Name: Cultura Slice organotípicas de GFP-expressando embriões de camundongos para imagens em tempo real de crescimento dos nervos periféricos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-29T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Aprenda a preparar fatias organotípicas de embriões de camundongos expressando GFP para imagens em tempo real do crescimento de nervos periféricos. Este método permite estudar o desenvolvimento neural com microscopia de fluorescência.

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Os autores agradecem a fonte original para a idéia de realizar cultura fatia em embriões de ratos 5. Gostaríamos de agradecer Joachim Kirsch ao apoio científico generoso e Degen Anna para agir como nosso gofer durante as filmagens. Este trabalho foi financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (Deutsche Forschungsgemeinschaft: Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9) e da Universidade de Heidelberg (Redes de Excelência Cluster Cellular).

Parte 1: Preparando-se para cortar e cultura. <ol><li> Prepare 10 cm de placas de cultura de tecido com corte médio (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% de soro fetal bovino, a glicose 0,5%, 1 mM de glutamina, 2,5 mM HEPES, pH 7.3) e 3 cm de Millicell-CM cultura 0,4 mícrons insere membrana e manter em estufa a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Aqueça 4% baixo ponto de fusão de agarose em PBS no microondas e mantê-lo na placa de aquecimento para que fique em aproximadamente 37 ° C. </li><li> Preencher 10 cm de pratos bacteriológica Petri com PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mm KH 2 PO 4) e colocar no gelo. </li><li> Configurar dispositivo de resfriamento micrótomo ou garantir que bandeja de tampão e de refrigeração elementos são armazenados no freezer para pré-cool-lo. </li></ol> Parte 2: incorporação de embriões. <ol><li> Dissecar os embriões do útero e examiná-las com um microscópio invertido fluorescente para verificar se há expressão GFP. </li><li> Embriões lugar em uma invertida de 10 cm Placa de Petri e orientá-los usando tiras de papel Whatman para remover PBS excessiva. </li><li> Aplicar agarose sobre o embrião para corrigi-lo nesta posição. Deixe agarose solidificar. </li><li> Limitar a área que circunda o embrião, cortando com uma lâmina de barbear. </li><li> Gire o embrião incorporado em seu outro lado. </li><li> Aplicar agarose adicionais sobre tecido embrionário para garantir que o embrião está completamente incorporado. </li><li> Prepare bloco agarose com bordas limpas e montagem em vibratome chuck usando Loctite 406, uma cola especial semelhante ao "Krazy Glue". </li></ol> Parte 3: Slicing procedimento. <ol><li> Configure a bandeja de tampão pré-resfriada eo elemento de refrigeração. </li><li> Insira o chuck com o tecido colado e adicione HBSS 1x (Ca 2 +-Mg 2 + livre HBSS, 10 mM HEPES pH 7,3, 500 U / ml de penicilina / estreptomicina) até coberta. </li><li> Inserir e fixar uma lâmina de micrótomo precleaned (70% etanol). </li><li> Prepare 350-450 fatias mm e transferi-los usando encurtado pipetas de vidro pasteur em placas de cultura de tecidos conservados no gelo. </li><li> Usando uma pinça, retire cuidadosamente cada fatia de agarose e transferência para membranas Millicell cultura. Cerca de 4 fatias podem ser cultivadas em uma membrana em uma placa de cultura de 10 cm de tecido preenchido com 6 mL de meio de cultura. </li><li> Incubar fatias a 37 ° C e 5% CO 2 (médio Cultura: DMEM, 25% 1x HBSS, 25% soro fetal bovino, a glicose 0,5%, 1 mM de glutamina, 2,5 mM HEPES, pH 7.3). Se um time-lapse realiza série de imagens deve-se manter constante o volume de meio. No caso da série programada de imagem para um curto espaço de tempo é suficiente para deixar o meio como ela é. Para períodos de mudanças mais cultura após 12-20 horas são recomendados. </li></ol> Parte 4: Imaging conseqüência do nervo espinhal ao microscópio. <ol><li> Nervos espinhais colocar uma imagem de 10 cm placa de cultura de tecidos, contendo membranas cultura Millicell com fatias, sob um microscópio fluorescente na posição vertical. </li><li> Rótulo a orientação das membranas cultura Millicell no palco microscópio para posicionar corretamente durante o próximo ponto de imagem tempo. </li><li> Imagem conseqüência do nervo espinhal utilizando 4x (abertura numérica [NA] 0,1), 10x (NA 0,3) ou 20x (NA 0.5) objetivos. </li></ol> A Figura 1 mostra uma série de imagens retratando o crescimento do nervo espinhal, durante 20 horas de cultura com objectivos de 4x e 10x. <img src="/files/ftp_upload/2309/2309fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura série de imagens de uma conseqüência do nervo espinhal em uma fatia transversal de um embrião tauGPF homozigótica. * = Neurônios motores da medula espinhal ventral, seta = DRG. O dorsal (D)-ventral eixo (V) da fatia é indicado. Scalebars: 200 mM.

<ol><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).</li>
<li>Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+slice+culture+system+for+the+imaging+of+nerve+development+in+embryonic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse.</a> Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).</li>
<li>Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+slice+preparation%3A+a+tribute+to+the+pioneer+Henry+McIlwain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain.</a> Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).</li>
<li>Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+circuitry+of+identified+projection+neurons+in+cat+visual+cortex+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices.</a> J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).</li>
<li>Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo slices.</a> Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).</li>
</ol>

Em uma extensa comparação de métodos para preparar culturas fatia embrionárias de embriões meados de gestação mouse (E10 - E12), temos observado que um vibratome produz, sem dúvida, os resultados mais confiáveis ​​no que diz respeito a ambos os viabilidade global das culturas e da reprodutibilidade a conseqüência padrões nervosas. Em contraste, as fatias preparadas usando um helicóptero tecido McIlwain 3 mostrou-se completamente inviável. Nós originalmente empregado um método guilhotina 4, em que u...

<table><tbody><tr><td>HBSS 10x</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>14180</td><td></td></tr><tr><td>Ferramentas de dissecação</td><td>Fine Science Tools</td><td>vários</td><td></td></tr><tr><td>Agarose L.M.P.</td><td>Invitrogen</td><td>15517-022</td><td></td></tr><tr><td>Papel Whatmann</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030917</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas curtas polidas com fogo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 100x</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Vibrátomo</td><td>Microm International</td><td>HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>analySIS</td><td>Soft Imaging System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insertos Millicell-CM</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG 50</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de 10 cm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633171</td><td></td></tr><tr><td>LOCTITE 406</td><td>Henkel Corp</td><td>142580</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>nenhum</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>9105.2</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Objetiva de x4</td><td>Olympus Corporation</td><td>série PL</td><td></td></tr><tr><td>Objetiva de x10</td><td>Olympus Corporation</td><td>série UPLFL &amp;#8211;PH</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Olympus Corporation</td><td>U-MNIBA2</td><td></td></tr><tr><td>Câmera CCD</td><td>Soft Imaging System</td><td>SIS F-View II</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento para câmara aquecida</td><td>Leica Microsystems</td><td>CTI-Controller 3700 e incubadora S #11531171</td><td></td></tr></tbody></table>

cultura slice organotípicas de gfp-expressando embriões de camundongos para imagens em tempo real de crescimento dos nervos periféricos

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Para muitos propósitos, o cultivo de embriões de rato vivo ex como fatias organotípicas é desejável. Por exemplo, nós empregamos uma linha de camundongo transgênico (tauGFP) em que a versão melhorada da proteína verde fluorescente (EGFP) é exclusivamente expressa em todos os neurônios do desenvolvimento do sistema nervoso central e periférico 1, permitindo a possibilidade de ambos os filmes a inervação o membro anterior e manipular esse processo com as técnicas farmacológicas e genéticas 2. O parâmetro mais crítico de sucesso no cultivo de culturas fatia tal é o método pelo qual as fatias são preparadas. Após extensos testes de uma variedade de métodos, descobrimos que um vibratome é o dispositivo melhor possível para cortar os embriões de tal forma que eles rotineiramente resultar em uma cultura que demonstra a viabilidade ao longo de um período de vários dias, e mais importante, se desenvolve em uma época forma específica. Para meados de gestação de embriões, o que inclui a consequência normal de nervos espinhais da medula espinhal e os gânglios da raiz dorsal para as suas metas na periferia e na determinação adequada do tecido ósseo e muscular. Neste trabalho, apresentamos um método para processamento de embriões de todo dia embrionário (E) E10 a E12 em 300-400 fatias micrômetro para o cultivo em um padrão de cultura de tecidos da incubadora, que pode ser estudado por até dois dias após a preparação fatia. Crítico para o sucesso desta abordagem é o uso de um vibratome a fatia cada embrião agarose-embedded. Isto é seguido pelo cultivo das fatias em cima insere cultura Millicell membrana colocada sobre um pequeno volume de meio, resultando em uma técnica de cultura de interface. Uma maca com uma média de 7 embriões rotineiramente produz pelo menos 14 fatias (2-3 fatias da região forelimb por embrião), que varia um pouco devido à idade dos embriões, bem como para a espessura das fatias. Cerca de 80% das fatias cultivadas mostram crescimento do nervo, que pode ser medido longo de todo o período de 2 cultura. Resultados representativos usando a linha do mouse tauGFP são demonstradas.

Nós apresentamos um método para preparar fatias organotípicas de embriões meados de gestação do rato para a imagem de cultivo e de lapso de tempo de crescimento dos nervos periféricos.

Cultura Slice organotípicas de GFP-expressando embriões de camundongos para imagens em tempo real de crescimento dos nervos periféricos

Para muitos propósitos, o cultivo de embriões de camundongo ex vivo como fatias organotípicas é desejável. Por exemplo, utilizamos uma linhagem de camundongos transgênicos (tauGFP) em...

O objetivo geral deste procedimento é preparar fatias transversais organotípicas da região do membro anterior de embriões de camundongo que expressam GFP para a obtenção de imagens do crescimento dos nervos espinhais. Isso é realizado primeiramente embutindo os embriões em agarose de ponto de fusão baixo e limitando a área do tecido e da agarose à região de interesse. O bloco de agarose é então montado para corte. Em seguida, os embriões embutidos no bloco são cortados com o vibrátomo. O passo final do procedimento é remover os aros ao redor dos cortes e transferir os cortes para placas de cultura. Os cortes são então cultivados e mostram o crescimento de nervos periféricos para a periferia, o que pode ser monitorado por microscopia de fluorescência.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o guilhotinamento ou o cortador de tecidos, é que os cortes são gerados de maneira mais controlada e apresentam viabilidade melhorada em cultura. Portanto, este método pode auxiliar no estudo da neurobiologia do desenvolvimento, como na análise do direcionamento e do crescimento dos nervos espinais, demonstrando que o procedimento será realizado por Isabel Barman.

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Imagem tecido embrionário em tempo real, é um desafio durante longos períodos de tempo. Aqui nós apresentamos um ensaio para o monitoramento das alterações celulares e sub-celular na medula espinhal pinto por longos períodos com resolução espacial e temporal. Esta técnica pode ser adaptado para outras regiões do sistema nervoso e embrião em desenvolvimento.

De alta resolução de imagem ao vivo de comportamento de células no desenvolvimento neuroepitélio

Aqui vamos desenvolver as ferramentas necessárias...

Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium

Este vídeo demonstra a cultura ex vivo e a imagem de fatias oculomotoras de embriões de camundongos transgênicos. Os embriões são isolados e incluídos em agarose. Usando um vibratome, são obtidas fatias contendo os núcleos oculomotores e os olhos. As fatias são mantidas em cultura e fotografadas usando um microscópio de fluorescência.

Cultura ex vivo e imagem de fatias oculomotoras de embriões de camundongos transgênicos

Neural mitose de células progenitoras é um parâmetro crítico da neurogénese. Muito do nosso entendimento da mitose progenitor neural é baseado na análise de tecido fixo. Imagens ao vivo em fatias de cérebro de embriões é uma técnica versátil para avaliar a mitose com resolução temporal e espacial de alta em um ambiente controlado.

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

Uma técnica para estudar células NG2 e oligodendrócitos usando um sistema de cultura de fatias do prosencéfalo e cerebelo é descrita.  Este método permite o exame da dinâmica de proliferação e diferenciação de células dentro da linhagem de oligodendrócitos, onde o ambiente extracelular pode ser facilmente manipulado, mantendo a citoarquitetura do tecido.

Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination

Apresentamos aqui um protocolo otimizado para genotipar, corar e preparar fetos de camundongos para a imagem de projeções de axônios nociceptores periféricos em todo o animal, como um método eficaz para avaliar fenótipos de crescimento sensorial de axônios no desenvolvimento de camundongos geneticamente modificados.

Todo-mount imagem de embrião de rato Projeções Sensorial Axon

Este protocolo fornece instruções para a observação direta de neurônios corticais que migram radialmente. A eletroporação in utero , a cultura de fatia organotípica e a imagem confocal de lapso de tempo são combinadas para estudar de forma direta e dinâmica os efeitos da sobre-expressão ou downregulation de genes de interesse em neurônios migratórios e analisar sua diferenciação durante o desenvolvimento.

Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando<em&gt; Em Utero</em&gt; Electroporação

Aqui, nós fornecemos um método confiável e de baixo custo para gerar electroporated culturas do cérebro organotypic fatia de embriões do rato apropriados para microscopia confocal e técnicas de geração de imagens ao vivo.

Ex Utero Eletroporação e culturas Organotypic fatia do cérebro embrionário Mouse para imagens ao vivo de migração gabaérgica interneurônios

Um ensaio ex vivo da fatia permite que o conseqüência do nervo oculomotor seja imaged no tempo real. As fatias são geradas incorporando E 10.5 ISLMN: embriões de GFP no agarose, cortando em um vibratome, e crescendo em uma incubadora do estágio-parte superior. O papel das vias de orientação do AXON é avaliado pela adição de inibidores aos meios de cultura.

Cultura ex vivo oculomotor Slice de camundongos que expressam GFP embrionário para a imagem de lapso temporal do crescimento do nervo oculomotor

Este protocolo demonstra um método simples e robusto para estudar na dinâmica do cone de crescimento e crescimento do axônio. Ele descreve como preparar ex vivo fisiologicamente relevantes fatias cerebrais agudas e fornece um pipeline de análise amigável.

In situ Visualização da Dinâmica do Cone de Crescimento e Crescimento do Axon em Culturas agudas de fatias de cérebro embrionário ex vivo

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Muitos genes estão envolvidos neste processo. Este protocolo apresenta a técnica para a imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais.

Imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro de camundongo embrionário

Aprenda a preparar fatias organotípicas de embriões de camundongos expressando GFP para imagens em tempo real do crescimento de nervos periféricos. Este método permite estudar o desenvolvimento neural com microscopia de fluorescência.

Cultura Slice organotípicas de GFP-expressando embriões de camundongos para imagens em tempo real de crescimento dos nervos periféricos (Vídeo) | JoVE Journal

Cultura Slice organotípicas de GFP-expressando embriões de camundongos para imagens em tempo real de crescimento dos nervos periféricos

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