Farmacologia Comportamental no condicionamento clássico da Resposta Extensão Proboscis em Abelhas ( Apis mellifera)

O objetivo geral deste procedimento é estudar os mecanismos moleculares subjacentes à aprendizagem e à formação da memória. Em abelhas melíferas, o primeiro passo é coletar abelhas em voo livre a partir de suas colmeias. Em seguida, as abelhas são imobilizadas em tubos de plástico.

O terceiro passo do procedimento é realizar o condicionamento clássico. Drogas podem ser injetadas em determinados momentos ao redor do condicionamento para estudar seus efeitos na aprendizagem e formação da memória. O passo final do procedimento é testar a retenção da memória.

Em última análise, alterações no comportamento após o tratamento com medicamentos podem revelar os mecanismos moleculares subjacentes à formação da aprendizagem e da memória. Em abelhas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do aprendizado e da memória, revelando os mecanismos moleculares da formação da memória.

Em geral, pesquisadores novos neste método terão dificuldades porque o momento da apresentação dos estímulos durante o condicionamento e a recuperação da memória deve ser exato. Além disso, o regime alimentar é crítico. O procedimento será demonstrado por Cutting Gearing e Johannes Faberg para estudantes de pós-graduação do meu laboratório. No dia anterior ao experimento, colete abelhas entre as 14h e 16h usando uma pirâmide de plexiglás permeável à luz ultravioleta.

De volta ao laboratório, coloque a pirâmide sobre sua base e escureça as paredes com uma toalha, deixando o ápice descoberto. Abra o ápice e segure um frasco de vidro sobre a abertura, permitindo que uma única abelha entre no frasco antes de fechá-lo novamente. Continue este procedimento até que todas as abelhas tenham sido transferidas para um frasco de vidro no outono e no inverno.

Quando as abelhas não estão voando no exterior, uma colmeia é mantida dentro de uma estufa em uma rede; abelhas individuais são capturadas diretamente da rede. Usando um frasco de vidro por abelha, imobilize a abelha resfriando o frasco em gelo por dois minutos e meio a três minutos e meio. Observe a abelha cuidadosamente e remova-a do gelo assim que parar de se mover.

Imobilize a abelha em um pequeno tubo de plástico usando fita adesiva. Certifique-se de que a abelha consiga mover livremente suas asas, mas não sua cabeça, tórax ou pernas. Também é importante não comprimir o pescoço.

Uma vez que uma abelha esteja preparada, coloque o tubo em um orifício numerado no suporte. Para melhor manipulação e identificação.

Os tubos são sempre devolvidos ao mesmo furo. Após o manuseio, alimente as abelhas entre as 16 e as 18 horas em um local distinto do local de condicionamento. Elicite a resposta de extensão do probóscide ou PER ao tocar as abelhas e suas antenas.

Com uma solução de sacarose, permita que a abelha consuma uma gota de aproximadamente quatro microlitros da solução de SRAs. Certifique-se de não manchar as antenas da abelha, o pro bois ou o tubo de plástico. Alimente cada abelha até que ela não mais o faça.

Mostre uma PER rápida e confiável quando as antenas forem tocadas com a solução. Nas noites subsequentes do experimento, alimente cada abelha quatro vezes com uma gota de solução de sacarose. Encha uma tigela de plástico com água da torneira a uma altura aproximada de 0,5 a um centímetro.

Coloque o suporte com as abelhas presas na tigela usando placas lisas como plataforma. Cubra a tigela com papelão e armazene em temperatura ambiente durante a noite. As abelhas passam por condicionamento olfativo por volta das 10:00 da manhã no dia seguinte à coleta.

30 minutos antes do início do experimento. Coloque a bandeja com as abelhas presas perto do local de condicionamento, mas longe da abertura do tubo de exaustão onde as abelhas serão treinadas. Em seguida, prepare o estímulo condicionado trabalhando em uma cabine de segurança.

Use uma ponteira com filtro para pipetar quatro microlitros de óleo de cravo em um papel-filtro redondo. Coloque o papel-filtro perfumado em uma seringa de 20 mililitros e insira o êmbolo. Configure o aparelho de áudio que emitirá um sinal acústico para o experimentador.

Isso garante o cronometragem preciso do estímulo, início do estímulo, término do estímulo, duração e posicionamento. Prepare-se para registrar o comportamento da abelha durante todo o condicionamento. Uma pontuação positiva é atribuída se a abelha estender seu SSIS entre o início do estímulo condicionado e a apresentação do estímulo incondicionado.

Atravessar uma linha virtual entre as mandíbulas abertas Para iniciar um ensaio de aquisição, selecione a abelha a ser treinada e posicione-a em frente ao exaustor por 10 segundos. Pouco antes do final desse intervalo de dez segundos, coloque a seringa contendo o odor a três centímetros das abelhas e antenas. Apresente o odor durante cinco segundos empurrando 20 mililitros de ar através da seringa.

Após três segundos, introduza o estímulo incondicionado tocando a parte ventral da região distal das cerdas de ambas as antenas com uma solução de sacarose, usando um palito úmido. Tendo o cuidado de não depositar a solução sobre as abelhas e as antenas, permite-se então que a abelha lamba o palito. Esse estímulo composto dura quatro segundos, após os quais as abelhas são removidas do contexto de treinamento e devolvidas à prateleira.

13 segundos após a apresentação do estímulo condicionado, um ensaio de treinamento dura 28 segundos. Retorne a abelha ao local de treinamento após um intervalo interensaio de 10 minutos. Realize o segundo dos três ensaios conforme mostrado anteriormente e aguarde mais 10 minutos antes de realizar o último emparelhamento.

Após a conclusão do treinamento diário, coloque as grades novamente na tigela. Lembre-se de alimentar cada abelha quatro vezes com uma gota de quatro microlitros de solução de sacarose entre 16h e 18h. Como demonstrado anteriormente, testes de retenção podem ser realizados em intervalos que variam de minutos a dias após o treinamento. Prepare-se para o teste de memória colocando a grade de abelhas próximo ao local de condicionamento por 30 minutos.

Inicie o teste colocando uma abelha diante do exaustor por 10 segundos. Apresente o estímulo condicionado por cinco segundos e observe a ocorrência de uma REP. Após a conclusão dos testes do dia, devolva as grades à tigela.

Lembre-se de alimentar cada abelha quatro vezes com uma gota de quatro microlitros de solução de sacarose entre as 16h e as 18h, conforme demonstrado anteriormente. Ao final do experimento completo, verifique se a abelha ainda é capaz de estender o probóscide tocando as antenas com a solução de SRAs para que seja incluída na análise; as abelhas devem sobreviver a todo o experimento e apresentar um PER intacto. Em alguns estudos, injeções sistêmicas são utilizadas para investigar o efeito de intervenções farmacológicas sobre a memória olfativa. Essas injeções podem ser administradas em diferentes momentos, dependendo do delineamento do experimento.

Para começar, faça um pequeno orifício na cutícula da parte posterior do S scootin, próximo à fissura do S scootle acima do músculo voador, utilizando uma agulha hipodérmica descartável. Em seguida, encha um tubo capilar de vidro com um microlitro da solução a ser testada. Insira o capilar no orifício na cutícula e injete a solução no músculo voador.

Experimentadores treinados são capazes de injetar uma abelha a cada 30 segundos, permitindo um cronometragem preciso da injeção e do condicionamento. Dois experimentos são apresentados aqui. O primeiro experimento examina o impacto de uma injeção sistêmica de soro fisiológico administrada antes do treinamento sobre a aprendizagem de uma memória.

Existem três grupos neste estudo: um grupo que não recebe tratamento, um grupo que recebe uma injeção sistêmica de um microlitro de solução salina tamponada com fosfato ou um grupo simulado. Esses tratamentos foram administrados 30 minutos antes do treinamento, mostrado aqui à esquerda. A porcentagem de animais que exibiram a resposta condicionada durante a aquisição aumentou ao longo dos três ensaios de treinamento, sem diferenças entre os grupos.

Os gráficos de barras à direita mostram que nem a injeção de PBS nem a lesão simulada afetaram a retenção da memória. Vinte e quatro horas após o treinamento, no segundo experimento, as injeções foram administradas 40 minutos após o treinamento, e as abelhas foram divididas em um grupo que recebeu solução salina e outro que recebeu um microlitro do inibidor da síntese de proteínas e eritromicina. Os gráficos de barras à direita mostram uma clara diminuição na retenção da memória em abelhas que receberam anisomicina. Esses resultados destacam a importância da síntese de proteínas na formação da memória olfativa.

Após este procedimento, podem ser realizadas gravações eletrofisiológicas e eletrofisiológicas para responder a questões adicionais, como qual é a base neurofisiológica da aprendizagem e da formação da memória após o seu desenvolvimento? Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de estudo da aprendizagem e da memória explorassem os mecanismos moleculares e neurofisiológicos envolvidos na formação da memória na abelha melífera.