Specific Antigen In Vivo Ensaio Killing usando células CFSE rotuladas Alvo

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a qualidade funcional de linfócitos T CD8 positivos em resposta a um antígeno específico, investigando sua capacidade de eliminar células-alvo in vivo. Isso é alcançado primeiramente induzindo linfócitos T efetores CD8 positivos específicos para o antígeno mediante imunização de camundongos receptores. Como segundo passo, as células-alvo primárias recebem especificidade ou são submetidas a outro tratamento, o que completa a criação do sistema efetor-alvo específico.

Em seguida, as células-alvo são administradas aos camundongos receptores por meio de transferência adotiva retroorbital. Para analisar os resultados da citotoxicidade efetora in vivo, foram obtidos dados que indicam se os linfócitos efetores eliminaram alguma das células-alvo, com base na análise citométrica de fluxo das células coradas com CFSE. Olá, meu nome é Marina Ward.

Sou estudante de pós-graduação no laboratório de Gary Splitter na Universidade de Wisconsin-Madison. Este método fornecerá informações sobre a citotoxicidade mediada por linfócitos T citotóxicos e também pode ser aplicado à proliferação e sobrevivência celular. O procedimento de transferência adotiva será demonstrado pelo Dr. Jerome Harms, cientista do meu laboratório. Comece estrategicamente definindo um sistema efetor-alvo específico.

Por exemplo, em um ensaio clássico de CTL in vivo, utilize uma imunização com peptídeo purificado para induzir linfócitos T CD8 positivos; use o mesmo peptídeo para pulsar as células-alvo singênicas, criando assim um sistema específico de efeito sobre o alvo. Descontamine a superfície de trabalho de uma cabine de segurança biológica para garantir a esterilidade das injeções. Prepare a imunização com peptídeo colocando-a primeiramente em um tubo de dois mililitros.

50 microgramas de peptídeo purificado em 100 microlitros de DMSO 10% em PBS por camundongo. Em seguida, adicione uma quantidade igual de unju incompleto frio, livre, com esferas de um milímetro para misturar. Fixe a tampa do tubo com parafina e armazene o imunógeno em gelo até a injeção.

Use um agitador de microesferas ajustado para o número máximo de rotações por minuto para misturar a emulsão durante três minutos, colocando-a imediatamente de volta no gelo após a mistura. A emulsão resultante deve apresentar consistência semelhante à da maionese. Deixe a emulsão em repouso a quatro graus Celsius durante a noite ou até uma semana, misturando novamente se for observada alguma separação no momento da imunização.

Identifique os camundongos para esta parte do experimento. Use uma seringa de um mililitro e uma agulha de 20 graus para aspirar a emulsão. Tenha cuidado para não aspirar quaisquer microesferas ao preparar as células-alvo.

Camundongos ingênuos singênicos são utilizados para eutanasiar esses camundongos ingênuos. De acordo com os padrões aprovados pela A-A-A-L-A-C. Pulverize a área relevante do camundongo com etanol a 70% para minimizar a chance de contaminação proveniente de pelos do camundongo ou outros contaminantes externos; usando tesoura de dissecação, faça um pequeno corte através da pele no lado esquerdo do camundongo.

Puxe a prega de pele para expor a bolsa peritoneal e os órgãos internos. Corte o peritônio tomando cuidado para não comprometer nenhum dos órgãos subjacentes. Localize o baço, que está próximo à superfície e tem cor vermelho-escura.

Retire cuidadosamente o baço e coloque-o imediatamente em um tubo cônico de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio RPMI preparado sobre gelo. Prossiga com os demais camundongos. Transfira o baço e o meio para um homogeneizador de tecidos de vidro.

Triture o baço até que todos os tecidos tenham perdido sua cor. Passe os produtos homogeneizados por um filtro de células de 70 micrômetros para um tubo cônico de 50 mililitros. Enxágue o homogeneizador uma vez com meio fresco e combine com o homogenato de baço, despejando através do filtro. Centrifugue as amostras a quatro graus Celsius e 1.300 rotações por minuto.

Durante sete minutos, decante e descarte o sobrenadante. Re-suspenda o pellet celular em 10 mililitros de lisado, reagentes e incube a 37 graus Celsius por sete minutos. Acrescente até 50 mililitros de meio fresco e recolha as células por centrifugação.

Repita esta lavagem. Conte as células e alíquotas de 10 milhões de células por poço em uma placa de cultura de tecidos de fundo redondo com 96 poços.

Incube a quatro graus Celsius por uma hora e meia. Transfira para a estufa a 37 graus Celsius nos últimos 30 minutos. Prepare o reagente CFSE fresco conforme o fabricante e dilua para uma concentração de trabalho entre 0,5 e 25 micromolar.

Prepare duas soluções de CFSE que diferem em dez vezes na concentração. Equilibre as soluções de CFSE de baixa e alta concentração a 37 graus Celsius antes da marcação. Remova a placa de 96 poços com as células-alvo do incubador e pelote as células por centrifugação.

À temperatura ambiente, agite suavemente a placa para remover o sobrenadante. Re-suspenda as células em 200 microlitros de solução de CFSE de concentração baixa ou alta e incube por 15 minutos em um incubador a 37 graus Celsius. Peloletize as células por centrifugação à temperatura ambiente, agite suavemente a placa para remover o sobrenadante, e re-suspenda as células em 200 microlitros de meio fresco, incubando por 30 minutos a 37 graus Celsius. Peloletize novamente as células por centrifugação, descarte o sobrenadante e re-suspenda os pellets em 50 microlitros de PBS. Reserve parte das células marcadas para controles de não-transferência durante a análise de dados e também para análise no citômetro de fluxo para a transferência adotiva.

Adicione uma placa de células marcadas com CFSE em baixa concentração a uma placa de células marcadas com CFSE em alta concentração por camundongo. Assim, a injeção resultante consiste em 50% de alvos específicos e 50% de células irrelevantes em 0,1 mililitro. Para facilitar a transferência adotiva, anestesie os camundongos imunizados com peptídeo e injete 0,1 mililitro de células-alvo marcadas por via retro-orbitária no receptor.

Após seis horas, eutanasiar os camundongos receptores para a coleta de células, isolar o baço dos camundongos e purificar a população celular pelo mesmo protocolo que foi utilizado. Ao preparar as células esplênicas-alvo, semear as células a 1 milhão por poço em uma placa de cultura tecidual de fundo redondo com 96 poços, fixar as células recuperadas e não transferidas com paraformaldeído, analisar as amostras em um citômetro de fluxo e analisar os dados. A apresentação típica dos resultados da citotoxicidade celular específica é mostrada de duas maneiras.

Um pico específico do epítopo reduzido no histograma de fax e o valor calculado indicam lise específica de células. Aqui, os números indicam a porcentagem de células com fenótipo alto ou baixo de CFSE em células controle marcadas com CFSE não transferidas, recuperadas de um camundongo receptor imunizado com PBS, e células marcadas com CFSE recuperadas de dois camundongos receptores diferentes, específicos para peptídeos. Observe os picos específicos do epítopo reduzidos, indicativos de morte celular específica.

Alternativamente, os resultados podem ser apresentados graficamente para indicar a lise celular específica para cada grupo de camundongos. PBS, peptídeo A e peptídeo B. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como desenvolver seu próprio ensaio de citotoxicidade in vivo usando camundongos.