Name: Protocolo para Ensaios RNAi em mosquitos adultos (A. gambiae) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Aprenda a técnica de silenciamento gênico por RNAi em mosquitos Anopheles gambiae através de injeção de dsRNA no tórax. Este método permite estudar funções gênicas relacionadas à resistência ao patógeno da malária.

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RNAi mediada silenciamento de genes em mosquitos exige preparação prévia e purificação de dsRNAs específicos que visam o gene de interesse. Para a síntese de dsRNA, recomendamos o kit Megascript Ambion que faz uso de uma RNA polimerase T7 mediada por reação in vitro de transcrição. Para a purificação de dsRNA, recomendamos o kit Qiagen RNeasy. Amostras de dsRNA devem ser quantificados e ajustado a 3 mcg / mL em água. Outros materiais que você vai precisar incluir: com pontas finas pinças, lâmina de vidro, agulhas de vidro microcapilar, microinjetor (usamos Nanoject Drummond II), um microscópio de luz montada sobre um bloco de frio, uma coberta de vidro prato de Petri, toalhas de papel e um balde de gelo . Você também vai precisar de uma maneira de coletar mosquitos e recipiente adequado para eles, juntamente com uma fonte de alimento, tais como algodão embebido em sacarose 10%. <ol><li> Recolher os seus mosquitos. Usando um aspirador movido a bateria, coletar os mosquitos que deseja injetar. Conecte o bico com uma toalha de papel ou algodão de forma que nenhum mosquito pode escapar e remover o reservatório. Uma vez que as temperaturas frias anestesiar os mosquitos, enterre o reservatório em um balde de gelo e esperar 5-10 minutos para os mosquitos parar de se mover. Anestesiados também pode ser feito colocando o reservatório em uma sala fria ou geladeira ou usando CO 2. Durante esses 5-10 minutos, continue para a próxima etapa. </li><li> Prepare sua área de trabalho. Definir um bloco de superfície plana fria a 2 ° C e coloque uma lâmina de vidro sobre ela. Este é o lugar onde os mosquitos vai descansar enquanto você injetá-las. Coloque uma agulha de vidro para o microinjetor e usar sua pinça para quebrar a ponta da agulha para a largura desejada. É importante que a largura é grande o suficiente para permitir espaço suficiente para líquido para fluir através de uma taxa razoável, mas é estreito o suficiente para causar uma ferida mínimos durante a injeção. A ponta da agulha bom será estreito o suficiente para dobrar um pouco, mas não quebrar. Definir o seu equipamento de injeção para o volume de saída desejada (por RNAi, usamos 69 nL). Submergir a ponta de sua agulha em sua amostra e desenhar a sua amostra de líquido para dentro da agulha usando as instruções do fabricante. A amostra de líquido pode ser uma solução dsRNA, suspensão bacteriana, ou outros, o processo de injeção é a mesma para todos. Incorporar uma placa de Petri de vidro no balde de gelo para que o fundo do prato está completamente em contato com o gelo. Isto é onde você irá colocar os mosquitos até que você esteja pronto para injetá-las. </li><li> Prepare o seu mosquitos. Transferir 50-100 mosquitos do reservatório para a placa de Petri de vidro. Use sua pinça para thin-los em uma única camada, certificando-se a maioria tem contato com o fundo frio do prato para mantê-los anestesiados. Cobrir esses mosquitos com o prato tampa quando não estiver em uso. Retorno do reservatório para o balde de gelo para manter o resto dos mosquitos anestesiados. </li><li> Monte mosquitos em bloco frio. Use sua pinça de ponta fina para transferir os mosquitos um de cada vez do prato para o slide de vidro montada no bloco frio sob o microscópio de luz. Lidar com os mosquitos delicadamente, de preferência pelas pernas. Line up até 30 mosquitos lado a lado no slide, certificando-se que você pode começar a cada um com o microinjetor e certificando-se cada um faz o contato com a lâmina fria. Verifique se o seu mosquitos estão alinhados em ordem, para que enquanto você vai longitudinalmente você sabe que tem e que não tenham sido injetado. Deixe outros mosquitos abordados na placa de Petri refrigeradas. </li><li> Injetar o seu primeiro grupo de mosquitos. Segure o de ponta fina pinça com ponta em uma mão e segurar o microinjetor no outro lado como um lápis. Use a pinça para mover o mosquito que você precisa (segurá-los pelas pernas para evitar a lesão) e para manter o mosquito firme como você injetar. Isso funciona melhor se você usar a pinça para apoiar um dos lados do mosquito como você injetar a partir do outro lado. Insira cuidadosamente apenas a ponta da agulha para tórax mosquito. O melhor é injetar uma parte tensa ainda fina da cutícula para minimizar o prejuízo. Além disso, evitar injetar muito profundamente, você quer apenas a ponta de estar dentro do tórax; injeções causa mais profunda feridas maior que irá comprometer a sobrevivência. Uma vez que a ponta da agulha está na posição, pressione e solte o pedal do aparelho microinjetor que vai entregar o seu volume pré-definido de dsRNA. Espere um ou dois segundos e retire a agulha do mosquito. Se uma gota de líquido aparece fora do local da ferida, aguarde alguns segundos para que possa ser absorvida na ferida. Se ele não absorve dentro de alguns segundos, descartamos o mosquito e tente novamente. Continuar o processo de injeção para todos os mosquitos em sua lâmina de vidro. </li><li> Armazenar seus mosquitos. Quando terminar, coloque o seu mosquitos injetados dentro de recipientes rotulados (nós preferimos um pint copos de cera revestido de papelão cobertos pormalha de redes e presa com tiras de borracha e uma tampa de papelão). </li><li> Continue injeções até terminar. Continue para colocar mosquitos no slide, injetar e transferência para copos até que você tenha o tamanho da amostra que você deseja. Responsáveis ​​por algumas mortes iniciantes terão muitos mosquitos morrem a partir do trauma da injeção. Isto irá melhorar com a prática até quase 100% do seu mosquitos sobrevivem injeção. </li><li> Quando terminar, coloque um dobrado, papel toalha molhada sobre o cálice, juntamente com uma fonte de alimento e cobrir os copos com algo a reter a umidade, tais como plástico ou uma tampa de plástico Petri. Mosquitos injetados são propensas a secar assim que a umidade fornecida pela toalha molhada e retido pelo plástico irá ajudar a evitar isso. </li><li> Coloque seu mosquitos em uma câmara de ambiente controlado para a incubação. </li></ol> Nota: Eficiência de silenciamento do gene é altamente variável e depende de uma série de fatores, incluindo transcrição e proteínas turn-over, as taxas de absorção e eficiência dsRNA pelas células e órgãos. Descobrimos que o silenciamento começa tão cedo quanto uma injeção de pós dia, e pode durar até seis dias após a injecção. Utilização de métodos de detecção de transcrição e proteínas, tais como PCR quantitativo e Western blotting para validar silenciar. Nota: Há diversas variações em várias etapas da injeção mosquito e RNAi mediada técnica de silenciamento gênico. Algumas variações são descritas por: Boisson, et al (2006) e Blandin, et al (2002)...

<ol><li>Boisson,, et al. , (2006).</li>
<li>Blandin,, et al. , (2002).</li>
</ol>

Eficiência do silenciamento do gene é altamente variável e depende de uma série de fatores, incluindo transcrição e proteínas turn-over, as taxas de absorção e eficiência dsRNA pelas células e órgãos. Descobrimos que o silenciamento começa tão cedo quanto uma injeção de pós dia e pode durar até seis dias após a injecção. Utilização de métodos de detecção de transcrição e proteínas, tais como PCR quantitativo e Western blotting para validar silenciar.

<table><tbody><tr><td>Megascript</td><td>kit</td><td>Ambion</td><td></td><td>para síntese de RNA-ds; reação de transcrição in vitro mediada por RNA polimerase T7</td></tr><tr><td>RNeasy</td><td></td><td>Qiagen</td><td></td><td>Para purificação de RNA-ds</td></tr><tr><td>RNA-ds</td><td></td><td></td><td></td><td>deve ser quantificado e ajustado para 3 &amp;#x03BC;g/ &amp;#x03BC;L em água</td></tr><tr><td>pinceta de ponta fina</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lâmina de vidro</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agulhas microcapilares de vidro</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microinjetor</td><td></td><td>Drummond Scientific</td><td>Nanoject II</td><td></td></tr><tr><td>microscópio óptico</td><td></td><td></td><td></td><td>montado acima de um bloco frio</td></tr><tr><td>placa de Petri</td><td></td><td></td><td></td><td>com tampa, de vidro</td></tr><tr><td>toalhas de papel</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sacarose 10%</td><td>alimento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A. gambiae</td><td>Animal</td><td></td><td></td><td>mosquitos</td></tr></tbody></table>

protocolo para ensaios rnai em mosquitos adultos (a. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reversa abordagens genéticas têm-se revelado extremamente útil para determinar quais genes de resistência a patógenos underly vetor em mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra um método utilizado pelo laboratório Dimopoulos para injetar dsRNA em mosquitos Anopheles gambiae, que abrigam o parasita da malária. A técnica de manipular a configuração da injeção e injetar dsRNA no tórax é ilustrado.

Protocolo para Ensaios RNAi em mosquitos adultos (A. gambiae)

Abordagens de genética reversa provaram ser extremamente úteis para determinar quais genes fundamentam a resistência a patógenos transmitidos por vetores em mosquitos. Este vídeo ...

Eu sou Lindsay Garver e sou aluna de doutorado no laboratório do Dr. George Dimopoulos na Escola de Saúde Pública Johns Hopkins. Vou mostrar a vocês como realizar o silenciamento mediado por RNAi de genes utilizando uma técnica de injeção. O primeiro passo é coletar os mosquitos que vamos injetar.Estes são apenas espécimes de estoque de uma maneira terrível, Gabi. É uma mistura de machos e fêmeas. E este é o nosso aspirador com alimentação por bateria.Ele possui um ventilador em seu interior, que criará sucção, puxando os mosquitos através deste bocal até este reservatório. Então, desligamos. Temos uma pequena porta de acesso, que normalmente é vedada com fita para manter os mosquitos no interior, mas a abrimos e inserimos o bocal, ligamos e utilizamos para coletar.Uma vez que temos os mosquitos no interior, tampamos a parte superior do bico, observando os mosquitos no reservatório. Em seguida, precisamos anestesiar esses mosquitos. Para isso, colocamos esse reservatório dentro de um balde com gelo, cobrimos com gelo e aguardamos até que os mosquitos fiquem inativos.Certo, o próximo passo é injetar os mosquitos, e para isso usaremos este aparelho, chamado nano jet dois. Ele é compo

protocol-for-rnai-assays-in-adult-mosquitoes-a-gambiae

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo ilustra as técnicas gerais usadas para a retaguarda Anopheles gambiae em laboratório. Os métodos para cuidar dos mosquitos laboratório são demonstrados por todos os estágios do ciclo de vida do organismo a partir de larvas de pupas a sangue-alimentação adultos.

Protocolo para a Criação Mosquito (A. gambiae)

Neste protocolo combinamos RNAi mediada silenciamento de genes com...

RNAi mediada knockdown do gene e<em&gt; In Vivo</em&gt; Ensaio diurese no Feminino Adulto<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Os mosquitos

RNA-Seq as análises estão se tornando cada vez mais importantes para identificar os fundamentos moleculares de características adaptativas em organismos não modelo. Aqui, um protocolo para identificar genes diferencialmente expressos entre mosquitos Aedes albopictus diapausados e não diapausados é descrito, desde a criação de mosquitos até o sequenciamento de RNA e análises de bioinformática de dados de RNA-Seq.

Uma Experimental e Bioinformática Protocolo de Análises de RNA-seq de fotoperiódicas diapausa no Tigre Asiático Mosquito, Aedes albopictus

Os mosquitos transmissores da malária têm uma série de características epidemiologicamente importantes que só podem ser detectadas usando técnicas moleculares. Utilizando uma plataforma de genotipagem SNP baseada em MALDI-TOF, desenvolvemos um ensaio para detectar simultaneamente várias características-chave (espécie, resistência a inseticidas, infecção parasitária e escolha do hospedeiro) de vetores da malária.

Um ensaio para detecção multi-malária mosquitos transmissores

Aqui, descrevemos um processo para a inibição da função do gene em vectores mosquitos doença através do uso de quitosano / interferindo nanopartículas de RNA que são ingeridos pelas larvas.

A quitosana / RNA de interferência Nanoparticle Mediated silenciamento gênico na Doença Vector Mosquito Larvas

A interferência de RNA (RNAi) é uma ferramenta extremamente valiosa para descobrir a função do gene. No entanto, a capacidade de direcionar genes usando RNAi durante os estágios pré-adultos é limitada no principal vetor da malária humana, Anopheles gambiae. Descrevemos um protocolo de RNAi para reduzir a função do gene por meio de injeção direta durante o desenvolvimento da pupa.

RNAi gatilho para o interior<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; As pupas

Este protocolo descreve uma metodologia de microinjeção que temos padronizado e utilizado por vários anos para entregar quantidades específicas de ácidos nucleicos diretamente a hemolinfa de mosquitos e moscas domésticas. Este protocolo resulta em mortalidade de injeção mínima e permite medições de dose correlacionado de fecundidade.

Reprodutível dsRNA Microinjection e Bioassay de oviposição em mosquitos e moscas domésticas

O sistema bipartite GAL4-UAS é uma ferramenta versátil para modificação da expressão genética de forma espástica controlada que permite a análise genética funcional em Anopheles gambiae. Os procedimentos descritos para o uso deste sistema são uma estratégia de clonagem semi-padronizada, sexagem e triagem de pupas para marcadores de proteína fluorescente e fixação de embriões.

Usando o sistema GAL4-UAS para genética funcional em Anopheles gambiae

Este protocolo fornece os passos desde a extração de DNA até a configuração experimental para PCR de gotícula digital (ddPCR), incluindo análise para identificação e quantificação de eventos não homólogos de junção final (NHEJ) em locais-alvo após o decote Cas9 induzido pelo GRNA e reparação de DNA. Outros usos deste método incluem aplicações como detecção de polimorfismo e verificação de variantes de edição de genes.

PCR de gotícula digital para detectar mutações indelés em populações de mosquitos anofelinos geneticamente modificados

Este artigo detalha um protocolo para identificação rápida de indels induzidos pelo CRISPR/Cas9 e seleção de linhas mutantes no mosquito Aedes aegypti utilizando análise de derretimento de alta resolução.

Detecção indel seguindo CRISPR/Cas9 Mutagenesis usando análise de derretimento de alta resolução no mosquito Aedes aegypti

A administração oral do dsRNA produzido por bactérias, um método de entrega para interferência de RNA (RNAi) que é rotineiramente utilizado em caenorhabditis elegans, foi aplicada com sucesso aqui em mosquitos adultos. Nosso método permite estudos robustos de genética reversa e estudos de vetores de bloqueio de transmissão sem o uso de injeção.

Administração eficaz de interferência oral de RNA (RNAi) para mosquitos anofeeles gâmbias adultos

Aprenda a técnica de silenciamento gênico por RNAi em mosquitos Anopheles gambiae através de injeção de dsRNA no tórax. Este método permite estudar funções gênicas relacionadas à resistência ao patógeno da malária.

Protocolo para Ensaios RNAi em mosquitos adultos (A. gambiae)

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