Profiling isotópicas estáveis ​​de fluxo metabólico intermediário na fase de desenvolvimento e Adultos Caenorhabditis elegans

O objetivo geral do experimento a seguir é monitorar de forma não invasiva alterações metabólicas em tempo real, ao nível do organismo inteiro, nas vias da glicólise, do metabolismo do piruvato e do ciclo do ácido tricarboxílico, causadas por alterações individuais em vias metabólicas, modificações genéticas e/ou tratamentos farmacológicos. Isso é alcançado mediante a administração de isótopos estáveis a nematoides vivos, proporcionando enriquecimento isotópico suficiente em diversos metabólitos, permitindo a quantificação de alterações genéticas e/ou farmacológicas nas vias metabólicas intermediárias. Como segundo passo, a incorporação isotópica no dióxido de carbono atmosférico e dissolvido é medida por espectrometria de massa com razão de gases, o que fornece uma avaliação mais direta do fluxo metabólico intermediário em períodos curtos de tempo.

Em seguida, as amostras são processadas para análise de aminoácidos livres em vermes inteiros por HPLC, bem como para enriquecimento isotópico em aminoácidos e ácidos orgânicos por GCMS, com o objetivo de quantificar alterações no fluxo metabólico em nematoides. Após a exposição ao isótopo estável, são obtidos resultados que mostram os efeitos de diferentes durações de exposição ao isótopo, eliminação bacteriana e métodos alternativos de disruptura de vermes em vermes selvagens, a fim de investigar a abundância isotópica em metabólitos intermediários. Este método pode fornecer informações sobre a regulação do metabolismo intermediário.

Ele também pode ser aplicado aos nossos sistemas, como linhagens celulares de mamíferos e tecidos. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao observar anormalidades consistentes na análise de aminoácidos livres em vermes por HPLC, que sugeriam um fluxo metabólico intermediário prejudicado em alterações respiratórias primárias da função. Para iniciar este procedimento.

Vermez que foram expostos a um precursor metabólico marcado com isótopo estável durante o desenvolvimento ou na idade adulta são coletados em um tubo plástico de centrífuga de 1,5 mililitro. Geralmente diluímos os vermes para uma concentração de 1000 vermes por um mililitro. Adicione ácido perclórico 60% contendo ácido épsilon-aminocapróico como padrão interno aos vermes, até uma concentração final de 4% de ácido perclórico e 20 nanomolar do padrão interno.

Deixe o verme sedimentar por gravidade por cinco minutos, então remova e guarde o sobrenadante em outro tubo. O próximo passo é um dos aspectos mais críticos deste procedimento. Os vermes devem ser completamente rompidos por peneiração antes da análise de metabólitos livres. Usando um homogeneizador plástico e uma broca motorizada, triture as amostras de vermes por 15 segundos.

Confirme visualmente a ruptura dos vermes por microscopia de luz e repita a trituração, se necessário. Nesta imagem, os painéis A e B mostram vermes antes da trituração. Em contraste com os painéis C e D, que mostram vermes após a trituração, transfira o sobrenadante previamente salvo para os tubos plásticos de centrífuga de 1,5 mililitro com o homogenato de vermes e centrifugue.

As amostras a 2.250 RPM, 1300 ×g, durante cinco minutos. Após a centrifugação, transfira o sobrenadante para um novo tubo de vidro de sete mililitros. Guarde o pellet para uso posterior em um ensaio de concentração proteica.

Agora, adicione quatro hidróxido de potássio normal ao SUPERNAT até que a faixa de pH das amostras seja de sete a oito. Centrifugue as amostras neutralizadas nos tubos de vidro de sete mililitros a 2.250 RPM (1.300 ×g) durante cinco minutos. Para remover os sais, transfira o sobrenadante de cada amostra para um tubo de vidro de sete mililitros novo. As amostras neutralizadas podem agora ser preparadas para a quantificação de metabólitos por cromatografia líquida de alta eficiência ou HPLC e cromatografia gasosa com espectrometria de massas ou GCMS para HPLC.

Se pare 50 microlitros de cada amostra neutralizada para injeção direta na CLAE. A quantificação de aminoácidos livres é realizada utilizando pré-derivatização com aldeído e detecção fluorescente. Como descrito anteriormente, as amostras neutralizadas restantes passarão por extração utilizando uma resina de troca iônica para GCMS, a fim de determinar o enriquecimento isotópico em aminoácidos e ácidos orgânicos, conforme mostrado na próxima seção.

Para preparar as esferas, adicione um ácido clorídrico normal separadamente a esferas G1 e G50. Em béqueres de um litro, agite cada frasco por 30 minutos com um agitador magnético. Depois disso, lave as esferas com água desionizada 10 vezes até que o pH das águas de lavagem seja igual ao pH da água.

Em seguida, apresentaremos nosso método para preparar colunas personalizadas de baixo custo utilizando pipetas de vidro. Colunas pré-fabricadas também estão disponíveis comercialmente. Para preparar uma coluna, utilize pinças para inserir um tampão de algodão logo acima da parte mais estreita da ponta de uma pipeta de Pasteur, utilizando esferas G uma para extração de ácidos orgânicos e esferas G 50.

Para a extração de aminoácidos, preencha cada coluna até aproximadamente um terço da altura da coluna. Se uma amostra já estiver em pH neutro, nada é adicionado à amostra antes de aplicá-la na coluna AG 1. Para extrair ácidos orgânicos e extrair aminoácidos, adicione um mililitro de ácido clorídrico 0,1 normal à amostra antes de aplicá-la na coluna AG 50.

Agora aplique as amostras previamente preparadas e neutralizadas a cada coluna. Lave cada coluna 10 vezes com água até que os lavados fiquem neutros. Após a conclusão da lavagem, elua cada coluna para frascos de amostra de vidro novos e rotulados de quatro mililitros. Para a extração de ácidos orgânicos, adicione três mililitros de ácido clorídrico três normal à coluna AG uma.

Isso permite a análise do enriquecimento isotópico no número total de carbonos marcados entre espécies de três carbonos, espécies de quatro carbonos, espécies de cinco carbonos e espécies de seis carbonos. Para extração de aminoácidos, adicione três mililitros de hidróxido de amônio quatro normal a uma coluna G 50. Isso permite a análise do enriquecimento isotópico no número total de carbonos marcados entre espécies de três carbonos e espécies de cinco carbonos.

Após a conclusão das extrações de ácido orgânico e aminoácido, coloque os frascos de amostra em um evaporador reativo com três placas durante a noite até que sequem completamente. As amostras são então derivatizadas e analisadas por GCMS conforme detalhado no texto do Protocolo. Inicie este procedimento transferindo mil vermes adultos jovens para uma placa NGM de 35 milímetros contendo glicose universalmente marcada com carbono 13 e E. coli.

Em seguida, coloque a placa NGM experimental sem a tampa. Dentro de uma câmara de vidro personalizada equipada com uma válvula de três vias bem vedada, que permite a amostragem e substituição precisas da atmosfera. Cubra o vedante onde o disco de vidro opticamente transparente assenta sobre a placa com graxa de alto vácuo.

Selar a câmara com o disco de vidro. Registrar o tempo. No tempo zero e 30 minutos depois, usar uma seringa de 20 mililitros para coletar 10 mililitros da atmosfera da câmara de vidro pela torneira de três vias.

Feche a torneira de fechamento da câmara. Após a coleta da amostra, transfira a amostra para um tubo de vidro a vácuo vermelho contendo um mililitro de bicarbonato de sódio em hidróxido de sódio 0,1 molar. Em seguida, injete 10 mililitros de ar na câmara de vidro através da torneira de três vias. Usando uma seringa de 20 mililitros, feche a torneira de fechamento da câmara após reinjetar a atmosfera e, antes de retomar a incubação, repita a coleta da atmosfera da câmara de vidro aos 60, 90 e 120 minutos.

Analise essas amostras atmosféricas de dióxido de carbono quanto ao enriquecimento de carbono marcado utilizando um espectrômetro de relação gasosa de massas conforme descrito no texto do Protocolo. Os isótopos estáveis são bem incorporados após duas horas em vermes adultos jovens, como evidenciado aqui pelo carbono marcado medido no dióxido de carbono atmosférico e no dióxido de carbono dissolvido nos vermes alimentados com OP50 E. coli viva ou morta por irradiação com UV. A proporção de dióxido de carbono com carbono 13 para dióxido de carbono com carbono 12 foi maior na fração de dióxido de carbono dissolvido nos vermes em relação ao dióxido de carbono atmosférico liberado. Observou-se que a exposição prolongada a um isótopo estável desde o período larval e subsequente eliminação dos vermes em meio NGM sem bactérias aumentou o enriquecimento isotópico de glutamato livre em vermes adultos jovens.

Neste gráfico, L1 representa vermes alimentados com glicose marcada universalmente com carbono 13 e bactérias OP50 desde o estágio larval L1 até o estágio de adulto jovem com 959 células; YA representa vermes alimentados com glicose com carbono 13 e bactérias OP50 por 48 horas, iniciando quando atingiram o primeiro dia de postura de ovos no estágio de adulto jovem. O eixo X indica o número total de átomos de carbono marcados em cada espécie de glutamato, e o eixo Y indica o percentual de enriquecimento. Todos os animais foram descontaminados de excesso de marcação isotópica antes da preparação da amostra para análises subsequentes.

Para as análises por GCMS, as barras verdes indicam vermes descontaminados após exposição isotópica mediante alimentação com E. coli OP50 em placas de NGM por duas horas antes da extração com PCA. As barras azuis e cinzas indicam vermes descontaminados após exposição isotópica em placas de NGM sem bactérias por duas ou seis horas, respectivamente, antes da extração com PCA, independentemente do período de exposição isotópica. Nenhuma diferença significativa no enriquecimento isotópico em metabólitos intermediários foi observada quando os animais foram descontaminados em placas por duas ou seis horas.

Em ambos os cursos de exposição isotópica, observou-se menor enriquecimento isotópico em metabólitos intermediários quando os animais foram submetidos à depuração com bactérias não marcadas por duas horas. Portanto, o protocolo de depuração ideal para vermes cultivados em placas NGM com bactérias espalhadas e isótopo foi determinado como sendo a depuração por duas horas em placas NGM sem bactérias espalhadas, a fim de otimizar a porcentagem de enriquecimento em metabólitos intermediários. Após tratamento por 24 horas em cultura líquida com uma glicose 13C de seis carbonos na ausência de bactérias.

Foi realizada uma comparação entre amostras de vermes rompidas apenas por sonicação ou por sonicação mais moagem, conforme mostrado nesta figura. Verme rompidos por sonicação mais moagem apresentaram maior enriquecimento isotópico do que amostras rompidas apenas por sonicação, alimentando-se finalmente com um precursor isotópico estável durante o desenvolvimento a partir do estágio L1 em placas ou a partir do primeiro dia de postura de ovos, como adultos jovens, por 24 horas em cultura líquida. Permite análise sensível do enriquecimento isotópico entre metabólitos indicativos de fluxo através da glicólise, metabolismo do piruvato na via do ciclo do ácido tricarboxílico após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisas sobre doenças mitocondriais, explorando o fluxo metabólico intermediário em *C. elegans*. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o perfilamento isotópico estável do metabolismo intermediário e do fluxo metabólico nos nematoides, *C. elegans*.