Um alelo-específico do ensaio Expressão Gênica para testar as bases funcionais das Associações de Genética

O objetivo geral do experimento a seguir é testar se uma variante específica de DNA, como uma associada à doença, tem efeito sobre a expressão de um gene específico. Isso é alcançado pela seleção de linhagens celulares que são heterozigotas tanto para essa variante quanto para uma mutação pontual no gene de interesse. Como segundo passo, o DNA e o RNA são extraídos das células e depois utilizados como molde para uma reação de extensão primária específica de alelo.

Os produtos da extensão primária subsequentes são analisados por espectrometria de massas para quantificar a abundância relativa dos dois alelos. São obtidos resultados que indicam se a variante de DNA original associada a uma doença também está associada a uma diferença na expressão gênica com base em medições quantitativas específicas de alelos por espectrometria de massas. As principais vantagens desta técnica são que, ao contrário de um ensaio de gene repórter com luciferase, ela não requer manipulação molecular e mede os níveis endógenos de expressão gênica.

Além disso, somos capazes de comparar os níveis de expressão entre os dois alelos de maneira internamente controlada, o que elimina parte da variabilidade experimental. Este método ajuda-nos a responder perguntas fundamentais no campo da genética humana, como os mecanismos moleculares subjacentes às associações genéticas. Primeiramente, concebemos esta ideia ao identificar uma associação genética que abrange três genes e não conseguimos restringir o sinal a apenas um deles.

Por meio de mapeamento genético adicional. As células utilizadas para este ensaio devem expressar o gene de interesse, bem como atender a dois requisitos genotípicos fundamentais. Elas precisam ser heterozigotas tanto para as sequências de DNA associadas à doença quanto para marcadores de DNA, os quais podem distinguir os transcritos com base em sua origem cromossômica. Na estratégia de seleção de linhagens celulares mostrada aqui, as linhagens celulares A e B são heterozigotas para um marcador codificante transcrito, representado por triângulos.

No entanto, a linhagem Omnicell A é heterozigótica para a sequência de DNA associada à doença, chamada variante de DNA de risco, representada por círculos. O alelo azul da variante de risco está associado a um nível mais baixo de transcrição. Após selecionar a cultura da linhagem celular, cultivaremos as células em um frasco de acordo com as especificações do fornecedor; neste caso, usaremos fibroblastos nesta demonstração. Embora este ensaio seja igualmente aplicável a outros tipos celulares, incluindo células primárias, prepare dois pratos de Petri de 10 centímetros para extrações de DNA e RNA, respectivamente.

Quando as células atingirem 80% de confluência, podem ser colhidas para extrações de DNA e RNA utilizando métodos padrão, incluindo kits comercialmente disponíveis que sejam apropriados para o tipo celular selecionado. Antes de realizar este ensaio, projete dois pares de iniciadores de PCR para cada marcador de DNA, um par para amplificação de DNA genômico e outro para amplificação de cDNA; posicione os iniciadores direto e reverso para amplificação de cDNA em éxons diferentes para evitar contaminação genômica; projete os iniciadores para obter um produto de PCR na faixa de 100 a 500 pares de bases de comprimento para cada linhagem celular; prepare reações de PCR de oito microlitros. Quatro reações independentes para amplificação de DNA genômico e quatro reações independentes para amplificação de cDNA a cada vez.

Micro relacionado à reação de PCR contém a enzima DNA polimerase MLA, dNTPs, primers, cloreto de magnésio e, ou DNA genômico ou cDNA. Realize as reações de PCR sob as condições otimizadas para cada par de primers, mantendo o número de ciclos na fase linear de amplificação. Após a conclusão das reações de PCR, remova os primers de PCR e os dNTPs em excesso adicionando exonuclease I e fosfatase alcalina de camarão (SAP) a cada produto de PCR e incubando a 37 graus Celsius por 20 minutos, seguido de 15 minutos a 85 graus Celsius.

Pipete dois alíquotas de cada produto de PCR em uma placa de 384 poços, de modo que oito medições estejam disponíveis para cada amostra. No total, 16 alíquotas para o ensaio de extensão primário. Projete o iniciador de extensão com o software de design de ensaio, de forma que o mesmo iniciador possa ser utilizado tanto para produtos genômicos quanto para C-D-N-A-P-C-R.

Especifique o comprimento do iniciador na faixa de 14 a 18 pares de bases. Realize a reação de extensão primária com a mistura apropriada de três terminadores desoxinucleotídicos e um desoxinucleotídeo. Uma reação típica de extensão primária inclui uma etapa inicial a 94 graus Celsius por dois minutos, seguida por 40 ciclos de 94 graus Celsius por cinco segundos, 52 graus Celsius por cinco segundos e 72 graus Celsius por cinco segundos.

Por fim, os oligonucleotídeos estendidos são quantificados por espectrometria de massas com ionização por dessorção a laser assistida por matriz e tempo de voo, utilizando um espectrômetro de massas spectro reader. Um ponto fundamental deste protocolo é utilizar diversas estratégias para controlar o ruído experimental e descartar artefatos. É realmente importante repetir o experimento pelo menos três vezes.

O melhor controle para o experimento é utilizar uma linhagem celular heterozigótica para o ensaio de snip do revestimento para extensão primária, mas que não carregue o alelo associado à doença. Além disso, projete ensaios para marcadores codificantes de DNA transcrito alternativos. Se estes não estiverem disponíveis, um controle adicional pode ser fornecido por pares alternativos de primers de PCR que visem éxons diferentes para o ensaio de extensão primária.

Um controle interno pode ser fornecido pelo desenho de iniciadores de extensão e hibridação com ambas as fitas, direta e reversa. Um exemplo de análise de expressão alélica específica é mostrado aqui com exemplos de traçados de espectrometria de massas. Esta figura mostra os resultados da análise de quatro produtos primários de extensão específicos para alelos realizados em quatro modelos diferentes.

Os dois gráficos superiores representam os resultados obtidos a partir da análise de DNA genômico de duas linhagens celulares diferentes, ambas heterozigotas para um polimorfismo codificante transcrito. No entanto, apenas a linhagem celular A é heterozigota para a variante de DNA de risco. Esses dois gráficos inferiores representam os resultados obtidos a partir da análise do cDNA gerado a partir das mesmas linhagens celulares como resultado de um artefato experimental.

O primeiro pico é sempre mais alto que o segundo pico, mesmo na análise genômica. Portanto, os resultados da análise genômica são utilizados para normalizar os dados de cDNA. A análise estatística é realizada mediante a extração de todo o relatório de tipagem ELO dentro do tipo de software mass array.

Este relatório fornece dados sobre a área do pico, e mostramos aqui um exemplo relativo a duas linhagens celulares, célula A e célula B heterozigotas para uma mutação pontual codificante, mas onde apenas a célula A é heterozigota para um marcador associado à doença. As colunas em destaque em cinza são geradas diretamente pelo software, enquanto as colunas em destaque em verde são derivadas manualmente para cada célula. Há oito medições tanto para o cDNA quanto para o DNA genômico.

O software calculará a área sob cada pico do espectro, que representa a abundância de cada um dos dois alelos. A razão entre os alelos é calculada dividindo a área do alelo um pela área do alelo dois para cada amostra de cDNA e genômica. Uma média e o erro padrão são calculados a partir das oito medições.

Um alto erro padrão maior que 0,1 indica que as medições não são consistentes e devem ser descartadas. Por fim, a razão média de cDNA é normalizada utilizando a razão média de DNA genômico para estimar o desvio em relação a uma razão de um, o que é esperado quando não há diferença na expressão alélica específica. A razão normalizada é diferente de um na célula A, mas próxima de um na célula B; os dados sugerem que a linhagem celular A possui uma variante de DNA em fase com o alelo medido pelo segundo pico, o que reduz a expressão do gene em análise.

A linhagem celular B fornece um controle negativo muito conveniente. É realmente importante definir variantes genéticas informativas e definir controles experimentais apropriados ao tentar este procedimento. Outros métodos podem ser utilizados, como o haplótipo, a imunoprecipitação de cromatina específica, que ajudam a responder perguntas como onde existem variantes genéticas para as quais não há marcadores transcritos para usar na análise da expressão gênica específica de alelo.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como analisar RNA de maneira específica para alelos e como utilizar isso para compreender variantes funcionais geneticamente importantes.