Profiling isotópicas estáveis ​​de fluxo metabólico intermediário na fase de desenvolvimento e Adultos Caenorhabditis elegans

O objetivo geral do experimento a seguir é monitorar de forma não invasiva as alterações metabólicas em tempo real em todo o nível do animal na glicólise, no metabolismo do piruvato e no ciclo do ácido tricarboxílico que são causadas por vias metabólicas individuais, alterações genéticas e/ou tratamentos farmacológicos. Isso é obtido alimentando isótopos estáveis com nematóides vivos para fornecer enriquecimento isotópico suficiente em mais metabólitos para permitir a quantificação de alterações genéticas e/ou farmacológicas em vias metabólicas intermediárias. Como segunda etapa, a incorporação isotópica no dióxido de carbono atmosférico e dissolvido é medida por espectrometria de massa por razão gasosa, que fornece uma avaliação mais direta do fluxo metabólico intermediário em curtos períodos de tempo.

Em seguida, as amostras são processadas para análise de aminoácidos livres de vermes inteiros usando HPLC, bem como por enriquecimento isotópico em aminoácidos e ácidos orgânicos por GCMS, a fim de quantificar a alteração do fluxo metabólico em nematóides. Após a exposição a isótopos estáveis, são obtidos resultados que mostram efeitos de durações variáveis de exposição a isótopos, eliminação bacteriana e interrupção alternativa de vermes em vermes do tipo selvagem para interrogar a abundância isotópica em metabólitos intermediários. A guerra com o método pode fornecer informações sobre a navegação contra o metabolismo intermediário.

Também pode ser aplicado aos nossos sistemas, como linhagens celulares e tecidos de mamíferos. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando observamos anormalidades consistentes na análise de aminoácidos de vermes livres por HPLC que eram sugestivas de fluxo metabólico intermediário prejudicado nas alterações respiratórias primárias Função. Para iniciar este procedimento.

Os vermes que foram expostos a um precursor metabólico marcado com isótopo estável durante o desenvolvimento ou na idade adulta são coletados em um tubo de centrífuga de plástico de 1,5 mililitro. Geralmente diluímos os vermes a uma concentração de 1000 vermes por mililitro. Adicione 60% por ácido clorídrico contendo ácido epsilon aminocapróico como padrão interno aos vermes até uma concentração final de 4% por ácido clorídrico e 20 nanomolares de padrão interno.

Deixe o verme assentar por gravidade por cinco minutos, depois remova e guarde o sobrenadante em outro tubo. A etapa seguinte é um dos aspectos mais críticos deste procedimento. Os vermes devem ser completamente interrompidos por triagem antes da análise de metabólitos livres Usando um homogeneizador de plástico e uma broca motorizada, triture as amostras de vermes por 15 segundos.

Confirme visualmente a ruptura do verme por microscopia óptica e repita a moagem, se necessário. Nesta imagem, os painéis A e B mostram minhocas antes da retificação. Em contraste com os painéis C e D que mostram vermes após a moagem, transfira o sobrenadante previamente salvo para os tubos de centrífuga de plástico de 1,5 mililitro com a centrífuga homogeneizada sem-fim.

As amostras a 2.250 RPM 1300 Gs por cinco minutos. Após centrifugação, transferir o sobrenadante para um novo tubo de vidro de sete mililitros. Guarde o pellet para uso posterior em um ensaio de concentração de proteína.

Agora adicione quatro hidróxido de potássio normal ao SUPERNAT até que a faixa de pH das amostras seja de sete a oito centrífugas. As amostras neutralizadas nos tubos de vidro de sete mililitros a 2.250 RPM 1300 Gs por cinco minutos Para remover os sais, transfira o sobrenadante de cada amostra para um novo tubo de vidro de sete mililitros. As amostras neutralizadas agora podem ser preparadas para quantificação de metabólitos por cromatografia líquida de alta eficiência ou HPLC e cromatografia gasosa, espectrometria de massa ou GCMS para HPLC.

Separe 50 microlitros de cada amostra neutralizada para injeção direta na HPLC. A quantificação de aminoácidos livres é realizada usando derivitização pré-precal com aldeído de al e detecção fluorescente. Conforme descrito anteriormente, as amostras neutralizadas restantes serão submetidas à extração usando uma resina de troca iônica para GCMS para determinar o enriquecimento isotópico em aminoácidos e ácidos orgânicos, conforme mostrado na próxima seção.

Para preparar as contas, adicione um ácido clorídrico normal a um G e um G 50 separadamente. Em copos de um litro, mexa cada frasco por 30 minutos com uma agitação magnética. Depois disso, lave as contas com água deionizada 10 vezes até que o pH das lavagens seja igual ao pH da água.

A seguir, mostraremos nosso método para preparar colunas personalizadas de baixo custo usando pipetas de vidro. Colunas pré-fabricadas também estão disponíveis comercialmente. Para preparar uma coluna, use uma pinça para inserir um tampão de algodão logo acima da parte mais estreita da ponta de uma pipeta de pastagem, use um G um grânulo para extração de ácido orgânico e um G 50 grânulos.

Para extração de aminoácidos, preencha cada coluna até aproximadamente um terço da altura da coluna. Se uma amostra já estiver em pH neutro, nada será adicionado à amostra antes de aplicá-la à coluna AG um. Para extrair ácidos orgânicos para extrair aminoácidos, adicione um mililitro de ácido clorídrico 0,1 normal à amostra antes de aplicá-la na coluna AG 50.

Agora aplique as amostras neutralizadas previamente preparadas em cada coluna. Lave cada coluna 10 vezes com água até que as lavagens fiquem neutras. Após a conclusão da lavagem, eluir cada coluna para frascos de amostra de vidro de quatro mililitros rotulados com frescos Para extração de ácido orgânico, adicione três mililitros de três ácidos clorídricos normais à coluna AG.

Isso permite a análise do enriquecimento isotópico em número total de carbonos marcados entre três espécies de carbono, quatro espécies de carbono, cinco espécies de carbono e seis espécies de carbono. Para extração de aminoácidos, adicione três mililitros de quatro hidróxido de amônio normal à coluna G 50. Isso permite a análise do enriquecimento isotópico no número total de carbonos marcados entre três espécies de carbono e cinco espécies de carbono.

Na conclusão das extrações de ácidos orgânicos e aminoácidos, coloque os frascos de amostra em um evaporador reativo durante a noite até que estejam secos. As amostras são então analisadas pelo GCMS conforme detalhado no texto do Protocolo. Comece este procedimento transferindo mil vermes adultos jovens para uma placa experimental de 35 milímetros NGM agri contendo carbono 13 glicose e e coli universalmente marcados.

Em seguida, coloque a placa NGM experimental sem sua tampa. Em uma câmara de vidro personalizada equipada com uma torneira de parada de três vias bem selada para permitir a amostragem e substituição precisas da atmosfera. Cubra a vedação onde o disco de vidro opticamente transparente fica na placa com graxa de alto vácuo.

Sele a câmara com o disco de vidro. Registre o tempo. Como tempo zero, 30 minutos depois, use uma seringa de 20 mililitros para amostrar 10 mililitros da atmosfera da câmara de vidro pela torneira de parada de três vias.

Feche a torneira de parada da câmara Após a amostragem, transfira a amostra para um tubo de vidro aspirado em cuba vermelha contendo um mililitro de bicarbonato de sódio em hidróxido de sódio 0,1 molar. Em seguida, injete 10 mililitros de ar na câmara de vidro através da torneira de parada de três vias. Com uma seringa de 20 ml, fechar a torneira de paragem da câmara Depois de reinjectar a atmosfera e antes de retomar a incubação, repetir a amostragem da atmosfera da câmara de vidro aos 60, 90 e 120 minutos.

Analise essas amostras de dióxido de carbono atmosférico para enriquecimento de carbono marcado usando um espectrômetro de massa de proporção de gás, conforme descrito no texto do protocolo, isótopos estáveis são bem incorporados após duas horas em vermes adultos jovens, como evidenciado aqui pelo carbono marcado medido em dióxido de carbono atmosférico e dióxido de carbono dissolvido em vermes alimentados vivos ou irradiados por UV OP 50 e coli. A proporção de dióxido de carbono carbono 13 para dióxido de carbono carbono 12 foi maior na fração de dióxido de carbono dissolvida em relação ao dióxido de carbono atmosférico liberado. Observou-se que a exposição prolongada a um isótopo estável do período larval e subsequente eliminação de vermes em NGM Aate sem bactérias aumentou o enriquecimento isotópico de glutamato livre em vermes adultos jovens.

Neste gráfico, L um representa vermes alimentados com glicose de carbono 13 universalmente marcada e bactérias OP 50 do estágio larval L um até o estágio adulto jovem de 959 células YA representa vermes alimentados com glicose de carbono 13 e bactérias OP 50 por 48 horas, começando quando atingiram o primeiro dia de postura de ovos no estágio de adulto jovem. O eixo x indica o número total de átomos de carbono marcados em cada espécie de glutamato e o eixo Y indica o enriquecimento percentual. Todos os animais foram limpos do excesso de marcação isotópica antes da preparação da amostra a jusante.

Para análises GCMS, as barras verdes indicam vermes eliminados após exposição isotópica alimentando-se com OP 50 E coli em placas NGM por duas horas antes da extração do PCA. As barras azuis e cinzas indicam vermes eliminados após exposição isotópica em placas NGM sem bactérias por duas ou seis horas, respectivamente, antes da extração do PCA, independentemente do curso do tempo de exposição isotópica. Nenhuma diferença significativa no enriquecimento isotópico em metabólitos intermediários foi observada quando os animais foram limpos em placas por duas ou seis horas.

Em ambos os cursos de exposição isotópica, menos enriquecimento isotópico foi observado em metabólitos intermediários quando os animais foram eliminados alimentando-se com bactérias não marcadas por duas horas. Portanto, o protocolo de limpeza ideal para vermes cultivados em placas N GM espalhadas por bactérias com isótopo foi determinado como limpeza por duas horas em placas NGM não espalhadas para otimizar o enriquecimento percentual em metabólitos intermediários. Após tratamento por 24 horas em cultura líquida com uma glicose de seis carbonos 13 sem bactérias.

Foi feita uma comparação de amostras de vermes interrompidas apenas por sonicação ou sonicação mais trituração, conforme mostrado nesta figura. Os vermes interrompidos pela sonicação mais moagem tiveram maior enriquecimento isotópico do que as amostras interrompidas apenas pela sonicação, alimentando-se finalmente com vermes vivos com um precursor isotópico estável durante o desenvolvimento do estágio L um em placas ou começando no primeiro dia do ovo, colocando como adultos jovens por 24 horas em cultura líquida. Permitir a análise sensível do enriquecimento isotópico entre metabólitos indicativos de fluxo através da glicólise, metabolismo do piruvato no ciclo do ácido tricarboxílico após seu desenvolvimento.

Esta técnica abriu caminho para doenças mitocondriais, pesquisas para explorar o fluxo metabólico intermediário na elegância do mar. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar isotópico estável, perfil de metabolismo intermediário e fluxo metabólico nos nematóides, A elegância.