Name: Aplicação de uma condutância do receptor NMDA em neurônios dopaminérgicos Rat Midbrain Usando a Técnica Clamp dinâmico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Aprenda a técnica de clamp dinâmico em neurônios dopaminérgicos de ratos para estudar a ativação de receptores NMDA. Este método permite controlar com precisão a condutância e observar disparos de potenciais de ação em tempo real.

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Este trabalho foi financiado pela MH084494 (CJL), e MH079276 e NS060658 (PAC).

1. Preparação fatia <ol><li> Cortar fatias de cérebro usando um micrótomo vibrando. Preparamos 240 mM fatias mesencéfalo horizontal de um isoflurano-anethetized Sprague-Dawley rato (Charles River Laboratories) usando um micrótomo vibrando (Microm HM 650V), de acordo com a Universidade do Texas em San Antonio Animal Care Institucional e Comitê de uso. </li><li> Mantenha as fatias em uma câmara de incubação até que esteja pronto para gravar. Usamos um recipiente de incubação aquecida a 32 ° C e preenchido com líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF, em mM): 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 4 MgCl 2, CaCl 2 2, 10 dextrose, 25 de NaHCO 3, 1,3 ácido ascórbico, piruvato de sódio 2,4 e 0,05 glutationa. </li></ol> 2. Gravação eletrofisiológicas <ol><li> Transferir a fatia para o equipamento de gravação intracelular em que um fluido cerebrospinal artificial (ACSF) a 35 ° C está sendo perfundido. Nós usamos a mesma ACSF em 1,2 exceto que 2mM MgCl 2 foi usado e glutationa foi omitido. Para fatias horizontalmente preparado, nós normalmente bisect a fatia ao longo da linha média. </li><li> Visualize o neurônio alvo. Foi visualizada individuais substantia nigra neurônios dopaminérgicos com um sistema de imagem gradiente de contraste. </li><li> Puxe um eletrodo usando um extrator de eletrodo eletrônicos. Puxamos eletrodos com uma resistência de ponta 10/04 mohms usando um P97 Micropipeta extrator (Sutter Instrument Company). </li><li> Preencher um eletrodo com a solução desejada interna. Usamos uma solução contendo (em mM): 138 K gluconato, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 0,2 EGTA, 0,0001 CaCl 2, 4-Na ATP, 0,4 Na-GTP. A solução interna foi ajustado para um pH de 7,3 com KOH 1M e uma osmolaridade de 270-275 MOSMS. </li><li> Faça um selo gigaohm para o neurônio desejado. Ruptura com o selo de sucção. Isto constitui uma gravação de células inteiras. A Multiclamp amplificador 700B foi usado em nossa configuração. O amplificador deve então ser colocado em modo 'I = 0' grampo atual. </li></ol> 3. Aplicação de condutância com Grampo dinâmico <ol><li> RTXI (www.rtxi.org) foi executado no computador de fixação dinâmico. Um modelo personalizado escrito contendo um receptor NMDA foi carregado na memória. A corrente a ser injetado na célula em tempo real é calculado pela seguinte equação: Eu NMDA =-g NMDA * [1 / (1 ​​+ ([Mg] / 3,57) * e (-V m * 0,062))] * (V m - E NMDA), onde g é a condutância NMDA desejada (em ns; por padrão definido como 0 ns), [Mg] é a concentração de magnésio (ajustado para 1,5 mM em nosso exemplo abaixo), E NMDA é o potencial de reversão para o receptor NMDA (set a 0 mV), e V m é o potencial de membrana da célula medido a partir do amplificador (em milivolts). </li><li> A saída do computador de fixação dinâmica foi conectado à entrada de comando do amplificador através de um conversor analógico-digital. </li><li> O amplificador foi colocado no modo 'IC' grampo atual. </li><li> Digite seu condutância receptor NMDA em RTXI desejado (por exemplo, 40ns). Você deverá ver uma explosão fásica de potenciais de ação. Alternativamente, uma condutância pode ser dado a RTXI através de uma saída analógica (Figura 1A, 'g (t)'). Um fator de escala apropriada deve ser utilizada dentro RTXI para converter o sinal de volts para a Siemens. </li></ol> 4. Resultados representante Uma configuração de sucesso para aplicação de uma condutância dinâmica usando a braçadeira é mostrado na Figura 1A. Usando esta configuração, fizemos um todo células somáticas de gravação de um neurônio dopaminérgico na substantia nigra pars compacta. Células dopaminérgicas tipicamente fogo espontaneamente a taxas baixas com um padrão de pacemaker-like. Uma explosão de potenciais de ação podem ser evocadas pela aplicação de uma condutância fásica receptor NMDA com grampo dinâmico (Figura 1B). <img src="/files/ftp_upload/2275/2275fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Aplicação de uma condutância receptor NMDA usando a técnica de fixação dinâmico. A. configuração do hardware ilustrar as conexões entre o equipamento de gravação e computador intracelular clamp dinâmico. B. Uma rajada de potenciais de ação é evocado pela aplicação de uma condutância receptor NMDA 40ns em uma gravação de células inteiras a partir de uma substância negra pars compacta dopaminérgicos neurônio.

<ol><li>Robinson, H. P., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> J Neurosci Methods. 49, 157-165 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp%3A+artificial+conductances+in+biological+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons.</a> Trends Neurosci. 16, 389-394 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clamp%3A+computer-generated+conductances+in+real+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> J Neurophysiol. 69, 992-995 (1993).</li>
<li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends Neurosci. 27, 218-224 (2004).</li>
<li>Deister, C. A., Teagarden, M. A., Wilson, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intrinsic+neuronal+oscillator+underlies+dopaminergic+neuron+bursting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An intrinsic neuronal oscillator underlies dopaminergic neuron bursting.</a> J Neurosci. 29, 15888-15897 (2009).</li>
<li>Lobb, C. J., Wilson, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+role+for+GABA+receptors+on+the+firing+pattern+of+midbrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">A dynamic role for GABA receptors on the firing pattern of midbrain dopaminergic neurons.</a> J Neurophysiol. 104, 403-413 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A técnica de fixação dinâmica demonstrado aqui aperfeiçoa a técnica tradicional de injeção de corrente contínua, permitindo que o experimentador para imitar os efeitos elétricos da ativação de um receptor. Neste vídeo, mostramos que se pode adicionar os efeitos da ativação de um receptor NMDA para a atividade espontânea dos neurônios dopaminérgicos, isto é, uma rajada de potenciais de ação são evocados. Devido à flexibilidade da implementação hardware / software, uma variedade de extensões podem ser usadas. O sinal da corrente injetada pode ser ligado de negativo para positivo, o que representa um cenário onde os efeitos do receptor ativado é removido de um neurônio. Neurônios modelo, representado na forma de uma série de equações diferenciais, também pode ser resolvido numericamente e permitir que o experimentador para investigar redes pequenas.

<table><tbody><tr><td>K-gluconato anidro</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; X 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenoglicol-bis(B-aminoetil éter)-N,N,N&amp;#8211;N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetraacético</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Reagente</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>Reagente</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, Anidro</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Reagente</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CholCl</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Reagente</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutationa</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Olympus BX51WI (com objetiva de 40x)</td><td>Microscópio</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 conversores A/D</td><td>Equipamento</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B com estágio de cabeçote CV-7B</td><td>Equipamento</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puxador de micropipetas P-97 Flaming/Brown</td><td>Equipamento</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de seringa Microfil</td><td>Equipamento</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Equipamento</td><td>Siskiyou, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monitor</td><td>Equipamento</td><td>Triview</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aplicação de uma condutância do receptor nmda em neurônios dopaminérgicos rat midbrain usando a técnica clamp dinâmico

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neurocientistas estudar a função do cérebro, investigando como os neurônios do cérebro se comunicam. Muitos investigadores olhar para as mudanças na atividade elétrica de um ou mais neurônios em resposta a uma entrada experimentalmente controladas. A atividade elétrica dos neurônios pode ser gravado em fatias de cérebro isoladas usando técnicas de patch clamp com micropipetas de vidro. Tradicionalmente, os experimentadores podem imitar a entrada de neurônios por meio de injeção direta de corrente através da pipeta, estimulação elétrica das outras células ou restantes ligações axonal na fatia, ou manipulação farmacológica de receptores localizados na membrana da célula neuronal registrada. Injeção de corrente contínua tem a vantagem de passar uma forma de onda predeterminada atual com alta precisão temporal no local da gravação (geralmente a soma). No entanto, isso não muda a resistência da membrana neuronal como nenhuma canais iônicos são fisicamente aberta. Injeção de corrente geralmente emprega pulsos retangulares e, portanto, não o modelo de cinética de canais iônicos. Finalmente, a injeção de corrente não pode imitar as mudanças químicas na célula que ocorre com a abertura de canais iônicos. Receptores podem ser fisicamente ativada pela estimulação elétrica ou farmacológica. O experimentador tem boa precisão temporal da ativação do receptor com a estimulação elétrica da fatia. No entanto, é limitada precisão espacial da ativação do receptor ea natureza exata do que é ativada após a estimulação é desconhecida. Este último problema pode ser atenuado parcialmente através de agentes farmacológicos específicos. Infelizmente, o tempo de ativação de agentes farmacológicos é tipicamente lento ea precisão espacial de insumos para a célula gravado é desconhecido. A técnica de fixação dinâmica permite que um experimentador para mudar o atual passados ​​diretamente para a célula com base em feedback em tempo real do potencial de membrana da célula (Robinson e Kawai 1993, Sharp et al, 1993a, b;. Para revisão, ver Prinz et al. 2004). Isso permite que um pesquisador para imitar a mudanças elétricas que ocorrem no local da gravação em resposta à ativação de um receptor. Em tempo real as mudanças na corrente aplicada são determinados por uma equação matemática implementado em hardware. Temos recentemente usou a técnica de fixação dinâmica para investigar a geração de rajadas de potenciais de ação pela ativação de receptores NMDA fásica em neurônios dopaminérgicos da substância negra pars compacta (Deister et al, 2009;. Lobb et al, 2010).. Neste vídeo, demonstramos os procedimentos necessários para aplicar uma condutância receptor NMDA em um neurônio dopaminérgico.

Neste vídeo, demonstramos como aplicar uma condutância em um neurônio dopaminérgico gravada na configuração da célula inteira em fatias de cérebro de rato. Esta técnica é chamada a braçadeira dinâmico.

Aplicação de uma condutância do receptor NMDA em neurônios dopaminérgicos Rat Midbrain Usando a Técnica Clamp dinâmico

Neurocientistas estudam a função do cérebro investigando como os neurônios no cérebro se comunicam. Muitos investigadores analisam alterações nas...

Os neurocientistas estudam a função do cérebro investigando como os neurônios no cérebro se comunicam aqui. Alterações na atividade elétrica de um único neurônio são provocadas pela aplicação de uma condutância controlada experimentalmente utilizando a técnica de clamp dinâmico. Primeiro, cortam-se fatias finas do cérebro e as armazena em uma câmara de incubação preenchida com líquido cefalorraquidiano artificial.Uma fatia é então transferida para um aparato de gravação de patch clamp. Um neurônio é selecionado e depois selado com um eletrodo de gravação utilizando um computador com clamp dinâmico conectado ao amplificador de gravação. Uma condutância do receptor NMDA é aplicada na célula.Os registros resultantes mostram uma rajada de potenciais de ação, sugerindo que a ativação de receptores NMDA é um mecanismo celular pelo qual neurônios dopaminérgicos podem gerar rajadas. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos atuais, como injeção de corrente contínua ou tratamento farmacológico, é que somos capazes de determinar com precisão os efeitos da ativação de um receptor definido experimentalmente sobre a atividade elétrica de um neurônio vivo. Após extrair rapidamente o cérebro de uma rata Bragg dolly anestesiada, corte fatias horizontais de cérebro de 240 micrômetros usando um microtomo vibratório.À medida que as fatias são cortadas, utilize uma pipeta de transferência para colocá-las em uma câmara de incubação a 32 graus Celsius preenchida com fluido cerebroespinhal artificial até o momento de realizar os experimentos de gravação. O aparato de gravação intracelular é composto por um microscópio com objetivas configuradas para imagem de contraste de gradiente, um monitor, um sistema de perfusão, um amplificador Multi Clamp 700B, um conversor analógico-digital, um micromanipulador e uma etapa de cabeça. Um computador Mac Pro executa o software de aquisição de dados, Axo Graph X e o software Multi Clamp Commander ao lado do aparato de gravação intracelular e do computador Mac Pro encontra-se um computador Sun Microsystems executando Linux em tempo real, juntamente com seu conversor analógico-digital, que será utilizado com a técnica de clamp dinâmico.O aparato de gravação intracelular deve perfundir um fluido cerebroespinhal artificial a aproximadamente 35 graus Celsius. Se a fatia a ser gravada foi preparada horizontalmente, use uma pipeta de transferência para colocá-la em uma placa de Petri com fluido cerebroespinhal artificial e, com uma ferramenta de corte, divida a fatia ao longo da linha média. Em seguida, para realizar gravações eletrofisiológicas, use uma pipeta para transferir a fatia para o aparato de gravação intracelular.Utilizando o objetivo de 40 x, visualize aqui o neurônio-alvo, observando-se um neurônio dopaminérgico individual da substância negra. Observe o soma com formato elíptico e dois dendritos prolongando-se a partir dele. Com um puxador de micropipetas eletrônico P 97, prepare eletrodos com resistência de ponta entre quatro e 10 megaohms.Em seguida, utilizando uma agulha de seringa microfill, encha um eletrodo com solução interna. Insira o eletrodo cheio na meia-célula, conectada ao estágio inicial do amplificador, usando uma seringa conectada à meia-célula por um pequeno trecho de tubo. Aplique uma pequena quantidade de pressão positiva ao eletrodo de gravação.Sob orientação visual, posicione o eletrodo sobre o neurônio-alvo. Uma pequena reentrância será observada na superfície da célula. Aplique uma pequena quantidade de pressão negativa para formar um selo gigasseal no neurônio desejado.Aplicar sucção com a boca para romper o selo. Isso constitui uma gravação em célula inteira. Após o rompimento do selo, utilize a interface de software multi clamp commander para colocar o amplificador no modo de fixação de corrente, no qual nenhuma corrente pode ser injetada.Para aplicar uma condutância de NMDA nesta célula, comece executando o software RTXI no computador do clamp dinâmico. Em seguida, carregue um modelo personalizado contendo um receptor de NMDA na memória. Uma vez que o modelo tenha sido carregado na memória do RTXI, ele calculará em tempo real a corrente a ser injetada na célula usando a equação mostrada aqui, onde G-N-M-D-A é a condutância desejada em nanosiemens, definida como zero nanosiemens.Semens por padrão MG é a concentração de magnésio. E-N-M-D-A é o potencial de reversão para o receptor NMDA definido em zero milivolts, e VM é o potencial da membrana da célula medido a partir do amplificador em milivolts. Agora, com o cabo BNC padrão, conecte a saída do computador de clamp dinâmico à entrada de comando do amplificador com um conversor analógico para digital.Coloque o amplificador no modo padrão de fixação de corrente ic usando a interface de software Multi Clamp Commander. O RTXI foi configurado para receber a condutância desejada GFT a partir de um sinal de tensão do software de aquisição de dados Axo Graph X. Aqui executamos um protocolo simples no AXO Graph X no qual um degrau de condutância de um segundo de 40 nano Siemens é aplicado à célula.Um surto de potenciais de ação é evocado em resposta ao degrau de condutância utilizando a configuração descrita neste vídeo, foi realizada uma gravação somática em célula inteira de um neurônio dopaminérgico na substância nigra pars compacta. As células dopaminérgicas geralmente disparam espontaneamente em taxas baixas com um padrão semelhante ao de marcapasso. Um surto de potenciais de ação pode ser evocado pela aplicação fásica de uma condutância do receptor NMDA com clampeamento dinâmico.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como aplicar uma condutância NMDA em um neurônio dopaminérgico vivo em uma fatia cerebral isolada. No entanto, esta técnica pode ser utilizada para qualquer tipo celular que possa ser registrado usando técnicas eletrofisiológicas padrão. De forma semelhante, o clamp dinâmico pode ser estendido para imitar os efeitos elétricos, mas uma ampla variedade de tipos de receptores.Esperamos que este vídeo tenha sido útil para demonstrar o que é a técnica de clamp dinâmico e como a utilizamos em nosso laboratório. Portanto, obrigado por assistir.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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