Name: Protocolo para Infecções Plasmodium falciparum em mosquitos e Infecção Determinação Fenótipo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Aprenda a infectar mosquitos Anopheles gambiae com Plasmodium falciparum usando alimentação por membrana e culturas de gametócitos. Este protocolo permite avaliar fenótipos de infecção no intestino médio para pesquisa em malária.

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A. Preparação da cultura gametócitos: <ol><li> Trazem o sangue humano fresco e soro a 37 o C em banho-maria. </li><li> Em uma capela, sob condições estéreis, pipeta de 1 mL de sangue quente em um tubo eppendorf. Girar o sangue em uma centrífuga por 5 minutos a 2200 rpm. Eritrócitos deve ser peletizada, remover e descartar o soro claro. Lavar eritrócitos com um volume igual de novo soro 3 vezes para obter o sangue total para a gametócitos. </li><li> Recuperar a cultura gametócitos do CO 2 incubadora ou palmatória. Essa cultura deve ser mantida em RPMI mídia e alimentado para os mosquitos no dia 16 da cultura. Para determinar o gametocytemia% (no dia 16 de cultura) fazer um esfregaço fino sobre uma lâmina de vidro com uma gota de sangue e realizar uma Geimsa mancha. Determinar o número de gametas em um campo da cultura parasita. Geralmente é na faixa de 2-4%. Calcular o volume de sangue total que você vai precisar para alcançar o final desejado gametocytemia% (0,3 -1%). </li><li> Remover a maioria dos meios de comunicação de sua cultura gametócitos usando uma pipeta, tomando cuidado para não perturbar ou sugar os parasitas (parasitas aparecerá como preto, enquanto a mídia vai ser rosa claro / vermelho). Pipeta o resto da mídia e parasitas em um tubo falcon 15 ml. Girar em uma centrífuga por 5 minutos a 2200 rpm. Parasitas e eritrócitos vai pellet, remover e descartar media sobrenadante sem perturbar parasitas. </li><li> Combine parasitas com o volume de sangue total preparadas (de A2 etapa) dar-lhe a gametocytemia final desejada de acordo com os cálculos anteriores. Pipeta para misturar bem. (~ 1 minuto) </li></ol> Este é agora o exemplo que você vai alimentar a sua mosquitos. Manter a 37 º C em banho-maria. Alimentação mosquitos B.: <ol><li> Ponha seu mosquitos Anopheles (~ 30-50) em copos de cera revestido de papelão coberto com malha de redes garantidos por uma faixa de borracha ou tampa de papelão fornecido com copo. Nós usamos um aspirador a pilhas para esta etapa. </li><li> Prepare o banho-maria a circulação através da inserção de bicos em cada lado de alimentadores de vidro para tubos de borracha. Conectar como alimentadores quantas forem necessárias em uma série, um fim da série deve ser conectado por tubulação para o circulador do banho de água (a parte que empurra a água através do feeders), a outra extremidade da série deve ser composto de tubos de borracha submerso no banho para que a água distribuída aos vazios de volta para banho. Ligue o banho até que a água é de cerca de 37 º C ea água está a circular através do alimentadores e de volta para o banho. Isto é essencial para manter o aquecimento de sangue e manter os parasitas vivos. </li><li> Prepare a membrana (usamos pequenos quadrados de parafilme esticado) esticando todo o alimentador de membrana de vidro, usando a pressão para selar firmemente a abertura do alimentador. Esta membrana vai imitar a pele. </li><li> Coloque um alimentador da membrana voltada para baixo em cada copo mosquito e alimentadores seguro usando grampos ou fita adesiva. A membrana deve sentar-se alinhada com a rede para os mosquitos podem acessá-lo de dentro do copo. </li><li> Cuidadosamente pipeta refeição parasita sangue (de A5 passo) para o pescoço do alimentador, certificando-se o sangue vai todo o caminho através do pescoço para dentro do reservatório, entrar em contato com a membrana de modo que o mosquito pode acessar o sangue. Usamos cerca de 200 mL de sangue por alimentador, mas isso pode variar. </li><li> Permitir que mosquitos para se alimentar. Nós lhes permitem alimentar para ≈ 30 minutos (variável, dependendo theexperiment; para a maioria dos experimentos, ocasionalmente monitoramento quantos já tomaram uma refeição por olhar para o conteúdo sangüíneo no abdômen.) </li><li> Após a alimentação, retire copos alimentadores do mosquito. Desligue o banho de água e desconecte alimentadores de tubos. </li><li> Remover a membrana e mergulhe alimentadores em lixívia a 10% para descontaminar e enxágüe com água. Lugar material contaminado (membranas, toalhas de papel, luvas, etc) em um pequeno saco de risco biológico e depósito em um recipiente grande risco biológico. </li><li> Anestesiar os mosquitos colocando copos na geladeira ou câmara fria. Uma vez que os mosquitos estão totalmente anestesiados, transferi-los em uma placa de Petri incorporado em um balde de gelo. Ordenar mosquitos, olhando atentamente para o abdômen para qualquer sinal de uma refeição de sangue, e descartar aqueles que não alimentam. Alguns mosquitos será totalmente ingurgitadas, enquanto outros mostram uma estreita faixa de sangue ingerido, todos são aceitáveis ​​como &quot;alimentados&quot;. Coloque os mosquitos alimentado de volta para os copos de papelão. </li><li> Fornecer uma refeição de açúcar (um pedaço de algodão embebido em sacarose 10%) para os mosquitos, e incubar em condições normais de insetário durante 7 dias. Todos os dias, os mosquitos devem ser monitorados para a taxa de mortalidade. Além disso, o algodão deve ser molhado com a sacarose, para que eles não são privados de alimentos. É melhor, mas, para adicionar uma toalha de papel embebido em água destilada, para manter os mosquitos úmido. Esses mosquitos são P. falcipraum infectados, para que todos os cuidados devem ser tomados para que não os mosquitos podem ESCAPe do copo. É melhor colocar os copos em uma proteção cagefor pequena dupla. </li></ol> C. Dissecting intestino médio do mosquito e estimar as cargas de oocistos: <ol style="margin-top: 0in"><li style="tab-stops: list .5in"> Aspirar mosquitos (da etapa B) de copos de papelão usando um aspirador a pilhas. Anestesiar os mosquitos, que estão dentro do reservatório aspirador removível, mudando-se para uma sala fria ou enterrar o reservatório no gelo por pelo menos 5 minutos ou até que os mosquitos parar de se mover. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Transferência de mosquitos anestesiados do reservatório para uma placa de Petri de vidro embebidas em gelo. Espalhe os mosquitos em uma única camada e cubra com uma tampa de plástico placa de Petri. Mosquitos que não podem ser acomodados no prato permanecer no reservatório, que é retornado ao quarto frio ou gelo. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Usando uma pinça de ponta fina, a transferência de um único mosquito do prato para 100 ul PBS contidos em uma lâmina de vidro montada em um microscópio de dissecação. Deixe os outros coberta na placa de Petri refrigeradas. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Usando uma pinça de ponta fina, manter os mosquitos no tórax e do abdome posterior. Puxar o corpo para além até o intestino médio está exposto. Use uma pinça para remover o excesso de tecido do intestino gut.The se parece com um branco, saco-como corpo. Retire o excesso de tecido do intestino gut.Mount em um poço de uma lâmina de vidro de 12 bem e mergulhe em mL 10/05 de 0,2% mercurocromo. Squash a carcaça e descartar em towel.Continue papel úmido para outros mosquitos até o slide 12 bem-estar cheio. Cobrir a coragem montado com uma lamela de vidro. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Examine coragem em microscópio de luz, à procura de oocistos redonda que mancha rosa brilhante contra o tecido do intestino clara / rosada. Contagem de oocistos, e continuar a gravar a próxima amostra. Continue para todos os mosquitos de todos os tratamentos experimentais. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Quando terminar, limpe lâmina limpa com uma toalha de papel. Coloque a toalha de papel com coragem, e toalha de papel com carcaças, em saco de biohazard pequeno e descartar no lixo. As luvas são usadas durante todo o processo. Cuidado é tomado para não deixar escapar mosquitos infectados. </li></ol>

<ol><li>Avila, S. L., Ferreira, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+diagnosis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Malaria diagnosis: a review.</a> Braz J Med Biol Res. 29 (4), 431-443 (1996).</li>
<li>Bell, A. S., Ranford-Cartwright, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+PCR+assay+for+quantifying+Plasmodium+falciparum+infections+in+the+mosquito+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A real-time PCR assay for quantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector.</a> Int J Parasitol. 34 (7), 795-802 (2004).</li>
<li>Collins, K. M., Hochberg, L. P., Ryan, P. R., Collins, W. E., Wirtz, R. A., Ryan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Plasmodium+malariae+infection+in+mosquito+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Trop+Med+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Quantification of Plasmodium malariae infection in mosquito vectors.</a> Ann Trop Med Parasitol. 98 (5), 469-472 (2004).</li>
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<li>Haghdoost, A. A., Mazhari, S., Bahadini, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+results+of+light+microscopy+with+the+results+of+PCR+method+in+the+diagnosis+of+Plasmodium+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vector+Borne+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparing the results of light microscopy with the results of PCR method in the diagnosis of Plasmodium vivax.</a> J Vector Borne Dis. 43 (2), 53-57 (2006).</li>
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<li>Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Plasmodium+and+Anopheles+transcriptomes+during+oocyst+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation.</a> J Biol Chem. 279 (7), 5581-5587 (2004).</li>
</ol>

Pode haver algumas variações na infecção de Plasmodium e determinação fenótipo infecção e laboratórios diferentes podem seguir diferentes técnicas.

protocolo para infecções plasmodium falciparum em mosquitos e infecção determinação fenótipo

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

Uma vez que um gene é identificada como potencialmente refratário para a malária, deve ser avaliado pelo seu papel na prevenção de infecções Plasmodium dentro do mosquito. Este protocolo ilustra como a extensão de infecções plasmodium de mosquitos podem ser ensaiadas. As técnicas de preparação da cultura gametócitos, membrana alimentarem de sangue humano os mosquitos, e assaying títulos viral no intestino médio do mosquito são demonstradas.

Protocolo para Infecções Plasmodium falciparum em mosquitos e Infecção Determinação Fenótipo

Uma vez que um gene seja identificado como potencialmente refratário à malária, ele deve ser avaliado quanto ao seu papel na prevenção de infecções por Plasmodium dentro do...

Sou George Dimopoulos, do Instituto de Pesquisa sobre Malária da Escola de Saúde Pública Johns Hopkins, e agora vamos mostrar um procedimento para infectar mosquitos Anopheles gambiae com parasitas Plasmodium falciparum e como determinar o fenótipo de infecção no intestino médio do mosquito. Para este procedimento, os equipamentos básicos necessários são: um incubador de CO2 para o cultivo do parasita. Alternativamente, caso não haja um incubador de CO2, pode-se usar um frasco com vela.Também precisamos de um insetário, é claro, e de equipamentos padrão de biologia molecular e biologia celular, como microscópios de dissecação e microscópios ópticos. Precisamos de banhos-maria. Precisamos de um sistema de alimentação por membrana para mosquitos e centrífugas.Olá, meu nome é ISH e estou no laboratório do Dr. George Depos. Sou pós-doutoranda. Meu nome é Lindsay Garver e sou estudante de doutorado.O primeiro passo da infecção por plasmídeo é ter o cultivo de plasmídeo pronto. Se você não tiver uma estufa de dióxido de carbono, pode usar um frasco com vela, onde você coloca a placa de seis poços contendo o cultivo de células gato, acende a vela e, em seguida, fecha o frasco. O primeiro passo é obter sangue humano fresco e soro humano e colocá-los a 37 °C em banho-maria primeiro para descongelar e também para aquecê-los, pois é necessário sangue e soro bem quentes.Para preparar o sangue, é necessário coletar de um animal uma amostra de sangue humano fresco em um tubo eppendorf. Sim, o sangue fresco deve ser centrifugado a 2000 RPM durante cinco minutos para sedimentar os eritrócitos. Após a centrifugação, o sobrenadante claro deve ser descartado e os pellets vermelhos, que correspondem às hemácias, precisam ser lavados três vezes em soro humano.Adicionamos volume igual de soro humano ao pellet, misturamos e centrifugamos novamente a 2000 RPM por cinco minutos. Este passo é repetido três vezes. Finalmente, obtemos pellets de hemácias prontos para serem adicionados à cultura de ganote.Ok, o cultivo de plasmódio, que está no incubador de CO2, precisa ser mantido em meio RPMA por 16 dias, e no dia 16, eles estarão prontos para a infecção. Como estamos trabalhando com o cultivo de plasmódio, é necessário ter cuidado em todas as etapas. O primeiro passo é que os parasitas devem ser cultivados em uma BC2 lab e o procedimento deve ser realizado em uma câmara de fluxo laminar.Todas as ponteiras de pipeta e todos os acessórios descartáveis devem ser descartados em uma caixa de resíduos biológicos, e quaisquer outras soluções, como a nossa pipetagem, devem ser lavadas com água sanitária a 10% e você deve usar luvas. Os jalecos usados no cultivo do dia 16 precisam coletar uma pequena gota de sangue sobre uma lâmina de vidro, fazer um esfregaço e realizar uma coloração, e em seguida, observar ao microscópio óptico.Podemos determinar a porcentagem de GAMAT a partir de um cultivo de gametócitos com 16 dias de idade. Remova a maior parte do meio, tomando cuidado para não perturbar nem aspirar os parasitas, que facilmente se depositam no fundo do poço. Passe o restante do meio e dos parasitas para um tubo e, em seguida, misture os parasitas nas hemácias em um tubo. Essa suspensão é então colocada em uma centrífuga para girar a 2000 RPM por cinco minutos.Após a centrifugação, os parasitas irão formar um pellet junto com as hemácias. O sobrenadante é o meio RPMI, e na parte inferior o pellet contém os parasitas. Com as hemácias, remova o sobrenadante, que é o meio RPMI.Deve-se ter cuidado com o meio para não perturbar o parasita e os glóbulos vermelhos. A porcentagem de GATOT, determinada pelos GIMs 10, geralmente está na faixa de dois a 4%. Então, quando os glóbulos vermelhos e os parasitas estiverem prontos após a centrifugação, eles são misturados e o volume de sangue que precisa ser adicionado é determinado pela porcentagem final de GATOT. Deve ser aguda e geralmente está na faixa de 0,3 a 1%, e é isso que será usado para a alimentação dos mosquitos fisiológicos.Para a infecção por Presidium S, este é um alimentador de vidro, que utilizamos para a alimentação por membrana dos mosquitos. Colocamos o sangue no interior através do pequeno orifício que você vê, e ele é mantido ali. Na parte inferior lateral há dois bicos, que são conectados à nossa banho-maria, mencionado em 37 graus.Para preparar o alimentador para a alimentação, pegamos um pequeno pedaço de afil. Esticamos a partir das duas extremidades em todos os quatro lados e, em seguida, colocamos isso no lado aberto do alimentador de vidro, de modo a formar uma fina camada de membrana, semelhante à pele. Isso é o que se chama alimentação por membrana.Este é um banho-maria com circulação de água, que mantém a água a 37 °C e também faz circular a água através do alimentador de vidro, de modo que o sangue permaneça aquecido a 37 °C. Conectamos, então, o alimentador de vidro às pequenas capilares e o ligamos ao banho-maria com circulação, acionando o equipamento para que a água circule; a água e o sangue nunca se misturam, pois estão em câmaras separadas. Este é um pequeno recipiente contendo mosquitos *Phis Gambi*.Para começar, o alimentador de vidro é colocado sobre a gaiola e um peso é colocado sobre o alimentador de vidro para que a membrana, que é o fimo, fique nivelada com a rede de malha. Cerca de 200 microlitros de sangue, que contém os parasitas, com a porcentagem necessária de gambotto são adicionados ao alimentador, certificando-se de que o sangue desça completamente até o fundo e que os mosquitos possam ter acesso ao sangue.O fornecimento de sangue é mantido por cerca de 30 minutos. Após a conclusão do fornecimento, o alimentador de vidro é lavado cuidadosamente com água e com solução de hipoclorito a 10%, e todas as membranas e fitas adesivas são removidas e descartadas em caixa de resíduos biológicos. Após o fornecimento de sangue, os mosquitos não alimentados devem ser separados dos que se alimentaram.Para fazer isso, imobilizamos os mosquitos colocando os pequenos copos contendo os mosquitos alimentados com sangue em uma câmara fria por cinco a dez minutos. Como podemos ver, os mosquitos já estão inativos devido ao frio. Abrimos a tampa e transferimos os mosquitos para uma pequena placa de Petri, que é mantida sobre um balde de gelo para que os mosquitos permaneçam frios durante todo o procedimento e não possam escapar.Lembre-se, estes são mosquitos infectados com plasmódio, portanto, todos os cuidados devem ser tomados para não deixá-los escapar. Assim que os mosquitos forem resfriados na câmara fria, transferimos os mosquitos para o insetário normal, mantido à temperatura ambiente, mas sempre colocamos os mosquitos em uma placa de Petri, que é mantida dentro de um balde de gelo, para que permaneçam imobilizados. É possível observar como os mosquitos alimentados podem ser separados dos não alimentados.Os saciados têm sangue neles. Estão completamente ingurgitados. Alguns deles se alimentaram parcialmente de sangue, portanto não estão completamente ingurgitados.Elas têm pouca quantidade de sangue em seu abdômen, enquanto outras possuem grande quantidade de sangue em seu abdômen. Os indivíduos UNFI não possuem nenhum sangue em seu abdômen, o que permite distinguir facilmente entre os indivíduos alimentados e os não alimentados. Mostrados aqui estão os mosquitos fêmeas adultos que se alimentaram de sangue; portanto, vamos transferir esses mosquitos da placa de Petri para copos de papelão com borda de cera.Após colocar os mosquitos alimentados com sangue nos copos, colocamos um pequeno pedaço de algodão embebido em sacarose a 10% para que possam se alimentar da sacarose a 10% durante os próximos sete dias de incubação, além de colocar uma pequena toalha de papel dobrada, para manter a umidade dentro do copo, e cobrimos com uma placa de Petri. Os mosquitos infectados com plasmódio são colocados em outra gaiola pequena, a qual deve ter dupla proteção, e a gaiola é colocada em um laboratório BSL-3, mantido a 27 graus Celsius e 80% de umidade. Sete dias após a alimentação com sangue, os mosquitos, que foram mantidos no insetário dentro de uma caixa com dupla gaiola, são retirados do insetário e levados à câmara fria para imobilizá-los.Após os mosquitos serem imobilizados, eles são transferidos para uma placa de Petri, que é mantida sobre um balde com gelo. Agora estamos nos preparando para dissecar os mosquitos. Vamos dissecar o intestino médio e procurar pelo cisto.O primeiro passo é adicionar cem microlitros de PBS em uma lâmina de vidro montada em um microscópio de dissecação. O próximo passo é usar uma pinça fina. Transferimos um único mosquito do recipiente de Petri para o PBS, que está sobre a lâmina de vidro montada no microscópio de dissecação.Os demais ainda permanecem no pirex refrigerado. Para dissecar os mosquitos, segure o tórax do mosquito com uma das pinças e o abdômen posterior com outra pinça. Em seguida, puxe lentamente a parte do corpo até que o intestino médio seja exposto.Tem a aparência de um saco branco; use pinças para remover o tecido em excesso e as demais partes do corpo. Sim, este é o intestino médio, que tem a aparência de um corpo saculado branco, que possui o os. Transferiremos agora este intestino médio para uma lâmina de vidro com 12 poços e o imergiremos em cinco a dez microlitros de pro micro 0,2%, o que permitirá que o intestino médio adira à lâmina.Com a lamínula, realizamos este passo para todos os mosquitos infectados. O intestino apresenta-se com uma cor rosa brilhante, e transferiremos esta lâmina para um microscópio de luz para contar a carga de OS. Estamos agora observando o intestino médio dissecado dos mosquitos infectados.O intestino médio tem aparência alongada e, com a coloração de rom, apresenta uma leve tonalidade rosada, enquanto os oocistos devem exibir um rosa brilhante em contraste com o tecido intestinal de cor rosa pálida. Esses intestinos médios, embora provenham de mosquitos infectados, não mostram nenhum oocisto, o que sugere que talvez não estejam infectados. No entanto, se um intestino médio estivesse infectado, o oocisto apareceria como um pequeno círculo rosa intenso, podendo haver numerosas formas entre 22 e 500, às vezes dentro de um único intestino médio.Este procedimento envolveu infectar sangue humano com parasitas Plasmodium, alimentar mosquitos Anopheles gambienses com esse sangue infectado, dissecar o intestino médio desses mosquitos e determinar as contagens de oocistos no intestino médio infectado. Essa técnica é importante porque representa a aproximação mais fiel da transmissão da malária humana que podemos replicar em laboratório.

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Biologia

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In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology em um Modelo de Malária Cerebral Experimental Usando Ressonância Magnética

Devido às semelhanças marcantes do ciclo de vida e biologia de parasitas da malária de roedores para parasitas da malária humana, modelos de malária de roedores tornaram-se indispensáveis para a pesquisa da malária. Neste documento, padronizamos algumas das técnicas mais importantes utilizadas na análise fenotípica de espécies selvagens e transgênicas de malária por roedores.

Análise fenotípica de roedores malária parasita assexuada e estágios do sangue sexual e estágios do mosquito

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Plasmodium falciparum Cultura gametocito e infecção por mosquitos através da alimentação artificial

Este protocolo descreve um ensaio de imunoabsorção enzimática em sanduíche para detectar esporozoítos de glândulas salivares em mosquitos. Usando anticorpos monoclonais facilmente disponíveis, o método permite a detecção econômica e de alto rendimento de mosquitos portadores de Plasmodium falciparum ou Plasmodium vivax. O método é adequado para pesquisas de transmissão da malária, incluindo pesquisas vetoriais.

Detecção de esporozoítos de Plasmodium em mosquitos Anopheles usando um ensaio imunoenzimático

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Ensaio padrão de alimentação de membrana para a detecção de infecção por plasmodium falciparum em Vetores de Mosquito Anopheles

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Geração de Esporozoítos Geneticamente Modificados de Plasmodium berghei

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Compreendendo o desenvolvimento de vias compensatórias em um parasita mutante da malária que abriga alelo hipomórfico de quinases semelhantes a plantas

O desenvolvimento sexual do Plasmodium ocorre no intestino médio do mosquito. Direcionar os estágios sexuais do parasita é uma estratégia promissora para bloquear a transmissão. Desenvolvemos o Ookluc, um P. berghei transgênico que expressa nanoluciferase após a formação do zigoto, permitindo a triagem de alto rendimento de compostos bloqueadores de transmissão. Este artigo detalha os métodos de triagem usando o Ookluc.

Ookluc: Uma linha de Plasmodium berghei para identificar compostos bloqueadores de transmissão

Aprenda a infectar mosquitos Anopheles gambiae com Plasmodium falciparum usando alimentação por membrana e culturas de gametócitos. Este protocolo permite avaliar fenótipos de infecção no intestino médio para pesquisa em malária.

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