Name: Culturas de células primárias de Drosophila Os embriões Gástrula (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Aprenda a preparar células primárias dissociadas de embriões de Drosophila para análise de RNAi e imagem celular. Este método permite estudos funcionais em biologia celular e molecular com imunofluorescência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JB foi apoiado pelo Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship DRG-1716-1702. JZ foi apoiado pelo NIH / NIGMS Fellowship GM082174 F32-02. NP é um investigador do Instituto Médico Howard Hughes.

1. Preparação de gaiolas voar <ol><li> Crescer Drosophila (linhagens selvagens, como Oregon-R ou qualquer genótipo) em recipientes convenientes, tais como copos de 32 oz de insetos. </li><li> Transferência de moscas recém eclosed a grande colheita de embriões em gaiolas ou voar gaiolas população. </li><li> Mover as gaiolas em um quarto com uma temperatura de 25 ° C e umidade de 65% ~ em uma luz de 12 h, e um ciclo de 12 h escuro para facilitar a coleta de embriões síncrona. </li><li> Manter as moscas nas gaiolas, alimentando-os mortos colar fermento semeado em placas de melaço. Mudar as placas de melaço (com pasta de leveduras mortas) uma vez ao dia por 2-3 d. </li></ol> 2. Colheita de embriões síncrona <ol><li> No dia da primária de células, preparação alimentar as moscas wth placas revestidas com fermento fresco morto colar para um pré-lay h 1-2 período. </li><li> Pouco antes do ciclo de 12 h escuro, substitua as placas pré deitou com placas de melaço doce listradas com uma quantidade mínima de pasta de levedura. Descartar a coleção pré leigos, que contém assíncrona embriões mais velhos. </li><li> Coletar embriões por um período de 1-2 h. </li><li> Remova as placas contendo a população relativamente síncrona de embriões e armazenar a 25 ° C por 5-6 h. Embriões será no estádio de gástrula avançados neste momento. </li></ol> 3. Coleta e lavagem de embriões <ol><li> Solte os embriões das placas com um pincel molhado, e enxaguar abundantemente com água da torneira morna através de um conjunto de peneiras empilhadas, de modo que os embriões recolher na peneira de malha mais fina na parte inferior. Enxaguar por alguns minutos para remover o fermento e detritos voam muito possível. </li><li> Dica para as peneiras que os embriões se acumulam de um lado, e gentilmente lavá-las a partir da peneira para uma cesta dechorionation. </li><li> Mover para a área de cultura de tecidos capô, sem deixar que os embriões secar. </li></ol> 4. Homogeneização de embriões e revestimento de células <ol><li> Esterilizar e dechorionate os embriões por imersão em 50% (vol / vol) lixívia para 5-10 min. Enxágüe os embriões fora do muro da cesta com 70% (vol / vol) de etanol. Alternativamente, lave a lixívia off embriões com água destilada antes do tratamento de etanol. Deste ponto em diante os embriões devem ser tratados em condições estéreis e no capô cultura de tecidos. </li><li> Enxágüe os embriões completamente para remover a água sanitária e / ou etanol com água destilada autoclavada. </li><li> Durante a etapa de dechorionation, preencher um homogeneizador Dounce com o volume apropriado de meio ambiente M3 temperatura com base na quantidade de embriões. A relação entre o volume de embriões e de meios de comunicação não deve ser superior a 0,5 ml embriões: 40 ml de mídia (ou ~ 100-200 embriões / ml). </li><li> Coloque os embriões lavado num copo esterilizados com a quantidade de M3 media suficiente para submergir os embriões. Deixe o molho por 2-5 embriões min. </li><li> Desmonte da cesta dechorionation e blot a malha Nitex seco com toalhas de papel esterilizados. </li><li> Transferência dos embriões para o homogeneizador com um pincel esterilizados. </li><li> Homogeneizar suavemente com movimentos curtos usando um pilão solta sem atingir o fundo do tubo até que todos os embriões são suspensas. Em seguida, suavemente, mas firmemente, homogeneizar com oito golpes completo. Não torça o pilão como ele se move para cima e para baixo. </li><li> Transferir o homogeneizado em um tubo de centrifugação estéril de 50 ml cônico ou por derramamento ou pipetagem, ea tampa do tubo. </li><li> Centrifugar por 10 min a 40g, a temperatura ambiente até o pellet restos de tecido, pedaços grandes células e membranas vitelínico. Transferir o sobrenadante contendo as células e gema para um tubo limpo e repita os passos de centrifugação por 5 min. </li><li> Transferir cuidadosamente o sobrenadante por derramamento ou pipetando para um tubo limpo e gire por 10 minutos a 360g, temperatura ambiente, para sedimentar as células. Desprezar o sobrenadante. Ressuspender o pellet celular em 10 ml de meio de cultura (sem soro meio de experimentos RNAi). </li><li> Contagem de células viáveis ​​utilizando um hemocitômetro para estimar a densidade das células. Enquanto isso, repita o passo 4,10 para agregar as células. </li><li> Volte a suspender as células a uma concentração desejada. Para começar, tente um intervalo de 1 ~ 5 x10 6 células / ml e placa para fora em 1,7-2,5 x10 5 células / cm 2. </li></ol> 5. Primárias de células RNAi para células cultivadas em uma placa de 384 poços <ol><li> Dispense 5 mL de dsRNAs em cada poço a uma concentração final de ~ 250 ng por poço em uma placa de 384 poços. </li><li> Use uma pipeta multi-canal, dispensar 10 ml (1 ~ 4x106 células / ml) de pilhas por poço em meio M3 sem soro em uma placa de 384 poços contendo um dsRNA diferentes em cada poço. Alternativamente, as células podem ser cultivadas em 8 de bem-câmara de lâminas de vidro para imagens confocal. </li><li> Centrifugar as placas durante 1 min em 300g, temperatura ambiente. Cultura as células em meio livre de soro a 25 ° C por 22 h ou a 18 ° C por 1-2 d. </li><li> Adicionar 30 ml de soro contendo meio de cultura em cada poço. </li> Centrifugar as placas durante 1 min em 300g, temperatura ambiente. <li> Coloque as placas em câmara úmida e cultura as células primárias para um adicional de 5 ~ 7 d a 25 ° C. </li><li> Imagem das células ao vivo ou depois de imunofluorescência. </li></ol> 6. Resultados representativos: Em condições ideais, as células na cultura vai olhar saudável, com uma morfologia rodada. A cultura terá restos celulares pouco, e de 50 confluentes ~ 80% após o início do cultivo. Estas células sofrerão alterações morfológicas após ser cultivadas por um longo período de tempo. Ele normalmente leva cerca de 5-8 dias para as células na cultura a ser totalmente diferenciada, a 25 ° C. Culturas primárias de boa qualidade geralmente são julgadas por quão bem as células de interesse são diferenciados em cultura. Por exemplo, células musculares primárias muitas vezes têm uma morfologia ramo e tornar-se-like miotubos multinucleados com listra-like miofibrilas consistem de uma série de sarcômeros. Miotubos totalmente diferenciadas, normalmente de forma espontânea mover-se na cultura. Em contraste, diferenciada neurônios primários formam aglomerados com seus corpos celulares, e se conectar com outros clusters com cabos de seus axônios. <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Pilhas sofrer alterações morfológicas após ser banhado na cultura (A) A imagem de campo claro de pilhas direita depois de ser banhado em um poço de uma placa de 384 poços. A maioria das células são redondas e intacta e bem separados. (B) Uma imagem de campo claro da cultura de células primárias 20 horas após o plaqueamento. Pilhas já formam aglomerados (grande ponta de seta) e músculos com uma morfologia ramo-like (seta longa) pode ser reconhecida nesta fase. (C) Uma imagem de contraste de fase de cultura primária de cinco dias após o plaqueamento. A cultura parece muito mais avançada, com extensões neuronal (setas pequenas), clusters neuronal (setas grandes) e músculos (médias seta). <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Exemplos de pilhas tratadas com dsRNAs cultivadas em uma placa de 384 poços Pilhas foram isolados a partir da embriões portadores de Dmef2-Gal4, D42-Gal4, UAS-mito-GFP transgenes, em que Dmef2-Gal4 e D42-Gal4 expressão da unidade do mito-GFP nos músculos e neurônios motores, respectivamente. As células foram tratadas com dsRNAs segmentação tanto lacZ (AC) ou inflados (se) (DF). Ambos os músculos primários e de neurônios pode ser visto por GFP (A, C, D, F). As setas brancas apontam para as extensões neuronal. Faloidina coloração de actina (setas) revela uma estrutura muscular ramo, como na cultura tratada com lacZ dsRNAs (B e C), mas round-up morfologia muscular na cultura tratada com se dsRNAs (E e F). Nas imagens mescladas (C, F), os músculos estão manchadas amarelo, mas vermelho neurônios negativos mostra e suas extensões (setas brancas). <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Micrografias confocal de músculos primários cultivados em humanos vitronectina revestido slides tampa de vidro Músculos primários foram immunofluorescently corados com anti-Drosophila titina (KZ) (vermelho na mesclagem) e com phalloidin para actina (verde na mala direta). Os painéis de topo são o músculo controle do tipo selvagem e as de fundo são as cessões (CG31374) RNAi muscular com sarcômeros encurtado.

<ol><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Laboratory+culture+of+Drosophila%22">Laboratory culture of Drosophila</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).</li>
<li>Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+WH2-domain-containing+protein%2C+promotes+sarcomeric+actin+filament+elongation+from+pointed+ends+during+Drosophila+muscle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth.</a> Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).</li>
<li>Bai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+screening+in+Drosophila+primary+cells+for+genes+involved+in+muscle+assembly+and+maintenance+%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance .</a> Development. 135, 1439-1449 (2008).</li>
<li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PloS.+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li>
<li>Donady, J. J., Fyrberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+culturing+of+Drosophila+embryonic+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22TCA+Manual%22%5BJournal%5D)">Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro.</a> TCA Manual. 3, 685-687 (1977).</li>
<li>Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+neurons+and+myocytes+in+cell+cultures+made+from+Drosophila+gastrulae%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae.</a> Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).</li>
<li>Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+primary+cells+dissociated+from+gastrula+embryos+and+their+use+in+RNAi+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening.</a> Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O padrão de desenvolvimento de culturas primárias de células Drosophila pode variar muito, possivelmente devido a diversas variáveis ​​durante o processo primário de células de preparação. Primeiro de tudo, voa usado para postura de ovos devem ser jovens (dentro de uma semana de idade) e saudável (livre de infecção viral ou bacteriana). Embriões não fertilizados ou infectado devem ser evitados, já que são inúteis e células derivadas de embriões não os pode diferenciar e só vai sobreviver por 1-2 dias. Segundo, ...

<table><tbody><tr><td>Meio Shields e Sang M3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3652</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>JRH Biosciences</td><td>12103-500M</td><td></td></tr><tr><td>Insulina do pâncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>Gaiolas grandes para coleta de embriões</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-101</td><td></td></tr><tr><td>Peneira padrão americana #25</td><td>VWR international</td><td>57334-454</td><td></td></tr><tr><td>Peneira padrão americana #45</td><td>VWR international</td><td>57334-462</td><td></td></tr><tr><td>Peneira padrão americana #120</td><td>VWR international</td><td>57334-474</td><td></td></tr><tr><td>Moinho de tecidos Dounce, Wheaton 7 mL</td><td>VWR international</td><td>62400-620</td><td></td></tr><tr><td>Moinho de tecidos Dounce, Kontes 40 mL</td><td>VWR international</td><td>KT885300-0040</td><td></td></tr><tr><td>Moinho de tecidos Dounce, Kontes 40 mL</td><td>VWR international</td><td>KT885300-0100</td><td></td></tr><tr><td>Placa Costar de 384 poços</td><td>VWR international</td><td>29444-078</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de lamínula Lab-Tek II</td><td>Fisher Scientific</td><td>171080</td><td></td></tr></tbody></table>

culturas de células primárias de drosophila os embriões gástrula

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Aqui nós descrevemos um método para a preparação e a cultura de células primárias dissociada de embriões Drosophila gástrula. Em suma, uma grande quantidade de embriões de moscas encenado jovens e saudáveis ​​são recolhidos, esterilizados, e depois fisicamente dissociada em uma suspensão única célula usando um homogeneizador de vidro. Depois de ser semeadas em placas de cultura ou slides câmara em uma densidade adequada em meio de cultura, essas células podem diferenciar em vários tipos de células morfologicamente-distintas, que podem ser identificadas por seus marcadores celulares específicos. Além disso, apresentamos as condições para o tratamento destas células com fita dupla (ds) RNAs para provocar knockdown do gene. RNAi em células de Drosophila eficiente primário é realizado por simplesmente banhar as células do dsRNA contendo meio de cultura. A capacidade de realizar perturbação RNAi eficaz, juntamente com outros molecular, bioquímica, análises de imagens de células, permitirá uma série de perguntas a serem respondidas em células de Drosophila primária, especialmente aquelas relacionadas ao músculo diferenciadas e células neuronais.

Nós fornecemos um protocolo detalhado para preparar células primárias dissociada<em&gt; Drosophil</em&gt; A embriões. A capacidade de realizar a perturbação RNAi eficaz, juntamente com outros métodos de imagem molecular, bioquímica e celular permitirá que uma variedade de questões a serem abordadas na<em&gt; Drosophila</em&gt; Pilhas.

Culturas de células primárias de Drosophila Os embriões Gástrula

Aqui descrevemos um método para a preparação e o cultivo de células primárias dissociadas de embriões de gastrula de Drosophila. Em resumo, uma grande quantidade de ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como preparar células primárias dissociadas de embriões de drosófila para análise de RNAi e de imagem celular. Isso é realizado primeiramente preparando gaiolas para moscas. Em seguida, embriões sincrônicos são coletados, lavados e homogeneizados para dissociar as células.As células primárias são então semeadas e transfectadas com construtos de RNAi. Por fim, os resultados podem ser obtidos por meio de microscopia de imunofluorescência, que mostra os efeitos do RNAi sobre células primárias diferenciadas. Meu nome é Namo.Sou professor no Departamento de Genética da Harvard Medical School e pesquisador do Overuse Medical Institute. Hoje, eu, Jonathan, um pesquisador associado do laboratório, bem como ex-bolsista de pós-doutorado no laboratório, vamos apresentar a vocês a técnica de gerar células primárias a partir de embriões de oph ou de embriões. Essa técnica é importante por apresentar diversas aplicações na biologia celular e no desenvolvimento, e, em particular, como Janu demonstrou há alguns anos, a metodologia pode ser utilizada para telas genômicas amplas de IA em células musculares primárias.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a análise de linhagens celulares imortalizadas estabelecidas, é que a cultura primária de células reflete com maior precisão a biologia do organismo. Geralmente, os pesquisadores que adotam este método enfrentam dificuldades porque várias etapas não podem ser simplesmente aprendidas apenas pela leitura do procedimento. Para preparar a pasta de levedura morta, primeiro triture os grânulos de levedura viva em um pó fino usando um moedor de café, depois coloque-o em um béquer e submeta à autoclavação utilizando um ciclo seco de 20 minutos. Imediatamente após a autoclavação.Adicione água quente estéril suficiente ao fermento para formar uma pasta com a consistência de creme dental. Para preparar células primárias dissociadas de embriões de mosca, cultive uma linhagem selvagem de drosófila, como orgon R, em frascos frescos para moscas e transfira moscas recém-emergidas para gaiolas grandes de coleta de embriões ou gaiolas de população de moscas. Em seguida, para facilitar a coleta de embriões sincronizados, mova as gaiolas para uma sala com cerca de 25 graus Celsius e umidade de 65%, com ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuro, e alimente as moscas com ração morta.Pasta de levedura estriada em placas de melaço. Substitua as placas de alimento uma vez ao dia durante dois a três dias. No dia do preparo das células primárias, alimente as moscas com placas frescas por um período pré-oviposição de uma a duas horas.Imediatamente antes do ciclo escuro de 12 horas, substitua as placas pré-oviposição por placas frescas com melaço. Risque com uma quantidade mínima de pasta de levedura. Descarte a coleta pré-oviposição, que contém embriões mais velhos assíncronos.Colete embriões por um período de uma a duas horas. Remova as placas contendo a população relativamente sincronizada de embriões e armazene a 25 graus Celsius por cinco a seis horas. Neste momento, os embriões estarão no estágio de gástrula avançada para coleta de embriões.Após a incubação de cinco a seis horas, use um pincel úmido para soltá-los das placas. Em seguida, coloque-os em um conjunto de peneiras empilhadas e enxágue bem para remover o máximo possível de levedura e detritos de moscas. Deixe os embriões se acumularem na peneira inferior.Incline o peneira de modo que os embriões se acumulem em um dos lados e lave-os suavemente da peneira para um cesto de decoração. Em seguida, esterilize e recubra os embriões imergindo-os em água sanitária a 50% volume por volume durante cinco a 10 minutos enquanto os embriões incubam.Complete com homogeneizador à temperatura ambiente. M três meios médios para atingir um volume não superior a 0,5 mililitros de embriões por 40 mililitros de meio. Em seguida, lave os embriões da parede do cesto com etanol a 70% volume por volume.Usando água destilada autoclavada, lave bem os embriões para remover o alvejante e/ou etanol. Em seguida, mergulhe os embriões lavados no meio M three. Em um béquer esterilizado, deixe o embrião de molho por dois a cinco minutos enquanto os embriões incubam; desmonte o cesto de decoração e seque a malha NYX com toalhas de papel esterilizadas.Após os embriões terem ficado embebidos no meio M três, transfira-os para o homogeneizador com um pincel esterilizado, homogeneíze suavemente com movimentos curtos usando um pistilo solto e evite empurrá-lo até o fundo do tubo; quando todos os embriões estiverem suspensos, homogeneíze suave, porém firmemente, com oito movimentos completos. Não gire o pistilo enquanto ele se move para cima e para baixo. Transfira o homogenato para um tubo cônico estéril de centrífuga de 50 mililitros, despejando ou pipetando, e tampe o tubo para centrifugação por 10 minutos a 40 cheese à temperatura ambiente, a fim de obter um pellet dos detritos teciduais, agregados celulares grandes e membranas fatel.Transfira o sobrenadante contendo as células e a gema para um tubo limpo e repita a etapa de centrifugação por cinco minutos. Em seguida, transfira cuidadosamente o sobrenadante, por meio de decantação ou pipetagem, para um tubo limpo e centrifugue por 10 minutos a 360 Gs em temperatura ambiente para obter o pellet celular; descarte o sobrenadante. Re-suspenda o pellet celular em 10 mililitros de meio de cultura livre de soro para experimentos de RNAi.Para estimar a densidade celular, conte as células viáveis utilizando um hemocitômetro. Em seguida, centrifugue as células a 360 ×g. Re-suspenda as células em meio M3 sem soro a uma concentração de um a cinco vezes 10⁶ células por mililitro e plaque-as em 1,7 a 2,5 vezes 10⁵ células por centímetro quadrado em cada poço de uma placa de 384.Em uma placa de poços, distribua cinco microlitros de RNAs de fita dupla numa concentração final de cerca de 250 nanogramas por poço. Usando uma pipeta multicanal, distribua 10 microlitros de uma a quatro vezes 10 à sexta células por mililitro de células primárias em meio M três sem soro em cada poço de uma placa de 384 poços. Alternativamente, as células podem ser cultivadas em lâminas de câmara de vidro com oito poços para imagem confocal.Centrifugue as placas por um minuto a 300 Gs em temperatura ambiente. Incube as placas a 25 graus Celsius por 22 horas ou a 18 graus Celsius por um a dois dias. Adicione 30 microlitros adicionais de soro contendo meio de cultura M três a cada uma.Centrifugue bem as placas por um minuto a 300 Gs em temperatura ambiente. Incube as células primárias por mais cinco a sete dias a 25 graus Celsius em uma câmara úmida. Por fim, visualize as células vivas ou após coloração por imunofluorescência.Em condições ideais, as células e o cultivo apresentarão boa saúde. Com uma morfologia arredondada, o cultivo terá poucos detritos celulares e será de 50 a 80% confluente. Após o plaqueamento inicial, as células sofrerão mudanças morfológicas e estarão totalmente diferenciadas após cerca de cinco a oito dias em cultivo a 25 graus Celsius; esta imagem de campo claro mostra um exemplo de células primárias logo após o plaqueamento.A maioria das células é redonda, intacta e bem separada 20 horas após a semeadura. As células primárias já formam aglomerados e músculos com uma morfologia semelhante a ramificações podem ser reconhecidos nesta fase etária. Nesta fase, as imagens de contraste de células primárias cultivadas por cinco dias parecem muito mais avançadas, com extensões neuronais, aglomerados neuronais e músculos.Nesses exemplos, células primárias foram isoladas de embriões portadores dos transgenes DMF dois GAL quatro D 42 G quatro e UAS mito GFP, nos quais DMF dois G quatro e D 42 G quatro induzem a expressão de MIT GFP em músculos e neurônios motores, respectivamente. As células foram tratadas com RNAs de fita dupla direcionados contra LA C ou inflated. Esta imagem de fluorescência mostra tanto músculos primários diferenciados quanto neurônios que expressam GFP na cultura transfectada com RNAs de fita dupla controle direcionados contra LA C; a seta branca aponta para prolongamentos neuronais, enquanto a ponta da seta indica uma estrutura muscular semelhante a um ramo. Quando o músculo diferenciado é corado com Phin, mais da metade dos músculos apresenta uma estrutura ramificada, enquanto o restante exibe uma morfologia arredondada.No painel combinado, os músculos são corados em amarelo e as estruturas neuronais são coradas em verde. Esta imagem de fluorescência mostra tanto músculos primários diferenciados quanto neurônios que expressam GFP na cultura contendo RNAs de fita dupla direcionados ao gene inflated ou se a seta branca aponta para prolongamentos neuronais enquanto a ponta da seta aponta para o músculo quando visualizado com coloração phin. Diferentemente dos controles do tipo selvagem, que apresentam alguns músculos com aspecto ramificado, todos os músculos aqui estão arredondados nesta imagem combinada, sendo os músculos corados em amarelo enquanto as estruturas neuronais aparecem em verde.Observe que apenas uma morfologia muscular arredondada pode ser vista nesta cultura tratada com RNAs de fita dupla. Embora as extensões neuronais se assemelhem às dos controles do tipo selvagem, estas imagens mostram células musculares primárias marcadas fluorescentemente com anti-drosófila titan em vermelho e Phin que marca a actina em verde. Estes painéis mostram o músculo controle do tipo selvagem e estes representam o músculo tratado com RNAi, que se desenvolveu em músculos com sarcômeros encurtados.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de seguir o protocolo de forma consistente para obter resultados comparáveis entre seus experimentos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas a quatro horas, se executada corretamente.

primary-cell-cultures-from-drosophila-gastrula-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra a preparação de culturas primárias de neurônios do cérebro de final de estágio Drosophila pupas. Pontos de vista de culturas vivas mostram crescimento de neuritos e imagem dos níveis de cálcio usando Fura-2.

Culturas primárias neuronais do cérebro de Tarde Stage Drosophila pupas

Este vídeo demonstra a preparação de culturas primárias de neurônios a partir de embriões midgastrula estágio Drosophila. Pontos de vista de culturas vivas mostram as células de 1 hora após o plaqueamento e neurônios diferenciados após 2 dias de crescimento em um meio de bicarbonato baseado definido. Os neurônios são eletricamente excitáveis ​​e formam conexões sinápticas.

Preparação de culturas de neurônios a partir de embriões Midgastrula Stage Drosophila

A capacidade de células germinais embrionárias de se diferenciarem em células germinativas primordiais durante estágios iniciais de desenvolvimento é um modelo perfeito para abordar nossa hipótese sobre o câncer e infertilidade. Este protocolo mostra como isolar células germinativas primordiais das gônadas em desenvolvimento 10,5-11,5 dias após a embriões de camundongos coitum.

Isolamento e derivação de células embrionárias de rato Germinal

Células Drosophila S2 e neurônios cultivados são grandes sistemas para a imagem latente de transporte organela motorizado in vivo. Aqui nós descrevemos protocolos detalhados para o cultivo de ambos os tipos de células, a sua imagem e análise de transporte.

Transporte Organelle em Cultivadas Drosophila Células: Linha celular S2 e primário neurônios.

Este protocolo descreve a dissecção e o cultivo de testículos intactos e cistos germinativos de pupas de Drosophila melanogaster. Este método permite a observação microscópica da espermatogênese ex vivo. Além disso, descrevemos um ensaio farmacológico do efeito dos inibidores em estágios específicos do desenvolvimento de células germinativas em testículos de pupa.

Ex vivo Cultura de Drosophila Pupal Testículo e único macho da linha germinal Cistos: Dissection, Imaging, eo tratamento farmacológico

Aqui descrevemos um procedimento para capturar imagens ao vivo da gastrulação de Drosophila. Isso nos permitiu entender melhor a constrição apical envolvida no desenvolvimento inicial e analisar melhor os mecanismos que governam os movimentos celulares durante a modificação da estrutura do tecido.

Imagiologia de Alteração Forma celular e Movimento celular em Drosophila gastrulação Usando Reporter DE-caderina moscas transgénicas

Este trabalho descreve um protocolo para a geração de alta resolução em situ Hi-C bibliotecas de encenado firmemente pre-gastrulação Drosophila melanogaster embriões.

Geração de todo o genoma da cromatina conformação captura bibliotecas de firmemente encenado embriões adiantados da drosófila

Linhas de células de Drosophila são importantes reagentes para investigação fundamental e biomédica. Este artigo fornece protocolos para descongelar, repicagem e a criopreservação de linhas de células de Drosophila comumente usadas para auxiliar pesquisadores em incorporar o uso destes reagentes em suas pesquisas.

Descongelamento, cultivo e Cryopreserving linhas de células de Drosophila

Apresentado aqui é um protocolo para microinjetar e simultaneamente imaginar múltiplos embriões de Drosophila durante o desenvolvimento embrionário usando um imager de alto teor baseado em placas.

Preparação e microinjeção de embriões Drosophila para Microscopia de Células Vivas Realizadas usando um Analisador automatizado de alto teor

Aqui, fornecemos um protocolo de dissecção necessário para a imagem viva da gônada masculina Drosophila . Este protocolo permitirá a observação de processos celulares dinâmicos em condições normais ou após manipulação transgênica ou farmacológica.

Dissecção e Live-Imaging do Drosophila Gonad embrionário tardio

Um método de preservação a longo prazo para cepas de Drosophila como uma alternativa à transferência frequente de moscas adultas para frascos de alimentos frescos é altamente desejável. Este protocolo descreve a criopreservação de células germinativas primordiais de Drosophila e o renascimento de cepas através de seu transplante para embriões hospedeiros agaméticos.

Criopreservação de células germinativas primordiais e renascimento de cepas de Drosophila

Aprenda a preparar células primárias dissociadas de embriões de Drosophila para análise de RNAi e imagem celular. Este método permite estudos funcionais em biologia celular e molecular com imunofluorescência.

Culturas de células primárias de Drosophila Os embriões Gástrula

Explorar mais vídeos