Protocolo para Infecções Plasmodium falciparum em mosquitos e Infecção Determinação Fenótipo

Eu sou George Dimopoulos, do Instituto de Pesquisa da Malária da Escola de Saúde Pública Johns Hopkins, e agora mostraremos a você um procedimento sobre como infectar um mosquito terrivelmente gambiano com plasmodium faci e parasitas, e como determinar o fenótipo de infecção no mosquito Midgut. Para este procedimento, o equipamento básico necessário é uma incubadora de CO2 para a cultura do parasita. Alternativamente, se você não tiver uma incubadora de CO2, pode usar um frasco de vela.

Também precisamos de um insetário, é claro, equipamentos padrão de biologia molecular e biologia celular, como microscópios de dissecação, microscópios de luz. Precisamos de banhos-maria. Precisamos de um sistema de alimentação de membrana de mosquito e centrífugas.

Olá, meu nome é ISH e estou no laboratório do Dr.George Depos. Eu sou um pós-doutorado. Meu nome é Lindsay Garver e sou estudante de doutorado.

O primeiro passo da infecção plasmática é ter a cultura plasmática pronta. Se você não tem uma incubadora de dióxido de carbono, então você pode ter um pote de vela de vela onde você pode colocar a placa de seis poços, tendo o gato definir cultura, depois acender a vela e depois selar o frasco. O primeiro passo é ter o sangue humano, fresco e humano e soro e colocá-los a 37 em banho-maria primeiro para descongelar e também tê-los como quentes, porque você precisa de sangue realmente quente e soro quente.

Para preparar o sangue, você precisa alocar um animal do sangue humano fresco em uma extremidade. Sim, o sangue fresco deve ser girado a 2000 RPM por cinco minutos para descascá-lo pelos eritrócitos. Depois que a centrifugação termina, a sopa clara deve ser descartada e os pellets vermelhos, que são os RBC, precisam ser lavados três vezes em soro humano.

Adicionamos um volume igual de soro humano ao pellet, misturamos e giramos novamente a 2000 RPM por cinco minutos. Esta etapa é repetida três vezes. Finalmente, ter um grânulo vermelho pronto para ser adicionado à cultura ganote.

Ok, a cultura de plasmódio, que está na incubadora de CO2, tem que ser mantida em meio RPMA por 16 dias, e no dia 16, eles estão prontos para a infecção. Como estamos trabalhando com o plasmódio, cultura, deve-se ter cuidado em todas as etapas. O primeiro passo é que os parasitas devem ser cultivados em um laboratório BC dois e deve ser realizado em um capuz.

Todas as pontas de pipeta e todos os anexos devem ser descartados em uma caixa de risco biológico e quaisquer outras soluções devem ser como nosso pitman de tubo. Eles têm que ser lavados com alvejante a 10% e você tem que usar luvas. Jalecos da cultura do dia 16 precisam tirar uma pequena gota de sangue na lâmina de vidro, fazer um esfregaço e fazer contra uma mancha, e outra, o microscópio de luz.

Podemos determinar a porcentagem de GAMMAT a partir da cultura de gametócitos de 16 dias. Remova a maior parte da mídia tomando cuidado para não perturbar ou sugar parasitas, que é facilmente na parte inferior do, bem canalizá-lo o resto da mídia e parasitas. Misturar os parasitas nos glóbulos vermelhos em uma caneta dos parasitas, que está no apêndice, é então colocado em uma centrífuga para girar a 2000 RPM por cinco minutos.

Após a centrifugação, os parasitas irão pellet com os glóbulos vermelhos. O supino é o meio RPMI e, na parte inferior, o pellet contém os parasitas. Com o RBC, remova a sopa, que é o RPMI.

Deve-se tomar cuidado para não perturbar o parasita e os glóbulos vermelhos. A porcentagem de GATT, que é determinada pelos GIMs 10, geralmente está na faixa de dois a 4% Então, quando os glóbulos vermelhos e os parasitas estão prontos após a centrifugação, eles são misturados e o volume de sangue que precisa ser adicionado é determinado pela porcentagem final de GOT. Precisa ser agudo e geralmente está na faixa de 0,3 a 1% e é isso que será usado para a alimentação dos mosquitos phys.

Para a infecção do Presidium S, este é um alimentador de vidro, que usamos para a alimentação por membrana para os mosquitos. Colocamos o sangue dentro através do pequeno orifício que você vê, e ele está contido nele. Na parte inferior do lado estão dois bicos, que estão conectados ao nosso parto na água, que é mencionado a 37 graus.

Para preparar o comedouro para a alimentação, pegamos um pequeno pedaço de affil. Esticamos das duas extremidades de todos os quatro lados e, em seguida, colocamos isso no lado aberto do alimentador de vidro para fazer uma fina folha de membrana para imitar a pele. Isso é o que é chamado de alimentação por membrana.

Este é um banho-maria circulante, que mantém a água em 37 e também circula a água através do alimentador de vidro para que o sangue seja mantido aquecido em 37. Então, conectamos o alimentador de vidro através dos pequenos capilares e o conectamos ao banho-maria circulante e ligamos o banho-maria para que a água circule e a água e o sangue nunca se misturem, pois estão em duas câmaras separadas. Este é um pequeno copo contendo os mosquitos phis Gambi.

Para começar, o alimentador de vidro é colocado na gaiola e um peso é colocado no alimentador de vidro para que a membrana, que é o phim, fique nivelada com a rede de malha. Cerca de 200 microlitros de sangue, que contém os parasitas. Com a porcentagem de gambotto necessária, são adicionados ao comedouro, certificando-se de que o sangue desça até o fim e os mosquitos possam ter acesso ao sangue.

A montagem é continuada por cerca de 30 minutos. Uma vez que o encaixe é concluído, o alimentador de vidro é lavado completamente em 10, em 10% de alvejante, e o resto das membranas e fita adesiva a cada apêndice, eles são descartados em uma caixa de risco biológico. Após a colocação do sangue, os mosquitos impróprios devem ser removidos dos mosquitos alimentados.

Para fazer isso, batemos nos mosquitos colocando os pequenos copos contendo os mosquitos alimentados com sangue na câmara fria por cinco a 10 minutos. Como podemos ver, os mosquitos já estão caídos no frio. Abrimos a tampa e transferimos os mosquitos para um pequeno prato de petróleo, que é mantido em um balde de gelo para que os mosquitos fiquem frios o tempo todo e não possam escapar.

Lembre-se, estes são mosquitos infectados por plasmódio, portanto, todo cuidado deve ser tomado para não deixá-los soltos. Uma vez que os mosquitos estão caídos na câmara fria, transferimos os mosquitos para o setor normal, que é manter à temperatura ambiente, mas colocamos os mosquitos sempre no prato de gasolina, que é mantido no balde de gelo, para que eles fiquem lá para que estejam sempre caídos. Você pode ver como os mosquitos Fed podem ser removidos dos UNFI.

Os Fed têm sangue neles. Eles estão totalmente ingurgitados. Alguns deles se alimentaram parcialmente de sangue, então não estão totalmente ingurgitados.

Eles têm um pequeno sangue no abdômen, mas outros têm muito sangue no abdômen. Os UNFI não têm sangue no abdômen e, portanto, você pode facilmente distinguir entre os Fed e os inaptos. Mostrado. Aqui estão os mosquitos fêmeas adultas que são alimentados com sangue, então vamos transferir esses mosquitos da placa de petróleo para os copos de papelão da linha de cera.

Depois de colocar os mosquitos alimentados com sangue nos copos, colocamos um pequeno pedaço de algodão embebido em 10% de sacarose para que eles possam se alimentar dos 10% de sacarose pelos próximos sete dias que você vai incubar e também colocamos uma pequena toalha de pimenta dobrada, para colocar a umidade dentro do copo e coberto com um prato de gasolina. Os mosquitos infectados com plasmon são colocados em outra gaiola pequena, por isso tem que ter uma proteção dupla e colocará a gaiola em um laboratório de três contas, que é mantido a 27 graus Rogate e 80% de umidade sete dias após a alimentação do sangue. Os mosquitos, que foram mantidos no setor interno, na caixa de gaiola dupla, são retirados do setor e levados para a câmara fria para derrubar os mosquitos.

Depois que os mosquitos são mortos, eles são transferidos para uma placa de petróleo, que é mantida em um balde de gelo. Agora estamos nos preparando para dissecar os mosquitos. Vamos dissecar o intestino médio e procurar o cisto.

O primeiro passo é adicionar cem microlitros de PBS em uma lâmina de vidro montada em um microscópio de dissecação. O próximo passo é usar uma pinça do autor. Transferimos um único mosquito da placa petro para o PBS, que está na lâmina de vidro montada no microscópio de dissecação.

Os outros ainda são deixados na placa de petro gelada. Para dissecar os mosquitos, segure-os no tórax com um dos fps e no abdômen posterior com outro fp. Em seguida, puxe a parte do corpo lentamente até que o intestino médio fique exposto.

Parece um saco branco, como o corpo usa uma pinça para remover o excesso de tecido e as outras partes do corpo. Sim, este é o intestino médio, que se parece com um corpo semelhante a um saco branco, que tem o OS. Vamos transferir esse intestino médio agora para uma luz de vidro de 12 poços e mergulhar em um microlitro de cinco a 10 microlitros de 0,2% micro pro, que suportará o intestino médio para recuperar a lâmina.

Com a lamínula, fazemos esta etapa para todos os mosquitos infectados. O intestino parece um rosa brilhante e transferiremos esta lâmina para um microscópio de luz Para contar a carga do sistema operacional. Agora estamos olhando para o Midgut dissecado dos mosquitos infectados.

O intestino médio parece um corpo semelhante e com a mancha rom, eles têm uma cor rosada muito leve, e o O SST deve ter um rosa brilhante contra o tecido intestinal rosa fraco. Esses intestinos médios, porém, são dos mosquitos infectados, mas não apresentam nenhum sst, então podem não estar infectados. Mas se um intestino médio tivesse sido infectado, o S teria aparecido como um pequeno círculo rosa brilhante, e pode haver vários atrasos entre 22.500, às vezes dentro de um único intestino médio.

Este procedimento envolveu infectar sangue humano com parasitas de rum plasmodium, alimentar os mosquitos da Gâmbia com esse sangue infectado, dissecar o intestino médio desses mosquitos e determinar as contagens de OSIS dentro do intestino médio infectado. Essa técnica é importante porque é a maior aproximação da transmissão da malária humana que podemos replicar em laboratório.