Cristalização de proteínas para cristalografia de raios X

O objetivo geral deste procedimento é produzir cristais de proteína para experimentos de difração de raios-X aqui. Três técnicas diferentes para triagem de cristal são demonstradas, métodos de cristalização por difusão de vapor, incluindo gota suspensa e gota sentada, bem como métodos de cristalização de micro lotes são descritos para cristalização por difusão de vapor. Os poços estão cheios de precipitante.

Em seguida, uma alta concentração de amostra de proteína purificada é misturada com o agente precipitante. A gota misturada é então selada em um poço contendo a solução precipitante. A cristalização em micro lotes começa com o enchimento do poço com óleo de parafina.

A proteína é então carregada nos poços, seguida pela solução precipitante. A etapa final de todos os métodos é deixar o sistema se equilibrar e acompanhar a aparência e o crescimento do cristal dentro das gotas. Em última análise, os cristais podem ser obtidos a partir desta técnica e o padrão de difração de proteínas pode ser determinado usando uma fonte de raios-x com um detector adequado.

Olá, sou Sal do laboratório do Professor Yoga Motis no Departamento de Biofísica Molecular e Bioquímica da Universidade de Yale. Hoje vamos mostrar um procedimento para a cristalização de uma proteína purificada. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a base estrutural da infecção viral.

Então, vamos começar e cultivar alguns cristais. Para identificar um método de cristalização para uma macromolécula de escolha, as triagens iniciais podem ser realizadas usando soluções de cristalização disponíveis comercialmente que são escolhidas para explorar o método fatorial incompleto de matriz esparsa de condições de teste. Essas condições são selecionadas com base em condições de cristalização conhecidas e comumente bem-sucedidas para macromoléculas.

Uma vez que a condição de cristalização é conhecida, uma tela estreita pode ser montada variando a concentração do precipitante em pH em torno do golpe original. Normalmente, as condições de cristalização usadas para essas telas consistem em um ataque de agente precipitante e um tampão para definir o pH, todas as soluções de estoque devem ser filtradas através de um filtro de 0,22 mícron para esta demonstração. As condições de cristalização previamente identificadas para o lisossomo de frango são usadas com cloreto de sódio, pois o precipitante inicia o procedimento preparando soluções de um mililitro de várias concentrações de cloreto de sódio em acetato de sódio 0,1 molar de vários phs.

Em seguida, descongele, a amostra de proteína é armazenada a 80 graus Celsius negativos e mantenha-a no gelo. As concentrações típicas de proteína estão na faixa de cinco a 50 miligramas por mililitro com concentrações mais altas, geralmente dando melhores resultados. Aqui, uma solução de 50 miligramas por mililitro de lisossomo de ovo de galinha em acetato de sódio 0,02 molar pH 4,9 é usada.

Centrifugar a amostra durante 15 minutos a 18 000 g e quatro graus Celsius para remover quaisquer proteínas parcialmente agregadas ou precipitar da etapa de descongelação. Esses agregados podem interferir no crescimento dos cristais e promover uma maior agregação. Após centrifugação.

Determinar a concentração de proteínas a partir da sua absorvância a 280 nanómetros utilizando um fotómetro de espectros UV. A concentração de proteína pode ser calculada a partir da leitura de absorbância e do coeficiente de extinção da proteína. Assim que a amostra de proteína estiver pronta, encha uma bandeja de cristalização de gotas sentadas de 24 poços com 500 microlitros de solução precipitante de acordo com o mapa da bandeja.

Crie um anel de graxa de silicone ao redor da borda de cada poço sem fechar perfeitamente o anel para que o ar possa escapar pelo poço. Teto. Limpe a corrediça da tampa com spray de ar condensado ou um pano profissional para evitar poeira, o que facilitará a interpretação das gotas de cristalização e eliminará contaminações. O próximo passo é pipetar volumes iguais da amostra de proteína e da solução do reservatório para a lâmina de cobertura.

No entanto, diferentes volumes de proteína e precipitante podem ser tentados como parte do processo de otimização usando mais proteína do que precipitante resulta em uma concentração líquida da proteína na gota equilibrada, o que pode ser desejável para amostras de proteína dute ou para retardar a nucleação ou crescimento de cristais. Para esta demonstração, dois microlitros de 50 miligramas por mililitro de lisozima em acetato de sódio 0,02 molar. O pH quatro é carregado no centro da lâmina de cobertura, seguido por dois microlitros de solução de cristalização.

Ao pipetar a proteína e a solução do reservatório na lâmina de cobertura, tenha muito cuidado para evitar a formação de bolhas, que geralmente ocorre quando o ar é soprado para fora da pipeta. Misture suavemente a gota para ajudar a evitar a precipitação prematura de proteínas devido às altas concentrações localmente altas de precipitantes na gota, a mistura é particularmente importante para precipitantes viscosos, como polietilenoglicol, usando pinças. Vire a corrediça da tampa suavemente e coloque-a no anel de graxa em cima do, faça isso de maneira direcional para que o ar possa escapar do poço.

Caso contrário, o ar pode elevar a corrediça da tampa, comprometendo a vedação do poço. Passe para o próximo poço até que a bandeja esteja completa. Uma vez que a bandeja tenha sido configurada, inspecione-a visualmente, eliminando partículas de poeira e outros contaminantes que podem reduzir a identificação de falsos positivos de cristais de proteína.

Use uma planilha de pontuação para documentar o experimento. Em seguida, coloque a bandeja na temperatura de incubação desejada, geralmente entre quatro graus Celsius e a temperatura ambiente. A temperatura mais bem-sucedida é de 20 graus Celsius.

Tome cuidado para manusear a bandeja com cuidado e evitar vibrações trêmulas ou mudanças de temperatura durante a transferência ou incubação que possam impedir o crescimento do cristal ou afetar negativamente a qualidade do cristal. Verifique se há cristais na bandeja no dia seguinte e a cada poucos dias, sempre manuseando as bandejas com cuidado. Documente quaisquer descobertas e morfologias soltas em uma bandeja Folha de pontuação específica.

Os cristais normalmente levam de dois a cinco dias para aparecer, embora os cristais ocasionalmente apareçam quase imediatamente ou até vários meses depois. Uma vez que as condições de cristalização tenham sido identificadas e a taxa de crescimento dos cristais seja conhecida, é melhor deixar as bandejas intactas até que os cristais apareçam e cresçam até pelo menos metade de seu tamanho final. Deixar as bandejas intactas pode reduzir o número de eventos de nucleação de cristais, resultando em um número menor de cristais maiores para a cristalização da gota sentada, siga o mesmo procedimento da gota suspensa, exceto que usaremos uma bandeja de gota de 24 poços na qual as lâminas de cobertura não são necessárias.

Em vez disso, o poço contém uma prateleira na qual a proteína e o precipitante são misturados pipeta, dois microlitros de 50 miligramas por mililitro de solução de lisozima no centro da prateleira, evitando a geração de bolhas de ar. Em seguida, adicione dois microlitros de solução precipitante à amostra após a configuração da bandeja. Sele os poços com fita óptica com gota sentada.

Não são necessários slides de cobertura. Continue a incubação e a pontuação do cristal conforme descrito para a queda suspensa. Para executar um procedimento de micro lote.

Preparar a solução de cristalização e a proteína conforme descrito para o procedimento de gota suspensa. Obtenha uma nova bandeja de micro lote e spray de ar para evitar poeira e outras partículas grandes na bandeja de micro lote. Adicione óleo de parafina a cada poço a uma profundidade de três milímetros.

Em seguida, remova o excesso de óleo. Em seguida, carregue um microlitro da solução de proteína no poço pré-cheio, certificando-se de que a gota afunde no fundo do poço. Em seguida, coloque um microlitro de solução precipitante no poço.

Certifique-se de que a gota afunde no fundo do poço e se funde com a gota de proteína. Passe para o próximo poço até que a bandeja esteja completa e continue com a incubação e a análise de cristal conforme descrito aqui. Resultados típicos da cristalização de proteínas.

Experimentos são mostrados. A precipitação amorfa ocorre quando a proteína e/ou o precipitante estão em alta concentração. Por outro lado, as gotas insaturadas geralmente permanecem claras.

A separação de fases pode ocorrer se a proteína ou detergente se separar para uma fase diferente quando misturado com certos precipitantes em alta concentração. Em condições ideais, os cristais de proteína devem formar Arabidopsis csn. Sete cristais de proteína que foram obtidos em polietilenoglicol 8.000 e acetato de magnésio aparecem em forma de bastonete.

Os cristais também mostrados são cristais de proteína lisossomal que foram obtidos em um molar, cloreto de sódio e acetato de sódio. pH 4,9. Este filme de lapso de tempo demonstra que os cristais de lisossomo crescem em grandes prismas dentro de algumas horas após a configuração ao usar o método de gota suspensa.

Acabamos de mostrar como configurar um experimento de proteína quando você está fazendo este procedimento. É importante trabalhar em um ambiente com controle constante de temperatura e umidade, pois a alta umidade ajuda a minimizar a evaporação da gota, tente adotar uma técnica que minimize a exposição da gota ao ar livre. Por esse motivo, é essencial operar em um ambiente de trabalho bem organizado.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.