Name: Cultura Slice organotípicas de GFP-expressando embriões de camundongos para imagens em tempo real de crescimento dos nervos periféricos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-29T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Aprenda a preparar fatias organotípicas de embriões de camundongos expressando GFP para imagens em tempo real do crescimento de nervos periféricos. Este método permite estudar o desenvolvimento neural com microscopia de fluorescência.

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Os autores agradecem a fonte original para a idéia de realizar cultura fatia em embriões de ratos 5. Gostaríamos de agradecer Joachim Kirsch ao apoio científico generoso e Degen Anna para agir como nosso gofer durante as filmagens. Este trabalho foi financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (Deutsche Forschungsgemeinschaft: Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9) e da Universidade de Heidelberg (Redes de Excelência Cluster Cellular).

Parte 1: Preparando-se para cortar e cultura. <ol><li> Prepare 10 cm de placas de cultura de tecido com corte médio (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% de soro fetal bovino, a glicose 0,5%, 1 mM de glutamina, 2,5 mM HEPES, pH 7.3) e 3 cm de Millicell-CM cultura 0,4 mícrons insere membrana e manter em estufa a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Aqueça 4% baixo ponto de fusão de agarose em PBS no microondas e mantê-lo na placa de aquecimento para que fique em aproximadamente 37 ° C. </li><li> Preencher 10 cm de pratos bacteriológica Petri com PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mm KH 2 PO 4) e colocar no gelo. </li><li> Configurar dispositivo de resfriamento micrótomo ou garantir que bandeja de tampão e de refrigeração elementos são armazenados no freezer para pré-cool-lo. </li></ol> Parte 2: incorporação de embriões. <ol><li> Dissecar os embriões do útero e examiná-las com um microscópio invertido fluorescente para verificar se há expressão GFP. </li><li> Embriões lugar em uma invertida de 10 cm Placa de Petri e orientá-los usando tiras de papel Whatman para remover PBS excessiva. </li><li> Aplicar agarose sobre o embrião para corrigi-lo nesta posição. Deixe agarose solidificar. </li><li> Limitar a área que circunda o embrião, cortando com uma lâmina de barbear. </li><li> Gire o embrião incorporado em seu outro lado. </li><li> Aplicar agarose adicionais sobre tecido embrionário para garantir que o embrião está completamente incorporado. </li><li> Prepare bloco agarose com bordas limpas e montagem em vibratome chuck usando Loctite 406, uma cola especial semelhante ao "Krazy Glue". </li></ol> Parte 3: Slicing procedimento. <ol><li> Configure a bandeja de tampão pré-resfriada eo elemento de refrigeração. </li><li> Insira o chuck com o tecido colado e adicione HBSS 1x (Ca 2 +-Mg 2 + livre HBSS, 10 mM HEPES pH 7,3, 500 U / ml de penicilina / estreptomicina) até coberta. </li><li> Inserir e fixar uma lâmina de micrótomo precleaned (70% etanol). </li><li> Prepare 350-450 fatias mm e transferi-los usando encurtado pipetas de vidro pasteur em placas de cultura de tecidos conservados no gelo. </li><li> Usando uma pinça, retire cuidadosamente cada fatia de agarose e transferência para membranas Millicell cultura. Cerca de 4 fatias podem ser cultivadas em uma membrana em uma placa de cultura de 10 cm de tecido preenchido com 6 mL de meio de cultura. </li><li> Incubar fatias a 37 ° C e 5% CO 2 (médio Cultura: DMEM, 25% 1x HBSS, 25% soro fetal bovino, a glicose 0,5%, 1 mM de glutamina, 2,5 mM HEPES, pH 7.3). Se um time-lapse realiza série de imagens deve-se manter constante o volume de meio. No caso da série programada de imagem para um curto espaço de tempo é suficiente para deixar o meio como ela é. Para períodos de mudanças mais cultura após 12-20 horas são recomendados. </li></ol> Parte 4: Imaging conseqüência do nervo espinhal ao microscópio. <ol><li> Nervos espinhais colocar uma imagem de 10 cm placa de cultura de tecidos, contendo membranas cultura Millicell com fatias, sob um microscópio fluorescente na posição vertical. </li><li> Rótulo a orientação das membranas cultura Millicell no palco microscópio para posicionar corretamente durante o próximo ponto de imagem tempo. </li><li> Imagem conseqüência do nervo espinhal utilizando 4x (abertura numérica [NA] 0,1), 10x (NA 0,3) ou 20x (NA 0.5) objetivos. </li></ol> A Figura 1 mostra uma série de imagens retratando o crescimento do nervo espinhal, durante 20 horas de cultura com objectivos de 4x e 10x. <img src="/files/ftp_upload/2309/2309fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura série de imagens de uma conseqüência do nervo espinhal em uma fatia transversal de um embrião tauGPF homozigótica. * = Neurônios motores da medula espinhal ventral, seta = DRG. O dorsal (D)-ventral eixo (V) da fatia é indicado. Scalebars: 200 mM.

<ol><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).</li>
<li>Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+slice+culture+system+for+the+imaging+of+nerve+development+in+embryonic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse.</a> Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).</li>
<li>Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+slice+preparation%3A+a+tribute+to+the+pioneer+Henry+McIlwain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain.</a> Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).</li>
<li>Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+circuitry+of+identified+projection+neurons+in+cat+visual+cortex+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices.</a> J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).</li>
<li>Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo slices.</a> Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).</li>
</ol>

Em uma extensa comparação de métodos para preparar culturas fatia embrionárias de embriões meados de gestação mouse (E10 - E12), temos observado que um vibratome produz, sem dúvida, os resultados mais confiáveis ​​no que diz respeito a ambos os viabilidade global das culturas e da reprodutibilidade a conseqüência padrões nervosas. Em contraste, as fatias preparadas usando um helicóptero tecido McIlwain 3 mostrou-se completamente inviável. Nós originalmente empregado um método guilhotina 4, em que u...

<table><tbody><tr><td>HBSS 10x</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>14180</td><td></td></tr><tr><td>Ferramentas de dissecação</td><td>Fine Science Tools</td><td>vários</td><td></td></tr><tr><td>Agarose L.M.P.</td><td>Invitrogen</td><td>15517-022</td><td></td></tr><tr><td>Papel Whatmann</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030917</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas curtas polidas com fogo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 100x</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Vibrátomo</td><td>Microm International</td><td>HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>analySIS</td><td>Soft Imaging System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insertos Millicell-CM</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG 50</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de 10 cm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633171</td><td></td></tr><tr><td>LOCTITE 406</td><td>Henkel Corp</td><td>142580</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>nenhum</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>9105.2</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Objetiva de x4</td><td>Olympus Corporation</td><td>série PL</td><td></td></tr><tr><td>Objetiva de x10</td><td>Olympus Corporation</td><td>série UPLFL &amp;#8211;PH</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Olympus Corporation</td><td>U-MNIBA2</td><td></td></tr><tr><td>Câmera CCD</td><td>Soft Imaging System</td><td>SIS F-View II</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento para câmara aquecida</td><td>Leica Microsystems</td><td>CTI-Controller 3700 e incubadora S #11531171</td><td></td></tr></tbody></table>

cultura slice organotípicas de gfp-expressando embriões de camundongos para imagens em tempo real de crescimento dos nervos periféricos

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Para muitos propósitos, o cultivo de embriões de rato vivo ex como fatias organotípicas é desejável. Por exemplo, nós empregamos uma linha de camundongo transgênico (tauGFP) em que a versão melhorada da proteína verde fluorescente (EGFP) é exclusivamente expressa em todos os neurônios do desenvolvimento do sistema nervoso central e periférico 1, permitindo a possibilidade de ambos os filmes a inervação o membro anterior e manipular esse processo com as técnicas farmacológicas e genéticas 2. O parâmetro mais crítico de sucesso no cultivo de culturas fatia tal é o método pelo qual as fatias são preparadas. Após extensos testes de uma variedade de métodos, descobrimos que um vibratome é o dispositivo melhor possível para cortar os embriões de tal forma que eles rotineiramente resultar em uma cultura que demonstra a viabilidade ao longo de um período de vários dias, e mais importante, se desenvolve em uma época forma específica. Para meados de gestação de embriões, o que inclui a consequência normal de nervos espinhais da medula espinhal e os gânglios da raiz dorsal para as suas metas na periferia e na determinação adequada do tecido ósseo e muscular. Neste trabalho, apresentamos um método para processamento de embriões de todo dia embrionário (E) E10 a E12 em 300-400 fatias micrômetro para o cultivo em um padrão de cultura de tecidos da incubadora, que pode ser estudado por até dois dias após a preparação fatia. Crítico para o sucesso desta abordagem é o uso de um vibratome a fatia cada embrião agarose-embedded. Isto é seguido pelo cultivo das fatias em cima insere cultura Millicell membrana colocada sobre um pequeno volume de meio, resultando em uma técnica de cultura de interface. Uma maca com uma média de 7 embriões rotineiramente produz pelo menos 14 fatias (2-3 fatias da região forelimb por embrião), que varia um pouco devido à idade dos embriões, bem como para a espessura das fatias. Cerca de 80% das fatias cultivadas mostram crescimento do nervo, que pode ser medido longo de todo o período de 2 cultura. Resultados representativos usando a linha do mouse tauGFP são demonstradas.

Nós apresentamos um método para preparar fatias organotípicas de embriões meados de gestação do rato para a imagem de cultivo e de lapso de tempo de crescimento dos nervos periféricos.

Cultura Slice organotípicas de GFP-expressando embriões de camundongos para imagens em tempo real de crescimento dos nervos periféricos

Para muitos propósitos, o cultivo de embriões de camundongo ex vivo como fatias organotípicas é desejável. Por exemplo, utilizamos uma linhagem de camundongos transgênicos (tauGFP) em...

O objetivo geral deste procedimento é preparar fatias transversais organotípicas da região do membro anterior de embriões de camundongo que expressam GFP para a obtenção de imagens do crescimento dos nervos espinhais. Isso é realizado primeiramente embutindo os embriões em agarose de ponto de fusão baixo e limitando a área do tecido e da agarose à região de interesse. O bloco de agarose é então montado para corte. Em seguida, os embriões embutidos no bloco são cortados com o vibrátomo. O passo final do procedimento é remover os aros ao redor dos cortes e transferir os cortes para placas de cultura. Os cortes são então cultivados e mostram o crescimento de nervos periféricos para a periferia, o que pode ser monitorado por microscopia de fluorescência.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o guilhotinamento ou o cortador de tecidos, é que os cortes são gerados de maneira mais controlada e apresentam viabilidade melhorada em cultura. Portanto, este método pode auxiliar no estudo da neurobiologia do desenvolvimento, como na análise do direcionamento e do crescimento dos nervos espinais, demonstrando que o procedimento será realizado por Isabel Barman. Inicie este procedimento preparando placas de cultura de tecidos de 10 centímetros com seis mililitros de meio de cultura e inserts de membrana de cultura millicell de 3 centímetros, com porosidade de 0,4 mícron.Mantenha-os no incubador a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, aqueça 4% de agarose de ponto de fusão baixo em PBS no micro-ondas e mantenha-o em uma placa aquecedora para que permaneça aproximadamente a 37 graus Celsius. Encha placas de Petri bacteriológicas de 10 centímetros com PBS e coloque-as sobre gelo.Em seguida, prepare o dispositivo de resfriamento Viome. Guarde a bandeja de tampão e os elementos de resfriamento no congelador até que estejam completamente congelados para realizar o embutimento. Primeiro, dissecar os embriões do útero.Examine-os com um microscópio fluorescente invertido e verifique a expressão de GFP. Em seguida, coloque os embriões em uma placa de Petri invertida de 10 centímetros utilizando tiras de papel Watman para orientá-los e remova o excesso de PBS. Aplique aros sobre o embrião para fixá-lo.Na posição orientada, aguarde a solidificação dos aros, corte os aros em excesso e, se desejar, o tecido ao redor da porção mediana do embrião. Gire o embrião embutido para o outro lado. Aplique aros adicionais sobre o tecido embrionário para garantir que o embrião esteja completamente embutido.Aguarde a solidificação dos aros. Prepare um bloco de aros com embrião embutido e bordas limpas. Por fim, cole a amostra em um porta-objetos com Loctite 4 0 6.Prepare a bandeja de tampão pré-resfriada e os elementos de refrigeração. Coloque o bloco com o tecido colado sobre o viome. Adicione um X-H-B-S-S ao bloco até que o tecido esteja coberto.Insira uma lâmina viome pré-limpa no suporte da lâmina. Em seguida, prepare fatias transversais com uma espessura de cerca de 350 a 450 micrômetros. Cada fatia é cortada usando um micrótomo HM six 50 V.Transfira as fatias para placas de cultura de tecidos com uma pipeta de Pasteur de vidro encurtada e mantenha-as em gelo. Usando um par de pinças, remova cuidadosamente os aros de todas as fatias. Em seguida, transfira as fatias para as membranas de cultura celular Millicell, dispostas quatro fatias por membrana, em placas de cultura de 10 centímetros contendo seis mililitros de meio de cultura pré-aquecido.Incube as fatias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até o início da imagem em lapso de tempo e entre os intervalos de aquisição. Coloque a placa de cultura tecidual contendo as membranas de cultura celular Milli com as fatias sob um microscópio fluorescente ereto e localize os nervos espinhais; visualize o crescimento dos nervos espinhais utilizando objetivas de 4 x, 10 x ou 20 x. Identifique a orientação das membranas de cultura celular Milli na platina do microscópio para reposicioná-las corretamente durante o próximo ponto de aquisição, caso não se disponha de um sistema estável de temperatura e dióxido de carbono.O ambiente mostrado aqui é uma série de imagens do crescimento de nervos espinhais durante 24 horas de cultivo em uma fatia transversal de um embrião homozigoto tau GFP. A estrela indica neurônios motores da medula espinhal ventral e a seta indica o gânglio da raiz dorsal (DRG). O painel superior foi obtido com uma objetiva de quatro X e o painel inferior com uma objetiva de 10 x.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar fatias transversais organotípicas de embriões de camundongo que podem ser utilizadas para imagens do crescimento de nervos espinhais.

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Imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro de camundongo embrionário

Aprenda a preparar fatias organotípicas de embriões de camundongos expressando GFP para imagens em tempo real do crescimento de nervos periféricos. Este método permite estudar o desenvolvimento neural com microscopia de fluorescência.

Cultura Slice organotípicas de GFP-expressando embriões de camundongos para imagens em tempo real de crescimento dos nervos periféricos (Vídeo) | JoVE Journal

Cultura Slice organotípicas de GFP-expressando embriões de camundongos para imagens em tempo real de crescimento dos nervos periféricos

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