Perfil de metiltransferases e Outros S-Adenosil- _L Homocisteína-Proteínas de Ligação de captura por Espectrometria de Massa Compound (CCMS)

O objetivo geral do experimento a seguir é caracterizar metiltransferases provenientes de misturas proteicas complexas por meio da espectrometria de massas com compostos de captura, ou CCMS. As metiltransferases são isoladas funcionalmente por compostos de captura trifuncionais que carregam o inibidor geral do produto das metiltransferases, S-adenosil-L-homocisteína, abreviado como SAH, como função de seletividade. No fluxo de trabalho aqui apresentado, o isolamento funcional é alcançado pela incubação de um lisado celular com o composto de captura, a fim de estabelecer um equilíbrio reversível de ligação entre a função de seletividade do composto de captura e as proteínas-alvo. Como segundo passo, a mistura é irradiada com luz ultravioleta dentro da caixa de captação.

A foto da irradiação ativa a função reativa do composto de captura. Isso induz a formação de uma ligação cruzada covalente irreversível entre o composto de captura e as proteínas-alvo. Em seguida, os conjugados do composto de captura com proteínas são separados do lisado, lavados minuciosamente, liberados do suporte sólido e tratados com tripsina, a fim de identificar as proteínas capturadas por meio de análise espectrométrica de massa dos peptídeos triptícos. Os resultados obtidos demonstram o isolamento e a identificação diretos de metiltransferases a partir de um lisado celular de Escherichia coli com base na espectrometria de massa com composto de captura.

Olá, sou Thomas Lentz do Laboratório de CaTECH do Departamento de Bioquímica. Sou Mathias Rega, também do Laboratório de Bioquímica CapTech. Sou Mer Linsky do departamento de análise.

Hoje mostraremos a vocês o procedimento para captura direta de metiltransferases a partir de lisado celular equalizado. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar interações entre proteínas e moléculas pequenas. O procedimento permite o isolamento e a identificação de subproteomas funcionais, tais como quinases, metaloproteinases, gtpases, ais, para citar alguns.

Também utilizamos esta abordagem para a descoberta de alvos farmacológicos. Então, vamos começar. Para os experimentos de captura, utiliza-se o kit L homocystine caper de curta duração SAH caper kit para caramujo.

Este kit inclui o composto capturador SAH e SAH livre como competidor. Também estão incluídas microesferas magnéticas revestidas com estreptavidina com diâmetro de um mícron, tampão de captura cinco vezes concentrado e tampão de lavagem cinco vezes concentrado. Usando diferentes tubos de uma tira de tubos PCR de 200 microlitros, prepare microesferas magnéticas revestidas com estreptavidina carregadas com o composto capturador SAH misturando 50 microlitros de microesferas magnéticas revestidas com estreptavidina a 10 miligramas por mililitro com 25 microlitros de composto capturador SAH a 100 micromolar para cada Eloqua vigorosamente.

Agite as suspensões resultantes à temperatura ambiente por dois minutos para permitir a ligação da porção biotina do composto de captura à estreptavidina na superfície das microesferas magnéticas. Em seguida, colete magneticamente as microesferas capra nas tampas dos tubos de PCR usando o capra mag, descarte o sobrenadante e reconstitua as microesferas capra resultantes em 200 microlitros de tampão de lavagem uma vez. Novamente, colete magneticamente as microesferas capra nas tampas das tiras de tubos de PCR e descarte o sobrenadante.

Em seguida, feche os tubos para evitar a secagem das perolas. Rotule então novos tubos para o ensaio de captura e os controles necessários, incluindo o controle de competição. Faça o precipitado do controle de competição e do ensaio de captura combinado com precipitação, colocando os tubos rotulados na caixa Capra para regular a temperatura entre zero e quatro graus Celsius.

Em seguida, pipete o volume de água milli Q calculado para um volume final de reação de 100 microlitros e 20 microlitros de tampão de captura cinco vezes concentrado. Para cada reação, adicione 0,26 miligramas de lisado celular total de E. coli DH5α a cada tubo e misture suavemente por inversão. Para o controle de competição e o controle de competição do ensaio de precipitação, adicione 20 microlitros de solução competidora de SAH 10 milimolar.

Para o ensaio de captura, adicione 20 microlitros de água milli Q em vez da solução de SAH, misture suavemente todos os tubos por inversão e centrifugue brevemente. Em seguida, suspenda as microesferas Capra no lisado respectivo e incube por três horas a quatro graus Celsius. Mantenha as microesferas em suspensão mediante rotação para permitir a ligação reversível das proteínas que se ligam ao SAH à função de seletividade do composto de captura de SAH.

Após a incubação, centrifugue brevemente e coloque as suspensões na caixa de capra. Separe os tubos e retire as suspensões para o controle de "pull down" e o controle de competição de "pull down" colocando-os no gelo. Deixe as suspensões restantes para o controle de competição do ensaio de captura e para o ensaio de captura combinado.

Puxe para baixo na caixa Capra para irradiar as amostras com luz UV enquanto simultaneamente as resfria. Irradie as amostras por um tempo total de 30 minutos com intervalos de irradiação de 2,5 minutos em tubos fechados entre zero e quatro graus Celsius. Esse processo formará uma ligação covalente cruzada entre a função de reatividade do composto capturador SAH e as proteínas que ligam SAH.

Retire as suspensões após um intervalo de irradiação de 2,5 minutos da caixa Capra. Resfrie em banho de gelo por cerca de 15 segundos e misture várias vezes por inversão. Em seguida, centrifugue brevemente as amostras para remover qualquer suspensão residual nas tampas e devolva-as à caixa Capra para o próximo intervalo de irradiação.

Em seguida novamente, inclua as suspensões para o ensaio de precipitação e controle de competição da precipitação e adicione 20 microlitros de solução de SAH 10 milimolar ao ensaio de captura para o controle de competição, controle de competição da precipitação e ensaio combinado de captura mais precipitação, adicionando 20 microlitros de água milli Q. Incube as suspensões por 10 minutos a quatro graus Celsius, mantendo as microesferas e a suspensão sob rotação no ensaio de captura. As proteínas ligadoras de SAH não reticuladas ao composto capturador de SAH serão deslocadas.

Após a incubação, colete as microesferas capra das suspensões utilizando o capra mag e descarte o sobrenadante. Em seguida, lave as microesferas por ressuspensão, suspendendo-as em 200 microlitros de tampão de lavagem uma vez e coletando as microesferas por separação magnética. Repita essa lavagem cinco vezes, depois ressuspenda-as em 200 microlitros de água milli Q e colete as microesferas por separação magnética.

Resuspenda as esferas em 200 microlitros de acetonitrila a 60% e recolha as esferas utilizando o capri mag. Repita essa lavagem com acetonitrila duas vezes. Aplique ultrassom se as esferas não puderem ser facilmente ressuspendidas.

Em seguida, libere as proteínas capturadas das esferas mediante a adição de 200 microlitros de acetonitrila a 60%, ácido trifluoroacético a 0,2%, recém-preparado, seguido por uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente sob agitação vigorosa. Novamente, aplique ultrassom caso as esferas não possam ser facilmente ressuspendidas.

Finalmente, colete magneticamente as esferas e descarte-as. Corte a tira de tubos em tubos individuais, perfure as tampas e evapore o sobrenadante até secagem. Nesta etapa, utilizando um evaporador centrífugo, as proteínas capturadas podem ser submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS ou processadas para espectrometria de massas conforme descrito na próxima seção; dissolva as proteínas capturadas liberadas das esferas magnéticas em 10 microlitros de bicarbonato de amônio 50 milimolar.

Coloque as amostras em um banho de ultrassom, depois vortexe-as. Em seguida, adicione um microlitro de tripsina a 0,5 microgramas por microlitro em HCl 1 milimolar, centrifugue brevemente e incube a solução a 37 graus Celsius durante a noite. Após a incubação noturna, dessaline uma solução contendo os peptídeos trípticos das proteínas capturadas utilizando material C18, como pontas de estágio de 20 microlitros pela Proxy na Biosystems, conforme instruções do fabricante; elua os peptídeos duas vezes com 10 microlitros de metanol 50%, ácido fórmico 5%.

Em seguida, evapore o solvente utilizando um evaporador centrífugo, deixando os peptídeos secos; dissolva os peptídeos em 5,5 microlitros de ácido fórmico 0,1% aplicando ultrassom em banho de ultrassom e vortexando. Por fim, analise a amostra por cromatografia líquida de nano fluxo acoplada à espectrometria de massas em tandem, conforme descrito no protocolo escrito. Para analisar os dados de MS/MS, utilize um algoritmo de identificação de proteínas, como o SEQUEST implementado no BioWorks Browser versão 3.3 0.1, SP1 e X! Tandem implementado no software Scaffold 3.

A busca automatizada no banco de dados é realizada contra a base de conhecimento mais recente do recurso universal de proteínas. Banco de dados Swiss-Prot lançado em www.xpai.org do organismo investigado.

O banco de dados utilizado no presente estudo é uma linhagem de coli. K12 versão 57 traço 11 dentro do Seaquest, configurado para busca automatizada com uma tolerância de cinco partes por milhão para o precursor. Tolerância de um unidade de massa atômica para íons fragmento e tripsina completa com especificidade, permitindo até duas clivagens perdidas.

Defina as modificações variáveis para permitir fosforilação em serina, treonina e tirosina, oxidação de metionina, desamidação em asparagina e glutamina, acetilação em lisina, formilação em lisina e metilação em arginina, lisina, serina, tirosina e asparagina. Não utilize modificações fixas na busca no banco de dados. Carregue os arquivos DTA ou SRF gerados pelo Seaquest no software Scaffold 3, que realiza a avaliação da probabilidade de atribuições de peptídeos e identificações de proteínas combinando buscas no banco de dados do Seaquest e do X!Tandem. O Scaffold é útil para comparar, validar e visualizar facilmente listas de proteínas provenientes de várias amostras.

Defina os parâmetros no software Scaffold Three para aceitar apenas identificação de proteínas e relatar como acertos distintos. Configure os acertos para conter pelo menos um peptídeo discriminante que tenha passado na validação de probabilidade. De acordo com a análise do Scaffold Three, considere apenas peptídeos com probabilidade maior ou igual a 95%, conforme especificado pelo algoritmo Peptide Prophet dentro do Scaffold.

Três softwares definem probabilidades de identificação de proteínas para múltiplas atribuições de peptídeos como maiores ou iguais a 95% segundo o algoritmo Protein Prophet. Para identificações de proteínas com um único peptídeo, defina arbitrariamente a probabilidade da proteína como maior ou igual a 50% e inspecione manualmente o peptídeo correspondente. Proteínas cujos espectros MS/MS compreendem peptídeos semelhantes e que não podem ser diferenciadas com base apenas na análise MS/MS são agrupadas pelo software para satisfazer os princípios da parcimônia.

A taxa estimada de falsas descobertas nas identificações de peptídeos pode ser determinada utilizando a abordagem de banco de dados de proteínas invertido e deve ser inferior a 1%. Aqui, é mostrada a análise por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) com coloração prata das proteínas intactas capturadas no ensaio de captura. SAH livre em excesso foi adicionado após a etapa de irradiação com UV para garantir que apenas as proteínas que tiveram o composto de captura ligado covalentemente por meio da função de fotoreatividade sejam isoladas.

As proteínas foram identificadas por espectrometria de massa (MS) a partir de faixas de gel proteico cortadas após a digestão por Ingel Triptych. Para comparação, a primeira faixa à esquerda mostra 0,25% do lisado total de células de E. coli DH5α a partir do qual as proteínas foram isoladas no ensaio de captura. Essa comparação destaca a drástica redução da complexidade da amostra alcançada pela tecnologia de compostos de captura.

Os controles foram executados no centro do gel e incluem o controle de competição do ensaio. Este controle contém excesso de SAH livre como competidor antes da etapa de radiação UVI, a fim de impedir a ligação de proteínas ao composto de captura SAH por meio da função de seletividade do SAH. O controle de competição é essencial para determinar quaisquer proteínas capturadas de forma não específica que não se ligam ao SAH.

Assim, as proteínas identificadas no ensaio de captura, mas não no controle de competição, são proteínas ligadoras de SAH específicas. Também está incluído um experimento de precipitação sem irradiação UV e sem adição de SAH livre.

O controle de competição do ensaio de precipitação também não é irradiado, mas contém SAH como competidor. Por fim, o ensaio combinado de captura mais precipitação é irradiado com UV e nenhum SAH livre foi adicionado durante o protocolo. É evidente que a reticulação por fotoativação aumenta o rendimento e a sensibilidade do experimento, e a especificidade pode ser facilmente testada em experimentos de competição usando excesso de SAH livre, em vez de analisar as proteínas intactas capturadas por eletroforese SDS-PAGE.

A mistura completa de proteínas capturadas pode ser analisada de uma vez por cromatografia líquida de fluxo nano acoplada à espectrometria de massas em tandem após a digestão Triptych. Esta é a abordagem real de CCMS e é muito mais sensível do que a análise por eletroforese SDS-PAGE. METILTRANSFERASES e outras proteínas selecionadas identificadas por experimentos de CCMS são mostradas nesta tabela.

Os números indicados representam a contagem espectral de peptídeos não ponderada por proteína; muito mais metiltransferases e outras proteínas que ligam SAH foram identificadas no ensaio de captura em comparação com o ensaio de precipitação. A especificidade pela SAH é demonstrada pela ausência quase completa dessas proteínas no controle de competição. O número total de proteínas identificadas nas corridas de CCMS e a sobreposição de proteínas entre as corridas foram tabulados.

O número de proteínas identificadas com pelo menos dois peptídeos é indicado entre parênteses. A alta reprodutibilidade do método pode ser inferida pelo elevado grau de superposição de proteínas, principalmente as não específicas, entre experimentos comparáveis, especialmente nas proteínas robustamente identificadas com pelo menos dois peptídeos aqui. Os diagramas de Venn descrevem a superposição das proteínas identificadas no ensaio de captura, no controle de competição e no pull down, enquanto os números de todas as proteínas identificadas são apresentados à direita, com os números de proteínas identificadas com pelo menos dois peptídeos indicados entre parênteses; os números de metiltransferases e de SAH nuclease são mostrados à esquerda.

Acabamos de mostrar como isolar e identificar metiltransferases ou outros subproteomas funcionais de lisados celulares de e. coli ou de outros tecidos ou lisados celulares por espectrometria de massa com compostos de captura ou CCMS. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de evitar a exposição prolongada do composto de captura à luz visível, manter as amostras frias, preparar recentemente a solução de acetonitrila com TFA utilizada para liberar as proteínas capturadas dos grânulos magnéticos e evitar a contaminação dos experimentos por fontes externas de proteínas, como queratina proveniente de poeira ou do pesquisador.

Além disso, descobrimos que isso depende da configuração específica, se a configuração fora de fase, se a fotoconjugação ocorre entre o composto pré-recapturado e as proteínas em solução ou se a configuração atualmente descrita, em fase, apresenta melhor desempenho. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.