Gravações fisiológicos de NMJs Output High and Low no músculo extensor Crayfish Leg

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como expor e distinguir os terminais motores fásicos e tônicos por meio de coloração morfológica e gravação eletrofisiológica no músculo extensor da lagosta. Isso é realizado primeiramente pinçando a primeira ou segunda perna locomotora de uma lagosta de tamanho médio, removendo o esqueleto externo e retirando o músculo flexor no segmento meita. Isso expõe o músculo extensor e o feixe nervoso.

O segundo passo do procedimento é corar a preparação com iodo de tetraetilamino estéril e metilperitonéio, ou quatro D dois asp, para visualizar os axônios e terminações nervosas. O terceiro passo do procedimento é estimular seletivamente neurônios tônicos e/ou fásicos, e simultaneamente realizar gravações intracelulares de PEPS evocados na fibra muscular. O passo final do procedimento é usar um eletrodo focal para registrar eventos quânticos espontâneos e evocados a partir das terminações.

No final, podem ser obtidos resultados que separam os terminais tônicos e fásicos, morfológica e fisiologicamente, por meio de microscopia de imunofluorescência e eletrofisiologia. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da fisiologia sináptica, como fadiga muscular, depressão sináptica e crosstalk sináptico. O experimento começa com a coleta cuidadosa do camarão, evitando suas garras.

Destaque a perna do corpo no segmento do podísio. Um aperto firme no segmento do podísio induz o lagostim a automatizar, ou seja, a desprender naturalmente a primeira perna ambulatória. O lagostim interromperá a hemorragia e deverá ser devolvido ao seu tanque de contenção.

O lagostim não é sacrificado. Coloque a pata sobre um pedaço de papel de tecido para que o preparo possa ser girado facilmente durante os cortes. Gire a pata até que o lado externo, que é o lado lateral, fique voltado para cima no prato de dissecação.

Isso geralmente tem o lado arqueado voltado para cima. Usando uma lâmina de barbear afiada presa a um quebra-lâminas de bisturi, risque a cutícula dentro do segmento meite seguindo o padrão mostrado na figura. Tenha cuidado para não cortar muito distalmente na incisão de dorsal para ventral ao longo da articulação carpopodal do meite.

Esse corte resulta em uma janela na camada de meite acima dos músculos da perna subjacentes. Deixe a cutícula no lugar por enquanto. Coloque a preparação em um recipiente de dissecação contendo solução salina fisiológica para lagostim.

Neste momento, insira um alfinete no centro do segmento carpod e na face dorsal do segmento ischia pod com pinças finas, levante levemente a janela cortada na cutícula a partir da extremidade distal e, usando a lâmina, corte as fibras do músculo flexor afastando-as da cutícula. Continue cortando de maneira distal para proximal e, por fim, remova a janela da cutícula. Para expor o músculo extensor, o músculo flexor subjacente deve ser removido.

Se pare o tendão do músculo flexor deslocando-o do músculo flexor com um pino. Em seguida, corte o tendão na articulação metacarpo-carpal. Como mostrado, tenha muito cuidado para puxar o tendão para longe da cavidade da perna antes de fazer o corte e para cortar apenas o tendão, e não o nervo principal da perna que está no lado interno do tendão.

Pince o tendão no local onde foi cortado com pinças e retire o músculo flexor da perna levantando-o em direção distal. Para expor o nervo do músculo extensor, corte o nervo principal da perna na articulação meropodocarpal e puxe cuidadosamente o nervo principal da perna de volta sobre o músculo extensor. A separação do nervo do músculo extensor do nervo principal da perna pode ser facilitada puxando suavemente o coto distal do nervo principal da perna para o lado da preparação. Ao descolar o nervo principal da perna sobre o músculo extensor, pode ser necessário cortar pequenos ramos do axônio inibitório.

O feixe nervoso pode ser visualizado com coloração por azul de metileno. No entanto, o azul de metileno não seria utilizado para gravações eletrofisiológicas nesta imagem superior. Setas vermelhas indicam o trajeto nervoso de interesse.

O feixe nervoso de interesse é o feixe maior que se ramifica do nervo principal da perna próximo à extremidade proximal de onde está o meropodito. Observe os ramos axonais e os dois axônios facilmente visíveis dentro do nervo. Agora que o nervo e o músculo estão expostos, prepare o aparato utilizado para o experimento.

Os registros intra e extracelulares são realizados com um estágio padrão de cabeça e amplificador. Utilizamos um amplificador modelo Axon Clamp dois B e um estágio de cabeça um XLU. São necessários três eletrodos, sendo um intracelular e dois extracelulares.

Os dois eletrodos extracelulares serão usados para estimular o nervo e registrar eventos sinápticos evocados e espontâneos. Polir as pontas dos eletrodos focais com chama e curvá-los ligeiramente sobre um elemento aquecedor. Após encher um eletrodo focal com solução salina, colocá-lo no suporte do eletrodo estimulador e inserir o fio do estimulador de modo que entre em contato com a solução salina.

Isso é conectado a uma unidade de isolamento de estimulação P 15 de grama, que por sua vez está conectada a um estimulador S 88 da grama. Durante as gravações eletrofisiológicas, o corante vital para D dois ASP é usado para visualizar os axônios e corar os axônios; troque o salino do banho por salino contendo cinco micromolares de quatro D dois como corante por cinco minutos. Após cinco minutos, reabasteça o recipiente com salino fisiológico de lagostim, coloque o preparado sob um microscópio e utilize uma objetiva Forex.

E com ocular de 10 x, mova o eletrodo estimulante para a área de interesse. O próximo passo é posicionar a luz do eletrodo estimulante tipo macro patch sobre o axônio fásico ou o tônico. Esta fotografia de uma preparação corada com dois corantes entre quatro mostra que o axônio tônico é mais visível devido ao maior conteúdo mitocondrial.

Os terminais tônicos apresentam numerosas varicosidades e os terminais fásicos são de natureza mais fina sob microscopia de fluorescência. E o objetivo de 20 x posiciona o eletrodo sobre o axônio tônico ou fásico. Aqui, o eletrodo está sendo posicionado sobre o axônio tônico.

Coloque o eletrodo intracelular em seu micromanipulador e insira o eletrodo intracelular em uma célula muscular extensora. Isso será usado para registrar potenciais pós-sinápticos excitatórios intracelulares ou EPSPs. Para gravação de EPSPs qualitativos.

Coloque o segundo eletrodo focal em um micromanipulador. Isso é feito removendo o eletrodo intracelular anterior e seu suporte e substituindo-os pelo suporte de eletrodo limpo. Use o micromanipulador para posicionar a luz do segundo eletrodo focal diretamente sobre uma varicosidade sináptica.

A resistência do eletrodo e do selo é determinada pela passagem de pulsos de corrente de teste através do eletrodo. Em nossos experimentos, as resistências de selo variaram de 0,3 a um mega ohm e a resistência do eletrodo variou de 0,5 a um. A resistência de selo em mega ohm pode ser monitorada durante toda a gravação.

Quando estiver pronto para iniciar a estimulação, ligue o software scope 5.0 e comece a estimular o axônio isolado. No feixe nervoso, o axônio tônico é estimulado pelo eletrodo de sucção e os PEPSs da fibra muscular são registrados com um eletrodo intracelular ou extracelular. Os PEPSs são registrados em um computador por meio de uma interface power lab forest.

Após a estimulação do axônio tônico, o eletrodo estimulador pode ser movido para o axônio fásico e o experimento pode ser repetido após a estimulação do nervo. O eletrodo intracelular registra os PEPS gerados em resposta à atividade dos neurônios motores tónicos e fásicos. A facilitação sináptica das junções neuromusculares tônicas depende da frequência da estimulação nervosa, conforme mostrado aqui para trens sucessivos de aproximadamente 20 estímulos cada, com frequência de 60 hertz.

Observe a facilitação que ocorre com múltiplos estímulos. Esta figura compara as amplitudes dos PEPS gerados pela estimulação do nervo tônico em frequências de 20 hertz em azul, 40 hertz em verde e 60 hertz em vermelho; observe a acentuada facilitação demonstrada em frequências mais altas de estimulação. Os terminais tônicos possuem baixa eficácia sináptica, mas exibem respostas facilitadas acentuadas, como mostrado.

Aqui estão os PEPS tônicos isolados, e em seguida as respostas fásicas são sobrepostas na mesma escala. Em contraste com os terminais tônicos, os terminais fásicos apresentam alta eficácia qualitativa, mas exibem depressão sináptica com estimulação de alta frequência. A depressão sináptica nos terminais fásicos também está relacionada à frequência de estimulação, conforme mostrado aqui.

Uma estimulação contínua de cinco hertz durante 30 minutos deprime a resposta na junção neuromuscular. Com frequência de estimulação mais alta, o preparado apresentará depressão mais rapidamente com a estimulação apropriada. A junção neuromuscular do lagostim gera EPSPs sem potenciais de ação.

Esses PEPS podem ser usados para investigar as propriedades graduais que compõem os sinais elétricos graduais nesses músculos. Aqui, são mostradas as respostas sinápticas graduais do terminal tônico. Observe que nem todos os ensaios de estimulação resultam em um evento gradual.

A contagem direta de eventos quantais é possível com estimulação de baixa frequência para cada resposta evocada. O número de eventos quantais pode ser facilmente determinado para os terminais tônicos. Ao contar os eventos quantais, as respostas sinápticas do neurônio motor fásico podem ser registradas da mesma maneira.

No entanto, as respostas evocadas são multiquantitativas por natureza. O conteúdo médio quantitativo é estimado utilizando-se a amplitude média ou a área dos desvios, juntamente com a amplitude média do pico ou a área dos eventos espontâneos. Um lembrete final: tenha cuidado ao remover o músculo flexor para não danificar o nervo que inerva o músculo extensor.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.