Aplicação de uma condutância do receptor NMDA em neurônios dopaminérgicos Rat Midbrain Usando a Técnica Clamp dinâmico

Os neurocientistas estudam a função do cérebro investigando como os neurônios no cérebro se comunicam aqui. Alterações na atividade elétrica de um único neurônio são provocadas pela aplicação de uma condutância controlada experimentalmente utilizando a técnica de clamp dinâmico. Primeiro, cortam-se fatias finas do cérebro e as armazena em uma câmara de incubação preenchida com líquido cefalorraquidiano artificial.

Uma fatia é então transferida para um aparato de gravação de patch clamp. Um neurônio é selecionado e depois selado com um eletrodo de gravação utilizando um computador com clamp dinâmico conectado ao amplificador de gravação. Uma condutância do receptor NMDA é aplicada na célula.

Os registros resultantes mostram uma rajada de potenciais de ação, sugerindo que a ativação de receptores NMDA é um mecanismo celular pelo qual neurônios dopaminérgicos podem gerar rajadas. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos atuais, como injeção de corrente contínua ou tratamento farmacológico, é que somos capazes de determinar com precisão os efeitos da ativação de um receptor definido experimentalmente sobre a atividade elétrica de um neurônio vivo. Após extrair rapidamente o cérebro de uma rata Bragg dolly anestesiada, corte fatias horizontais de cérebro de 240 micrômetros usando um microtomo vibratório.

À medida que as fatias são cortadas, utilize uma pipeta de transferência para colocá-las em uma câmara de incubação a 32 graus Celsius preenchida com fluido cerebroespinhal artificial até o momento de realizar os experimentos de gravação. O aparato de gravação intracelular é composto por um microscópio com objetivas configuradas para imagem de contraste de gradiente, um monitor, um sistema de perfusão, um amplificador Multi Clamp 700B, um conversor analógico-digital, um micromanipulador e uma etapa de cabeça. Um computador Mac Pro executa o software de aquisição de dados, Axo Graph X e o software Multi Clamp Commander ao lado do aparato de gravação intracelular e do computador Mac Pro encontra-se um computador Sun Microsystems executando Linux em tempo real, juntamente com seu conversor analógico-digital, que será utilizado com a técnica de clamp dinâmico.

O aparato de gravação intracelular deve perfundir um fluido cerebroespinhal artificial a aproximadamente 35 graus Celsius. Se a fatia a ser gravada foi preparada horizontalmente, use uma pipeta de transferência para colocá-la em uma placa de Petri com fluido cerebroespinhal artificial e, com uma ferramenta de corte, divida a fatia ao longo da linha média. Em seguida, para realizar gravações eletrofisiológicas, use uma pipeta para transferir a fatia para o aparato de gravação intracelular.

Utilizando o objetivo de 40 x, visualize aqui o neurônio-alvo, observando-se um neurônio dopaminérgico individual da substância negra. Observe o soma com formato elíptico e dois dendritos prolongando-se a partir dele. Com um puxador de micropipetas eletrônico P 97, prepare eletrodos com resistência de ponta entre quatro e 10 megaohms.

Em seguida, utilizando uma agulha de seringa microfill, encha um eletrodo com solução interna. Insira o eletrodo cheio na meia-célula, conectada ao estágio inicial do amplificador, usando uma seringa conectada à meia-célula por um pequeno trecho de tubo. Aplique uma pequena quantidade de pressão positiva ao eletrodo de gravação.

Sob orientação visual, posicione o eletrodo sobre o neurônio-alvo. Uma pequena reentrância será observada na superfície da célula. Aplique uma pequena quantidade de pressão negativa para formar um selo gigasseal no neurônio desejado.

Aplicar sucção com a boca para romper o selo. Isso constitui uma gravação em célula inteira. Após o rompimento do selo, utilize a interface de software multi clamp commander para colocar o amplificador no modo de fixação de corrente, no qual nenhuma corrente pode ser injetada.

Para aplicar uma condutância de NMDA nesta célula, comece executando o software RTXI no computador do clamp dinâmico. Em seguida, carregue um modelo personalizado contendo um receptor de NMDA na memória. Uma vez que o modelo tenha sido carregado na memória do RTXI, ele calculará em tempo real a corrente a ser injetada na célula usando a equação mostrada aqui, onde G-N-M-D-A é a condutância desejada em nanosiemens, definida como zero nanosiemens.

Semens por padrão MG é a concentração de magnésio. E-N-M-D-A é o potencial de reversão para o receptor NMDA definido em zero milivolts, e VM é o potencial da membrana da célula medido a partir do amplificador em milivolts. Agora, com o cabo BNC padrão, conecte a saída do computador de clamp dinâmico à entrada de comando do amplificador com um conversor analógico para digital.

Coloque o amplificador no modo padrão de fixação de corrente ic usando a interface de software Multi Clamp Commander. O RTXI foi configurado para receber a condutância desejada GFT a partir de um sinal de tensão do software de aquisição de dados Axo Graph X. Aqui executamos um protocolo simples no AXO Graph X no qual um degrau de condutância de um segundo de 40 nano Siemens é aplicado à célula.

Um surto de potenciais de ação é evocado em resposta ao degrau de condutância utilizando a configuração descrita neste vídeo, foi realizada uma gravação somática em célula inteira de um neurônio dopaminérgico na substância nigra pars compacta. As células dopaminérgicas geralmente disparam espontaneamente em taxas baixas com um padrão semelhante ao de marcapasso. Um surto de potenciais de ação pode ser evocado pela aplicação fásica de uma condutância do receptor NMDA com clampeamento dinâmico.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como aplicar uma condutância NMDA em um neurônio dopaminérgico vivo em uma fatia cerebral isolada. No entanto, esta técnica pode ser utilizada para qualquer tipo celular que possa ser registrado usando técnicas eletrofisiológicas padrão. De forma semelhante, o clamp dinâmico pode ser estendido para imitar os efeitos elétricos, mas uma ampla variedade de tipos de receptores.

Esperamos que este vídeo tenha sido útil para demonstrar o que é a técnica de clamp dinâmico e como a utilizamos em nosso laboratório. Portanto, obrigado por assistir.