050 </td><td> Pacote de 50 de sensores </td></tr><tr><td> Universal Power Adapter </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCCPOWER </td><td> </td></tr><tr><td> Cetro de O-Ring Kit </td><td> EMD Millipore </td><td> PHCCOCLIP </td><td> 2 O-rings e uma tampa do filtro </td></tr></tbody></table>

determinação do número celular durante cultura celular usando o contador de células scepter

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Contagem de células é muitas vezes um passo necessário, mas tedioso para in vitro de cultura de células. Concentrações de células consistente garantir a reprodutibilidade e precisão experimental. Contagem de células são importantes para a vigilância da saúde e taxa de proliferação celular, avaliando imortalização ou transformação, para posterior semeadura células experimentos de transfecção, ou infecção, e preparação para celular baseado em ensaios. É importante que as contagens de células ser precisa, consistente e rápido, especialmente para medições quantitativas de respostas celulares. Apesar desta necessidade de rapidez e precisão na contagem de células, 71% de 400 pesquisadores entrevistaram uma contagem de células que usando um hemocitômetro. Enquanto hemocytometry é barato, é trabalhoso e sujeito a viés de usuário e uso indevido, o que resulta na contagem imprecisa. Hemocytometers são feitas de vidro óptico especial em que suspensões de células são carregados em volumes especificados e contadas sob um microscópio. Fontes de erros na hemocytometry incluem: distribuição desigual de células na amostra, muitas ou poucas células na amostra, decisões subjetivas quanto a saber se uma determinada célula cai dentro da área de contagem definido, a contaminação do hemocitômetro, de usuário para usuário variação e variação da taxa de enchimento hemocitômetro 2. Para aliviar o tédio associado com a contagem manual, 29% dos pesquisadores contagem de células usando células automatizado de contagem dispositivos, que incluem a visão baseada em contadores, sistemas que detectam as células usando o princípio Coulter, ou citometria de fluxo 1. Para a maioria dos pesquisadores, a principal barreira ao uso de um sistema automatizado é o preço associado a essas grandes instrumentos de bancada 1. O contador de células Scepter é um dispositivo automático de mão que oferece a automação e precisão de contagem Coulter, a um custo relativamente baixo. O sistema emprega o princípio Coulter de impedância baseado em detecção de partículas 3 em um formato miniaturizado usando uma combinação de hardware analógico e digital para a detecção, processamento de sinais, armazenamento de dados e visualização gráfica. A ponteira descartável é projetada com um microfabricated, zona de células-sensing que possibilita a discriminação por tamanho de célula e do volume celular em sub-micron e sub-picoliter resolução. Reforçada com precisão líquido de manipulação de canais e eletrônica, o contador de células Scepter relatórios de estatísticas de células população graficamente como um histograma.

O contador de células Scepter é um dispositivo portátil automático que pode ser usado para contagem de células, monitor de diâmetro celular e volume, e ser usado para verificar a saúde e qualidade de populações celulares de uma cultura para outra.

Determinação do Número celular durante Cultura Celular usando o contador de células Scepter

A contagem de células é frequentemente uma etapa necessária, porém tediosa, para a cultura celular in vitro. Concentrações celulares consistentes garantem a reprodutibilidade experimental e ...

O contador de células Scepter é um dispositivo automatizado portátil para contagem de células, monitoramento do diâmetro e volume celular e verificação da saúde e qualidade das populações celulares. Oferece vantagens significativas em comparação com outros métodos de contagem, incluindo maior precisão, facilidade de uso e baixo custo para contagem de células. Utilizando o Scepter, siga as instruções exibidas em sua tela gráfica para aspirar as células para dentro do sensor descartável.As células são então contadas e o dispositivo fornece as concentrações celulares e estatísticas, que podem ser enviadas para um computador e analisadas. Olá, eu sou a Sonya. Sou cientista pesquisadora aqui na Millport e hoje vou mostrar a vocês como usar o scepter.O contagem de células é uma etapa necessária, mas tediosa, no cultivo celular in vitro. Concentrações celulares consistentes garantem reprodutibilidade e precisão experimentais. A contagem de células é importante para monitorar a saúde celular e a taxa de proliferação, avaliar o plaqueamento de células imortais ou transformadas para experimentos subsequentes, transfeção ou infecção, e preparar ensaios baseados em células, apesar da necessidade de velocidade e precisão.No contagem celular, 71% dos 400 pesquisadores pesquisados realizam a contagem de células utilizando um hemocitômetro. Embora a hemocitometria seja econômica, ela é trabalhosa e está sujeita a viés e uso incorreto por parte do operador, o que resulta em contagens imprecisas. As fontes de erro na hemocitometria incluem distribuição desigual das células na amostra, bem como número excessivo ou insuficiente de células na amostra.Decisões subjetivas quanto a se uma determinada célula está dentro da área definida para contagem. Contaminação do hemocitômetro, variação entre usuários e variação na taxa de preenchimento do hemocitômetro para aliviar a tediosidade associada à contagem manual. 29% dos pesquisadores contam células utilizando dispositivos automatizados de contagem celular.No entanto, para a maioria dos pesquisadores, o preço associado a esses grandes instrumentos de bancada representa uma barreira para o seu uso. O contador de células Scepter é um dispositivo automático portátil que oferece a automação e a precisão da contagem Coulter a um custo relativamente baixo, em um formato fácil de usar e manual. O sistema utiliza o princípio Coulter de detecção de partículas por impedância em um formato miniaturizado, empregando uma combinação de hardware analógico e digital para processamento de sinal sensorial, armazenamento de dados e exibição gráfica.O sensor descartável é projetado com uma zona de detecção celular microfabricada que permite discriminação por tamanho e volume celular com resolução submicrométrica e subpicolitro, aprimorada por canais de manipulação precisa de líquidos e eletrônica. O contador de células Scepter exibe graficamente as estatísticas da população celular como um histograma para utilização. O contador de células Scepter inicia-se pela diluição de uma suspensão simples de células em solução salina tamponada com fosfato.Uma concentração de 10.000 a 500.000 células por mililitro é ideal. Transfira 100 microlitros de células diluídas para um tubo microview de 1,5 mililitro. Ligue o contador de células Scepter pressionando e segurando o botão na parte traseira do instrumento e aguarde até que as instruções na tela apareçam.Quando solicitado, fixe um sensor na extremidade da unidade do cetro com o painel sensor de eletrodo voltado para a frente do instrumento. Os sensores Scepter são compostos por uma câmara de amostragem moldada com precisão, com uma zona sensora eletrônica e eletrodos sensores de células integrados. Os sensores permitem discriminar o tamanho celular com resolução submicrométrica e o volume celular com resolução subpicolitro.A engenharia consistente do sensor garante que volumes iguais de amostra sejam contados e que medidas precisas de tamanho sejam realizadas. Uma vez que o sensor estiver acoplado, realize cada etapa do processo de contagem de acordo com as instruções exibidas na tela conforme a seguir. Quando a tela indicar, pressione e mantenha pressionado o êmbolo para começar a pressionar o êmbolo; a tela então exibirá "mergulhe o sensor", mergulhe o sensor na solução de suspensão celular e solte o êmbolo para aspirar a suspensão celular para dentro do sensor.O êmbolo atua como um sinal elétrico e irá aspirar a amostra juntamente com o volume morto para dentro do sensor. A velocidade ou precisão do movimento do êmbolo não é relevante, diferentemente do que ocorre com a pipetagem. Esse processo levará vários segundos até estar pronto.O instrumento emitirá um sinal sonoro e a amostra carregada será exibida na tela. Uma vez que a amostra é carregada no sensor, ela é aspirada através da zona de detecção para avaliar o tamanho e o volume celular. Em seguida, através dos microcanais, quando 50 microlitros da amostra forem contados, o sensor informa ao instrumento para interromper a contagem.Após a contagem ser concluída, a tela do instrumento exibirá "contagem concluída". Remova o sensor e descarte-o. Siga a instrução e remova e descarte o sensor.O instrumento exibirá então um histograma do tamanho ou diâmetro celular em sua tela, bem como a concentração de células por mililitro. Após a contagem ser concluída e o histograma ser exibido no instrumento, aplique as portas pressionando o botão de alternância, selecione o dimensionamento automático ou use a última opção para definir automaticamente a porta com base no perfil do histograma ou para utilizar as portas da contagem anterior. Independentemente da seleção, as portas podem ser movidas manualmente para ajuste fino.Ajuste os dados, pressione o botão de alternância novamente para selecionar o portão esquerdo e role o controle para mover o portão conforme desejado. Em seguida, pressione o botão de alternância novamente para ativar o portão direito e role o controle para posicionar o portão direito. Clique novamente.Uma nova concentração celular, volume celular médio e diâmetro serão exibidos. O botão alternador também pode ser movido para qualquer lado para alternar a exibição entre data e hora, tamanho médio de célula e volume celular médio; até 72 histogramas podem ser armazenados no próprio instrumento. Para carregar os dados em um computador pessoal, conecte o instrumento por meio da porta do cabo USB, na tela de exibição do computador.Dê um duplo clique no aplicativo de software scepter para iniciar o software. Em seguida, clique em conectar. Todas as contagens serão transferidas automaticamente para o software.O software de aplicação scepter exibe o histograma com detalhes sobre a distribuição populacional da cultura em volume ou diâmetro. Os arquivos baixados podem então ser exportados para o Microsoft Excel, onde os dados brutos serão exibidos em intervalos de diâmetros celulares ou volumes celulares especificados. Dezenove linhagens celulares diferentes foram preparadas para contagem e as concentrações iniciais teóricas foram determinadas usando o contador aculter.Essas suspensões celulares foram então diluídas adicionalmente para obter suspensões celulares com concentrações celulares teóricas. O contador de células Scepter foi então utilizado para determinar as concentrações celulares. Esta figura mostra cinco diluições que foram medidas para cinco linhagens celulares representativas juntamente com a concentração celular teórica.O alto grau de linearidade, indicado pelos valores de r-quadrado, demonstra que a contagem com o scepter é um método confiável para as linhagens celulares testadas em uma ampla faixa linear de operação. A precisão relativa geral da contagem com o scepter é demonstrada aqui, na qual os dados obtidos por meio da contagem com o scepter são comparados com as contagens obtidas pela contagem com o coter. O logaritmo das contagens celulares com o scepter é representado graficamente em função do logaritmo das contagens com o coter e mostra que, em todas as linhagens celulares testadas, as contagens com o scepter correspondem às contagens com o coter.As contagens de 19 linhagens celulares foram realizadas utilizando um contador Coulter Z two. O contador celular Scepter, um contador automatizado baseado em visão, como o sistema V cell ou count test, e as contagens de hemo TER foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante, utilizando a mesma suspensão inicial de células e diluições idênticas. Os resultados apresentados nesta figura demonstram que as concentrações celulares medidas pelo método de contagem com Scepter correspondem de perto às concentrações celulares teóricas, com alta linearidade.O coeficiente percentual de variação ou CV foi calculado para cada diluição de cada linhagem celular. Para cada sistema de contagem apresentado, são mostrados os CVs percentuais médios ao longo de 19 linhagens celulares em relação à concentração celular e ao método de contagem dentro da faixa de operação. O contador de células Scepter é mais preciso do que a contagem com hemocitômetro, apresentando desvios-padrão menores e coeficientes médios de variação menores.A contagem com o Scepter é 10 vezes mais rápida do que a hemocitometria e também mais rápida do que outros contadores automatizados. Aqui, as células SF nine, MCF seven e HC 2 93 foram contadas utilizando os métodos descritos neste vídeo. O tempo médio necessário para medir a concentração celular foi registrado.Observe que a hemocitometria foi realizada apenas uma vez por amostra. O Scepter realiza medições com base no tamanho celular. Assim, quaisquer alterações na morfologia celular podem ser capturadas no histograma.Culturas saudáveis exibem uma boa distribuição gaussiana em forma de sino, enquanto células não saudáveis morrem e causam um deslocamento do histograma para a esquerda. Da mesma forma, quando uma população de 50% de células mortas foi misturada com 50% de células vivas, também foram observados deslocamentos no histograma. Acabei de mostrar como usar o novo contador de células Scepter da Millipore, que está revolucionando a maneira como os pesquisadores contam suas células.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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