Plataformas microfabricated para cultura de células mecanicamente dinâmico

O objetivo geral do experimento a seguir é microfabricar dispositivos utilizados para estimular mecanicamente células em ambientes de cultura bidimensionais e tridimensionais. Isso é conseguido por meio de uma técnica de moldagem e empilhamento em múltiplas camadas para produzir uma matriz de micropostes com atuação vertical. Como segundo passo, a matriz de micropostes com atuação vertical é modificada para esticar uma película de cultura, o que aplica deformações bem controladas às células cultivadas sobre a película.

Alternativamente, a matriz pode ser modificada para comprimir construtos de biomateriais com microestruturas, a fim de aplicar estímulo mecânico às células. Os resultados obtidos com o cultivo em uma matriz de hidrogéis tridimensionais mostram a aplicação simultânea de uma faixa de deformações biaxiais em duas dimensões e de compressão tridimensional ao longo da matriz, com base na análise de imagem de marcadores fiduciais fluorescentes. Olá, sou Chris Mariahs dos laboratórios de Craig Simmons e U Sun do Departamento de Engenharia Mecânica e Industrial e do Instituto de Biomateriais e Engenharia Biomédica da Universidade de Toronto.

Hoje vamos mostrar um procedimento para fabricar microdispositivos utilizados para estimular mecanicamente células. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar como as células respondem a uma variedade de forças mecânicas em cultura in vitro. Então, vamos começar.

O processo de fabricação do molde sanduíche inclui colocar uma transparência superior sobre poli(dimetilsiloxano) não curado, ou PDMS, em um molde mestre de SU-8. O sanduíche é colocado em uma pilha de espuma, vidro e metal e curado em estufa sob compressão. Por fim, a pilha é desmontada e a transparência é removida, deixando a camada de PDMS com o padrão preservado.

Para iniciar este processo, misture completamente PDMS, monômero e agente de reticulação. Na proporção padrão de 10 para um, deposite três mililitros da mistura de PDMS não curado sobre um molde SU-8 previamente fabricado e DGA o polímero em uma câmara de vácuo. Em seguida, coloque a espuma e o molde SU-8 sobre uma placa de base de plexiglass.

Coloque cuidadosamente o lado liso de uma transparência jato de tinta sobre o PDMS não curado, certificando-se de evitar a formação de bolhas de ar. Em seguida, posicione uma lâmina de vidro silanizada sobre a transparência abaixo do segundo suporte de espuma e uma placa superior de plexiglass. Prenda o conjunto usando um grampo em C.

Curar o sanduíche de PDMS em forno a 80 graus Celsius por pelo menos quatro horas. Após a cura, retirar o sanduíche do forno e deixar esfriar. Uma vez resfriado, remover o grampo e desmontar o sanduíche.

Retire cuidadosamente a transparência do molde mestre SU-8, mantendo o filme de PDMS com o padrão. Apare as bordas do filme padronizado para remover o excesso de PDMS e armazene as camadas de padrão em um ambiente livre de poeira até que estejam prontas para uso. A próxima etapa deste protocolo envolve a construção de um arranjo microfabricado de postes com atuação vertical.

É necessário um processo de fabricação em múltiplas camadas para produzir a matriz de micropostes. A camada inferior de PDMS padronizada é preparada por meio da fabricação de molde tipo sanduíche. Para esses experimentos, foram utilizados padrões circulares com diâmetros variando de 600 a 1.200 micrômetros.

Para transferir a camada de PDMS para uma lâmina de vidro limpa, utilize uma unidade de descarga por corona para tratar as superfícies de PDMS e vidro com plasma de oxigênio. Em seguida, coloque as duas superfícies em contato uma com a outra. Coloque o conjunto sobre uma placa aquecedora a 80 graus Celsius por 10 minutos para concluir o processo de ligação.

Retire a transparência e descarte-a. Esse processo garante que a película de PDMS padronizada nunca seja liberada de um substrato rígido, o que evita a contração das camadas individuais. A segunda camada moldada em sanduíche é formada como um molde réplica negativa da estrutura desejada de diafragma e poste.

Nesta demonstração, foram utilizados postes circulares com diâmetro de 500 micrômetros para formar esta camada. Primeiro, fixe temporariamente o molde de réplica negativa a uma lâmina de vidro usando fita adesiva dupla face e silanize em um dessecador a vácuo. Depósito de PDMS não curado sobre o sanduíche, na camada do molde, desgaseifique e aplique por spin coating durante 45 segundos a 1000 rotações por minuto, obtendo uma membrana de atuação com espessura de 60 micrômetros. Cure parcialmente a camada de PDMS aplicada por spin coating a 80 graus Celsius por aproximadamente 20 minutos, ou até que o PDMS esteja adesivo, mas não se deforme permanentemente ao toque. Em seguida, remova a lâmina de vidro e a fita adesiva dupla face da camada parcialmente curada de PDMS e o filme de transparência, fixe-o a um par de lâminas de vidro de manuseio e submeta ao plasma.

Trate o PDMS parcialmente curado, em seguida inverta o PDMS e coloque-o em um alinhador personalizado. O alinhador consiste em um porta-peça a vácuo montado em um micromanipulador. Em seguida, submeta a primeira camada de PDMS a tratamento com plasma, depois coloque-a em uma plataforma rotativa sob o porta-peça a vácuo.

Observe o alinhamento entre as duas camadas com um sistema de visão computacional com ampliação de 12 vezes. Usando o manipulador, alinhe as camadas e cuidadosamente coloque-as em contato. Aplique leve pressão com um dedo para colar as camadas juntas.

Em seguida, remova o sanduíche do alinhador. Remova as lâminas de vidro usadas para manipulação e certifique-se de que as camadas estejam em completo contato umas com as outras. Cure em estufa a 80 graus Celsius por mais 30 minutos.

Após 30 minutos, o molde de PDMS transparente e com réplica em silóide pode ser destacado do dispositivo e descartado. Em seguida, o dispositivo é totalmente curado a 80 graus Celsius por pelo menos quatro horas para realizar experimentos com células cultivadas em um substrato bidimensional deformável. A matriz de microatuadores é modificada mediante a ligação de uma terceira camada de PDMS ao dispositivo.

A terceira camada de PDMS consiste em uma estrutura de duas camadas. O círculo inferior corresponde ao tamanho da cavidade de atuação abaixo dos micropostes acionados. O diâmetro do círculo superior é 100 mícrons maior que o diâmetro dos postes de carga.

Um microcanal com 200 mícrons de largura conecta essas estruturas a uma área de conexão e será usado para lubrificar os postes de carregamento e a película de cultura. Para modificar o dispositivo para cultura 2D, primeiro fabrique e una os conectores a ele conforme descrito no protocolo escrito. Em seguida, aplique por centrifugação uma camada de 10 a 15 mícrons de PDMS sobre o lado liso de uma transparência e cure.

O filme fino de PDMS a 80 graus Celsius por pelo menos quatro horas. O próximo passo é aplicar um vácuo nos atuadores e ligar a camada de PDMS ao dispositivo. Para realizar isso.

Primeiro, aplique um vácuo de baixo nível aos atuadores, abaixando a matriz de pinos; trate com plasma e una o filme de PDMS depositado por centrifugação ao dispositivo microatado conforme descrito no protocolo escrito; os pinos e o filme de cultura permanecerão hidrofílicos por um curto período. Em seguida, conecte a seringa de lubrificante ao dispositivo e preencha os canais de lubrificação com uma solução de 90% de glicerol em água desionizada.

Além da lubrificação, essa formulação mantém indefinidamente a hidrofilicidade do PDMS, reduzindo os coeficientes de atrito. Coloque o dispositivo em uma placa aquecedora a 40 graus Celsius e continue injetando lubrificante no canal, causando um pequeno aumento de pressão. Após alguns minutos, as bolhas de ar se difundem pelo PDMS e todas as superfícies ficarão lubrificadas.

Na etapa final, remova a pressão negativa liberando os postes com um bisturi. Corte ao redor da fina película de PDMS. Retire cuidadosamente o suporte transparente do selamento por plasma do dispositivo.

Uma junta de PDMS cortada à mão ao redor da área de cultura do dispositivo. Esterilize o dispositivo mergulhando-o em etanol 70% por cinco minutos, seguido de tratamento sob luz ultravioleta germicida em uma cabine de segurança biológica por 45 minutos. Plasma, trate a superfície e incube com colágeno a 100 microgramas por mililitro durante a noite a quatro graus Celsius.

Após incubação durante a noite, lave o dispositivo com solução salina tamponada com fosfato estéril ou PBS e semeie as células a 10 a 15.000 células por centímetro quadrado. Seguindo protocolos padrão de cultura celular, a matriz de microatuadores pode ser modificada para conduzir experimentos com células cultivadas em construtos tridimensionais de hidrogel com padrões fotolitográficos. Primeiro, uma plataforma baseada em PDMS multilaminada é fabricada.

Após cobrir a plataforma de base com uma metacrilamida, uma solução precursora de hidrogel de lamínula de vidro relacionada é injetada. Em seguida, um biomaterial foto-polimerizável é micro-padroneado na matriz e a solução precursora remanescente é removida por lavagem. A matriz de hastes de carga verticalmente atuadas pode então ser usada para aplicar forças mecânicas compressivas a células cultivadas em biomateriais tridimensionais, com pedaços de fita adesiva Scotch protegendo as áreas ao redor das hastes, enquanto o dispositivo é revestido com paralina C em um sistema PDS 2010 Lab COTER dois.

Isso melhorará a cinética de polimerização para o sistema de biomaterial. Após o revestimento, remova o dispositivo do sistema de revestimento e retire a fita adesiva, deixando uma camada conformal de paralina C sobre os postes. Em seguida, silanize a lamínula de vidro com metacrilato por imersão em uma solução de 2% em volume por volume de trimetóxi silano metacrilato em etanol 95% por dois minutos.

Lave a lamínula. Incube em etanol 100%, seguido por aquecimento a 100 graus Celsius, deixando grupos metacrilato na superfície. Deposite um espaçador de PDMS com 200 mícrons de espessura.

Filme em uma placa de Petri e corte-o em pequenas seções. Una por plasma quatro dessas pequenas seções ao redor da borda da lamínula relacionada ao meac. Em seguida, una por plasma os espaços às áreas de PDMS do dispositivo que recobrem o revestimento de Lene C.

Finalmente, esterilize o dispositivo lavando-o em etanol 70% e expondo-o a germicida ou luz UV em uma cabine de segurança biológica por 45 minutos. Para padronizar litograficamente os hidrogéis de PEG carregados com células nos dispositivos, prepare as soluções precursora e de iniciador fotossensível conforme descrito no protocolo escrito e misture-as completamente para obter uma solução com concentração de 0,4% peso por volume de iniciador fotossensível.

Filtre a mistura através de um filtro de seringa de 0,45 mícron para esterilizar e remover partículas, tripsinize os cultivos celulares em gelo e prepare uma suspensão celular em meio de cultura com o dobro da concentração celular final desejada. Em seguida, misture a suspensão celular e a solução filtrada do precursor do fotoiniciador do hidrogel em uma proporção de um para um. Injete a solução no microdispositivo utilizando uma agulha longa de 25 graus.

Evite cuidadosamente aprisionar bolhas no dispositivo. Alinhe uma máscara de transparência impressa às marcas de alinhamento na superfície do dispositivo. Configure um sistema de iluminação UV para fornecer uma dose de UV de 365 nanômetros com intensidade de 17,5 miliwatts por centímetro quadrado na superfície do dispositivo.

Illumine o hidrogel através da máscara por 195 segundos após a iluminação. Lave a solução precursora do hidrogel não polimerizada com PBS e substitua o PBS por meio de cultura; ative os postes de carregamento para comprimir os constructos de hidrogel. Aqui, é mostrado um dispositivo de amostra concluído para cultura mecanostimulatória 2D.

O corante vermelho é usado para marcar os canais de entrega de pressão atuantes e o corante azul D é usado para marcar os canais de lubrificação na caracterização da deformação. Experimentos podem ser utilizados para determinar os campos de deformação aplicados por meio do rastreamento do movimento de microesferas fluorescentes nos substratos. Pontos vermelhos representam a localização original das microesferas, enquanto pontos verdes representam as localizações deformadas.

Um dispositivo de exemplo para experimentos compressivos tridimensionais pode ser visto aqui, onde um corante verde é usado para marcar os canais de pressão de atuação. A vista superior da matriz de micropostes revela o padrão do constructo de hidrogel sobreposto às imagens reconstruídas dos lados dos postes, com esferas fluorescentes no constructo de hidrogel. Em repouso e sob pressões de atuação de 55 quilopascal, demonstra-se o processo de caracterização de deformação em um sistema de cultura tridimensional.

Então, acabamos de mostrar como fabricar dispositivos utilizados para estimular mecanicamente células em sistemas de cultura bidimensionais ou tridimensionais. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter seus dispositivos o mais limpos e livres de poeira possível e ser paciente, especialmente durante as etapas de alinhamento. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.