Specific Antigen In Vivo Ensaio Killing usando células CFSE rotuladas Alvo

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a qualidade funcional das células T positivas para CD oito em resposta a um antígeno específico, investigando sua capacidade de matar células-alvo in vivo. Isso é conseguido primeiro provocando o efetor específico do antígeno CD oito células T positivas, imunizando camundongos receptores. Como segunda etapa, as células-alvo primárias recebem especificidade ou são tratadas de outra forma, o que completa a criação do sistema alvo efetor específico.

Em seguida, as células-alvo são dadas aos camundongos receptores por meio de transferência adotiva retroorbital. Para observar a morte do efetor in vivo, foram obtidos resultados que mostram se os efetores mataram algum dos alvos com base na análise citométrica de fluxo das células da coloração CF SE. Olá, meu nome é Marina Ward.

Sou estudante de pós-graduação no laboratório de Gary Splitter na Universidade de Wisconsin Madison. Este método fornecerá informações sobre a morte de CTL e também pode ser aplicado à proliferação e sobrevivência celular. Demonstrando o procedimento de transferência adotiva será Dr.Jerome prejudica um cientista do meu laboratório Comece estrategicamente definindo um sistema alvo efetor específico.

Por exemplo, em um ensaio clássico de CTL in vivo, use uma imunização peptídica purificada para obter CD específico oito células T positivas usam o mesmo peptídeo para pulsar as células-alvo singênicas, criando assim um efeito específico para o sistema-alvo. Descontamine a superfície de trabalho de uma coifa de biossegurança para garantir a esterilidade das injeções. Prepare a imunização peptídica colocando-a primeiro em um tubo de dois mililitros.

50 microgramas de peptídeo purificado em 100 microlitros de 10% DMSO em PBS por camundongo. Em seguida, adicione uma quantidade igual de unju livre muito frio e incompleto com contas de um milímetro para misturar. Fixe a tampa do tubo com paraforme e guarde o imunógeno no gelo até à injeção.

Use um beter de esferas ajustado para rotações máximas por minuto para misturar a emulsão por três minutos, colocando prontamente a emulsão de volta no gelo após a mistura. A emulsão resultante deve ter consistência semelhante à maionese. Deixe a emulsão descansar a quatro graus Celsius durante a noite ou até uma semana, misturando ainda mais se alguma separação for observada no momento da imunização.

Identifique os camundongos para esta parte do experimento. Use uma seringa de um mililitro e uma agulha de calibre 20 para puxar a emulsão. Tomando cuidado para não puxar nenhuma conta para preparar as células-alvo.

Camundongos singênicos ingênuos são usados para sacrificar esses camundongos ingênuos. De acordo com os padrões aprovados pela A-A-A-L-A-C. Pulverize a área relevante do mouse com 70% de etanol para minimizar a chance de contaminação do mouse, cabelo ou outros contaminantes externos usando uma tesoura de dissecação, faça um pequeno corte na pele do lado esquerdo do mouse.

Puxe a aba de pele para descobrir o saco peritoneal e os órgãos internos. Corte o peritônio tomando cuidado para não comprometer nenhum dos órgãos subjacentes. Localize o baço que está próximo à superfície e de cor vermelha escura.

Retire cuidadosamente o baço e coloque-o imediatamente em um tubo cônico de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio RPMI preparado no gelo. Continue com os mouses restantes. Transfira o baço e o meio para um tecido de vidro. Homogeneizador.

Triture o baço até que todo o tecido perca a cor. Passe os produtos homogeneizados através de um filtro de célula de 70 mícrons para um tubo cônico de 50 mililitros. Enxágue o homogeneizador uma vez com meio fresco e combine com o homogeneizado do baço despejando através das amostras da centrífuga filtrante a quatro graus Celsius e 1.300 rotações por minuto.

Durante sete minutos, decantar e rejeitar o supinato. Suspenda novamente o pellet celular em 10 mililitros de mentiras, reagentes e incube a 37 graus Celsius por sete minutos. Adicione até 50 mililitros com células frescas, médias e colhidas por centrifugação.

Repita esta lavagem. Conte as células e alíquota 10 milhões de células por poço. Em uma placa de cultura de tecidos de fundo redondo de 96 poços.

Incube a quatro graus Celsius por uma hora e meia. Mova-se para a incubadora de 37 graus Celsius nos últimos 30 minutos. Preparar o reagente CFSE fresco de acordo com o fabricante e diluir até obter uma concentração entre 0,5 e 25.Micromolar.

Faça duas soluções CFSE que diferem dez vezes em concentração. Equilibre essas soluções CFSE de baixa e alta concentração a 37 graus Celsius antes da rotulagem. Remova a placa de 96 poços de células-alvo da incubadora e das células de pellets por centrifugação.

À temperatura ambiente, agite a placa para remover o SUP natant. Ressuspenda as células em 200 microlitros de solução CFSE de baixa ou alta concentração e incube por 15 minutos em uma incubadora de células de pellets de 37 graus Celsius por centrifugação à temperatura ambiente, sacuda a placa para remover o SUP natant Reeses dobre as células em 200 microlitros de fresco, médio e incube por 30 minutos. A 37 graus Celsius, as células do pellet novamente por centrifugação, descartar, supinar e ressuspender os pellets em 50 microlitros de PBS, reserve algumas das células marcadas para controles de não transferência durante a análise dos dados e também para execução no citômetro de fluxo para a transferência adotiva.

Adicione um poço de células marcadas com CFSE de baixa concentração a um poço de células marcadas com CFSE de alta concentração por camundongo. Assim, a injeção resultante consiste em 50% de alvos específicos e 50% de células irrelevantes em 0,1 mililitro. A fim de facilitar a transferência adotiva, anestesiar os camundongos imunizados com peptídeos injetam 0,1 mililitro de células-alvo marcadas por uma via retroorbital no receptor.

Os camundongos após seis horas, eutanasiam os camundongos receptores para coleta de células, isolam o baço do camundongo e purificam a população de células pelo mesmo protocolo que foi usado. Ao preparar as células do baço alvo, coloque as células em placas a 1 milhão por poço em uma placa de cultura de tecidos de fundo redondo de 96 poços, fixe as células recuperadas e não transferidas com paraformaldeído, execute amostras em um citômetro de fluxo e analise os dados. A apresentação típica dos resultados da morte específica da célula é representada de duas maneiras.

Um pico específico de epítopo diminuído no histograma de fax e o valor calculado é a lise específica da célula. Aqui, os números indicam a porcentagem de células do fenótipo CFSE alto ou baixo em células marcadas com CFSE de controle não transferidas recuperadas de um camundongo receptor imunizado com PBS e células marcadas com CFSE recuperadas de dois camundongos receptores específicos de peptídeos diferentes. Observe os picos específicos de epítopos diminuídos indicativos de morte específica da célula.

Alternativamente, os resultados podem ser apresentados graficamente para indicar a lise específica da célula para cada grupo de camundongos. PBS, peptídeo A e peptídeo B. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desenvolver seu próprio ensaio de matança de CTL in vivo usando camundongos.