Protocolo para Ensaios RNAi em mosquitos adultos (A. gambiae)

Eu sou Lindsay Garver e sou estudante de doutorado no laboratório do Dr. George Dimopoulos na Escola de Saúde Pública Johns Hopkins. E vou mostrar como fazer silenciamento mediado por RNAi de genes usando uma técnica de injeção. Portanto, o primeiro passo é coletar os mosquitos que vamos injetar.

Estes são apenas estoque de uma Gabi terrivelmente. É uma mistura de machos e fêmeas. E este é o nosso aspirador alimentado por bateria.

Ele tem um ventilador interno, que criará sucção, puxando os mosquitos através deste bico para este reservatório. Então nós desconectamos. Temos uma pequena porta de acesso, que normalmente é colada com fita adesiva para manter os mosquitos dentro, mas abrimos e inserimos o bico, ligamos e usamos para coletar.

Assim que tivermos os mosquitos dentro, tampamos a parte superior do bico, vemos os mosquitos lá no reservatório. Então queremos anestesiar esses mosquitos. Então enterramos esse reservatório em um balde de gelo que cobrimos com gelo e esperamos que os mosquitos desçam.

Ok, o próximo passo é injetar os mosquitos e usá-los, usaremos isso, que é um nano jato dois. Consiste em uma porção de varinha, que estarei segurando. E isso conterá a agulha, que dispensará o líquido no mosquito.

O painel de controle, que possui nossos botões de encher e esvaziar e é responsável por puxar o líquido para dentro e para fora da agulha. E então este é o pé. Isso será colocado no chão.

E empurrar isso com o pé dispensará uma gota do volume apropriado no mosquito. Então, enquanto os mosquitos estão no gelo, preparamos a estação de trabalho definindo um bloco frio para zero a dois graus Celsius. Este bloco frio tem um acessório plano, que então tem uma lâmina de vidro montada nele.

E isso impedirá que os mosquitos se movam enquanto tentamos manipulá-los. Também vou levar uma dessas agulhas capilares de vidro. Este é apenas um tubo capilar de vidro comum que foi aquecido e puxado no meio para criar uma agulha.

E é isso que vai segurar nosso líquido. E então é isso que usaremos para injetar o mosquito e dispensar o líquido. Então, a próxima coisa que temos que fazer é colocar a agulha capilar em nossa varinha de injeção.

Removemos o nariz. Certifique-se de que os anéis internos estejam posicionados de acordo com as instruções do fabricante. Deslize a agulha de vidro para baixo na peça do nariz, tomando cuidado com a ponta para não quebrá-la.

Uma vez que esteja seguro, deslize a agulha da varinha na agulha capilar e aperte bem a peça do nariz. O próximo passo é certificar-se de que a agulha do tubo capilar tem uma boa largura para injeções. Este é um ponto muito importante porque uma agulha muito fina não dispensará a quantidade correta de líquido e uma ponta de agulha muito grossa ferirá o mosquito e possivelmente causará a morte.

Isso é algo que requer muita prática, mas uma boa largura é realmente crucial para a injeção adequada e a sobrevivência de seus mosquitos. O que eu faço é usar sua pinça de ponta fina para quebrar a ponta da agulha de forma que a agulha ainda seja compatível, mas estável. Precisamos de nossa amostra de RNA de fita dupla.

Esta amostra foi preparada usando um kit. Há uma variedade de kits no mercado que podem gerar RNAs de duplo padrão específicos para o gene de interesse. Usamos nossos RNAs a uma concentração de três microgramas por microlitro e temos nosso conjunto de nano injeção para que uma injeção dispense a posição de 69 nanolitros.

O tubo coloca nossa agulha no líquido e usa o botão de enchimento na ejeção n para puxar o líquido para dentro da agulha. A quantidade de líquido que você precisará na agulha é diretamente proporcional ao número de mosquitos que você injetará. Okey? E agora precisamos preparar os mosquitos.

Então, pegamos nosso prato de plástico P dois e o colocamos em nosso balde de gelo. Verificamos se nossos mosquitos não estão se movendo e os espalhamos finamente na placa de Petri fria. Isso garante que, enquanto trabalhamos, os mosquitos não se movam e não voem.

Em seguida, posicionamos os mosquitos em nossa lâmina de vidro, que agora está a zero graus Celsius. E o posicionamento dos mosquitos é crucial para a forma como os injetamos. Então você quer que seus mosquitos sejam alinhados ordenadamente para que você saiba quais foram injetados e quais não foram injetados.

E você também quer que haja espaço suficiente entre seus mosquitos para que você possa alcançá-los com o injetor. Então, transferimos mosquitos individuais do prato peewee para a lâmina, tomando cuidado, cuidando para manuseá-los pelas pernas. Isso evita esmagar os corpos e resulta em maior sobrevivência.

Então agora estamos prontos para injetar. Usamos a pinça de ponta fina para apoiar o mosquito de um lado, sou destro, então uso isso na mão esquerda. E então injetamos do outro lado, inserindo a ponta da agulha na lateral do tórax, de modo que o tórax do mosquito fique imprensado entre as pontas da pinça e a ponta da agulha e a ponta da agulha entre.

Assim que a ponta da agulha estiver dentro do tórax, pressione o pedal, você ouvirá um bipe e o líquido será dispensado no tórax do mosquito. Então você passa para o próximo e repete. De vez em quando, ao retirar a agulha, você verá uma gota de líquido que saiu do local de entrada.

E se isso acontecer, você pode esperar que o líquido seja reabsorvido no local de entrada. Se isso acontecer, tudo bem. Se a gota não for reabsorvida, se a gota permanecer do lado de fora do tórax, então esse mosquito deve ser descartado e você, você injeta outro em seu lugar.

Também é importante certificar-se de que sua agulha penetre apenas no tórax conforme necessário. Você não quer cutucar para o outro lado ou permitir que muita largura da agulha passe. A sobrevivência do tórax ou do mosquito será comprometida.

Portanto, continuamos esse procedimento para todos os mosquitos, conforme necessário. Então, para armazenar seus mosquitos injetados, usamos um copo forrado de cera de papelão de meio litro que foi coberto com uma rede de malha fina e preso com um elástico e uma tampa de papelão. Abrimos a porta de acesso que está coberta com fita adesiva e adicionamos cuidadosamente nossos mosquitos Para ajudar seus mosquitos a sobreviver.

Você deve adicionar uma bola de algodão que foi casada com uma solução de sacarose a 10% que atua como fonte de alimento para os mosquitos enquanto eles estão aqui. E uma toalha de papel dobrada úmida. Como os mosquitos feridos tendem a secar, isso ajudará a preservar a umidade e ajudará na sobrevivência dos mosquitos injetados.

Completamos com uma tampa de Petri para conter a umidade para que nossa toalha de papel e nossas bolas de algodão fiquem molhadas. E então incubamos isso em condições normais de controle ambiental. Portanto, a cinética molecular do silenciamento gênico mediado por RNAi varia bastante de gene para gene.

E assim, para alguns genes, o silenciamento pode ocorrer em um dia e, para outros genes, o silenciamento eficiente não ocorrerá por vários dias. As diferenças entre cada gene podem ser medidas usando PCR quantitativo em tempo real, e isso monitorará os níveis de transcrição em seus mosquitos e informará quando você alcançou um silenciamento eficiente. Portanto, eu recomendaria reservar alguns de seus mosquitos injetados para esse fim.

Isso também o ajudará a determinar a eficiência de seus RNAs de fita dupla em geral, se você, seus RNAs de fita dupla específicos podem alcançar um silenciamento eficiente. E se você está de fato interferindo nos níveis de transcrição, acabei de mostrar o procedimento para silenciamento de genes mediado por RNAi de mosquitos da Gâmbia. Este procedimento envolve a microinjeção de RNAs de fita dupla no tórax de mosquitos Anole Gabi.

Este procedimento é importante porque é um dos resíduos mais fáceis e eficazes para manipular genes individuais em mosquitos.