Name: Gravações fisiológicos de NMJs Output High and Low no músculo extensor Crayfish Leg (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprenda a realizar gravações eletrofisiológicas de terminais motores tônicos e fásicos no músculo extensor da perna de lagostim. Este método combina coloração morfológica e técnicas de registro intracelular para estudar respostas sinápticas.

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Agradecemos a Mr. Craig D. Slaven (Departamento de Inglês da Universidade de Kentucky) para obter assistência editorial. Apoiada pela Universidade de Kentucky, Departamento de Biologia, Instituto de Estudos de Graduação e Faculdade de Artes e Ciências.

1) Introdução Neurônios motores comunicar com uma fibra muscular nas sinapses que são referidos coletivamente como uma junção neuromuscular (MNJ). NMJs pode ser acessado facilmente em preparações mais músculo lagostim. Muitos dos NMJs lagostas demonstrar não spiking potenciais pós-sinápticos excitatórios (EPSP) similar aos sinais elétricos gerados classificados nos dendritos pós-sinápticos no SNC de mamíferos ou respostas subliminares observado no NMJs vertebrados (Wiersma &amp; Van Harreveld, 1938; Katz &amp; Kuffler, 1946) . O NMJs lagostas podem servir como modelos fundamentais synaptic para fornecer informações gerais para a transmissão sináptica e diferenciação sináptica. Geralmente, unidades motoras regular aspectos do comportamento animal através do tipo de comunicação sináptica em NMJs e propriedades dos músculos. Desde a primeira observação de "fast" e "lento" contrações musculares em caranguejo e lagosta mais perto muscular (Lucas, 1907, 1917), a diferenciação muscular contrátil semelhante tem sido descrita em outros tipos de crustáceos, como músculo flexor abdominal (Kennedy &amp; Takeda, 1965a , b) e extensores dos membros (Van Harreveld &amp; Wiersma, 1936). "Fast" contrações iniciar respostas rápidas. Por exemplo, o flip tail crustáceo é um comportamento rápido. "Slow" contrações manter movimentos lentos e ajudar a manter a postura (Bradacs et al., 1997). Correspondente ao "rápido" e "lento" contrações musculares ", saída fásica / alta" e "tônico de saída / baixa" são amplamente utilizados para descrever os neurônios motores. A diferença na taxa e tempo de contração muscular é em parte relacionada a diferenças na estrutura pré-sináptico sináptico e força sináptica (King et al., 1996). Proteínas miofibrilares expressão isoforma também é importante nas diferenças contráteis, mas em preparações como a do músculo extensor da perna, na qual uma fibra dado é inervada por dois tipos de neurônios motores, o foco é sobre as diferenças sináptica dos terminais, já que os terminais partes da célula-alvo mesmo (Mykles et al., 2002). Um estudo anterior examinou os dois axônios motores excitatórios dos extensores da perna e descreveu os fenótipos fásicas e tônicas (Bradacs et al., 1997). Neste relatório, nós demonstramos como realizar a dissecção e obter as gravações para que outros possam continuar a investigar as propriedades da diferenciação sináptica desses terminais nervosos. Vistos com microscopia eletrônica de transmissão, várias séries de cortes obtidos a partir da tônica e fásica terminais de lagostas do músculo extensor da perna revelou que os terminais tônica vesículas contêm mais do que RRP terminais fásica; as mitocôndrias são mais prevalentes em neurônios tônica, e as sinapses nos terminais fásica são mais complexas do que aquelas em sinapses de baixo rendimento, uma vez que contêm várias zonas ativas com espaçamento variado (Miller et al, 2002; Johnstone et al, 2008;. King et al, 1996;.. Bradacs et al, 1997). O baixo rendimento terminais tônica também são mais suscetíveis de aumentar a transmissão sináptica com a serotonina neuromodulador (5-HT) do que são os terminais fásica (Cooper et al., 2003). O fato de que a tônica e fásica MNJ estão presentes na mesma fibra muscular torna mais fácil avaliar as diferenças pré-sináptica em uma fibra muscular determinado e para abordar questões de fadiga muscular, depressão sináptica e conversas cruzadas sináptica. Várias questões continuam por resolver nesta preparação, como se há diferenças na densidade do receptor pós-sináptico e subtipos de receptores de glutamato nas metas pós-sináptico para a tônica e fásica terminais, mas uma melhor compreensão das diferenças fundamentais na anatomia e fisiologia destes duas unidades motoras ajudará na construção de uma base de conhecimento mais profundo. A esperança é que os princípios fundamentais aprendeu nesta preparação synaptic será aplicável a outras sinapses em várias preparações e vai reforçar as investigações futuras neste modelo sináptico da lagosta. 2) Métodos <ol><li> Todos os experimentos são conduzidos nas pernas primeiro ou segundo andar de lagostas de tamanho médio (Procambarus clarkii). Os animais são alojados individualmente em recipientes plásticos com água oxigenado. A temperatura do quarto animal é na faixa de 13 ° C-16 ° C. Os animais são alimentados com comida de peixe seco ea água alterada em uma base semanal. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Esquema de uma perna lagostas andando e os seis segmentos distal. </li><li> O aspecto distal da perna andando em um crustáceo é anatomicamente dividido em seis segmentos (Figura 1). O extensor de perna está localizado no meropodite, eo feixe de nervos que será isolado é perto do ischiopodite meropodite conjunta. O axônio tônica ou fásica podem be seletivamente estimuladas, conforme necessário para fins fisiológicos depois de serem expostos. </li><li> Cooper e Cooper (2009) descreveu alguns aspectos da dissecção inicial, incluindo métodos para expor o Excitor do motor abridor de neurônio na região meropodite, mas sua descrição não fornece os cuidados necessários para proteger o músculo extensor de danos, como era não é necessário para lidar com a preparação do músculo abridor. , A fim de proteger o extensor, a perna andando de primeira ou segunda é removido do crustáceo, medindo 60-10 cm de comprimento do corpo (Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA), induzindo o animal a automatizar o membro com beliscar forte distal ao plano de fratura no segmento ischiopodite. A perna é colocada sobre a placa com a dissecção lateral (lado externo) de frente para o espectador. A perna está ligado ao redor até que o espectador pode ter certeza de fora (lateral) é voltada para cima sobre a placa de dissecação, geralmente com o lado arqueado para cima (Figura 2). Colocando a perna em um pedaço de papel de tecido facilita a sua vez a preparação ao fazer esses cortes. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: A lateral da meropodite, geralmente o lado que é arqueado, está voltado para cima na placa de dissecção .. </li><li> Com um disjuntor de lâmina de bisturi e titular, uma lâmina afiada é usada para a cutícula etch até pouco cortando no padrão mostrado na Figura 3 para o segmento meropodite. Cuidado é tomado para não cortar demais distal na dorsal para cortar ventral pela articulação meropodite-carpopodite. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: O segmento meropodite com linhas como um padrão sugerido para ataque para fora da janela de cutícula. A preparação é colocada em solução salina. O prato deve ter uma dissecção Sylgard revestimento (Dow Corning) na parte inferior (1cm de espessura). Sylgard A é usado para que os pinos de insetos pode ser preso a ele para segurar a preparação ainda. Neste ponto, um pino é preso no meio do segmento carpopodite e no aspecto dorsal do segmento ischiopodite (Figura 4). Preparações dissecados são banhadas em solução salina lagostas padrão, modificadas a partir da solução Van Harreveld s (1936), que é feita com 205 NaCl; 5.3KCl; 13,5 CaCl 2; 2H 2 O, 2,45 MgCl 2; 6H 2 O, 5 HEPES e ajustados para pH 7,4 (em mM). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: O segmento meropodite com janela cortada sendo levantado. Observe a localização dos pinos dissecção. </li><li> A cutícula é levemente levantada na região distal e as fibras musculares são cortados a partir da cutícula, fazendo cursos para a base da perna. A cutícula pode ser retirada. </li><li> O apodeme (tendão) é cortado na articulação meropodite-carpopodite. Um pino é colocado sobre a superfície interna do tendão flexor para mostrar onde o corte é para ser feita (Figura 5). O tendão é então comprimido onde foi cortado com uma pinça e do músculo flexor puxado para fora, levantando-o em uma direção caudal (Figura 6), expondo o nervo da perna principal eo músculo extensor. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5: O apodeme do músculo flexor é destaque deslocando-o do flexor com um alfinete. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6: O apodeme do músculo flexor é cortada e removida com cuidado para não danificar o nervo da perna principal. </li><li> O nervo da perna principal é cortar na articulação meropodite-carpopodite e cuidadosamente puxado para trás sobre o músculo extensor. A superfície medial do músculo é usado ao longo deste estudo. A separação do nervo para o músculo extensor do nervo principal da perna pode ser melhorada, puxando levemente o coto distal do nervo principal da perna para o lado da preparação. Ao descascar o nervo da perna principal para trás sobre o músculo extensor, pequenos ramos de axônio pode precisar de ser cortado. Estes são ramos do neurônio motor inibitórios para o músculo extensor. O maior pacote de ramificação do nervo da perna principal perto da extremidade proximal do meropodite é o feixe de nervos pequenos de interesse. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7: O nervo da perna principal é cortado e puxado para trás em uma direção proximal. Este feixe de nervos pode ser visto com coloração de azul de metileno (Figura 8) ou com 4-Di-2-ASP fluorescentes mancha (Figura 9). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig8.jpg" alt="Figura 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 8"> Figura 8: O músculo extensor manchado com azul de metileno. Observe a ramificação do axônio e osdois axônios facilmente visível dentro do nervo. Red setas demarcar a pista do nervo. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig9.jpg" alt="Figura 9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 9"> Figura 9: Os axônios do nervo motor manchada com 4-Di-2-ASP. O axônio tônica é mais brilhante visível devido ao maior conteúdo mitocondrial. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig10a.jpg" alt="Figura 10A" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 10A"> Figura 10A: terminais de neurônios individuais fásicas e tônicas corados com 4-Di-2-ASP. Observe o varicosidades nos terminais tônica ea natureza dos terminais thin fásica. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig10b.jpg" alt="Figura 10B" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 10B"> Figura 10B-Tonic observou <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig10c.jpg" alt="Figura 10C" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 10C"> Figura 10C-fásicos observou </li></ol> 3) Perfis fisiológicos <ol><li> Para observar os potenciais excitatórios pós-sinápticos (EPSPs) dos neurônios tônica ou fásica, um dos axônios isolados no feixe de nervos é estimulado por um eletrodo de sucção (figura 11) conectados a um estimulador Grass enquanto potenciais intracelulares no músculo são monitorados (Johnstone et al., 2008). Estimulação a 70 Hz é aplicado para o axônio tônica, a fim de promover uma resposta facilitado para o NMJs de baixo débito, ou um único pulso (1 Hz) é aplicado para o axônio fásica a fim de obter EPSPs grandes da saída de alta NMJs como mostrado na Figura 12. O EPSPs são gravados para um computador através de uma interface PowerLab/4s. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig11.jpg" alt="Figura 11" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 11"> Figura 11: Estimular eletrodo colocado sobre um único axônio dentro do feixe de nervos. Observe a linha verde delineando as duas principais axônios. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig12.jpg" alt="Figura 12" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 12"> Figura 12: potenciais pós-sinápticos (EPSPs) dos neurônios tônica ou fásica como obtidas por gravações intracelular. </li><li> Investigação da natureza da facilitação sináptica e depressão sináptica pode ser abordado por vários paradigmas experimentais com o NMJs de saída baixa e alta. Facilitação da NMJs baixo débito depende da freqüência, como mostrado para os pulsos 20, 40 e 60 Hz de cerca de 20 estímulos (Figura 13). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig13.jpg" alt="Figura 13" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 13"> Figura 13: EPSPs em resposta a um trem de pulsos de estimulação dada em três diferentes freqüências 20, 40 e 60 Hz em solução salina lagostas normal. </li><li> A taxa de depressão sináptica à freqüência de estimulação também está relacionada ao NMJs alto rendimento. Figura 14 mostra um 5 Hz de estimulação contínua pressionando o MNJ mais de 30 min. Com maior frequência de estimulação, a preparação vai diminuir mais rapidamente (Bradacs et al., 1997). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig14.jpg" alt="Figura 14" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 14"> Figura 14: EPSP amplitude da resposta fásica durante 5 Hz a estimulação para induzir a depressão. </li></ol> 4) As respostas quântica <ol><li> Um procedimento semelhante ao descrito para o músculo opener do lagostim (Cooper e Cooper, 2009) é utilizado nesta preparação. O EPSPs quantal diretamente sobre regiões identificáveis ​​do terminal nervoso são registrados, colocando a luz de um eletrodo de registro macro-patch em varicosidades sináptica visualizado com o corante vital 4-Di-2-Asp (5 M, 5 min de tratamento, Cooper et al, 1995;. Magrassi et al, 1987).. O espontâneo, bem como as respostas evocadas quântica podem ser registradas ao longo dos terminais nervosos. O evocada e espontânea potenciais sinápticos são registradas com o eletrodo macro-patch (Dudel, 1981; Wojtowicz et al, 1991;. Mallart, 1993). Kimax de vidro (diâmetro externo: 1,5 mm) foi puxado e fogo-polido para produzir dicas patch com diâmetros internos variando de 10 a 20 microns (Figura 15). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig15.jpg" alt="Figura 15" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 15"> Figura 15: A luz de um eletrodo de registro macro-patch .. O lúmen do eletrodo é preenchido com o meio de banho. O amplificador é o mesmo que o usado para as gravações intracelular mencionados acima. Eletrodo ea resistência selo pode ser determinada passando impulsos de teste de corrente através do eletrodo. Em nossos experimentos, resistências selo variou 0,3-1,0 MOhm ea resistência do eletrodo variou 0,5-1,0 MOhm. Resistência selo pode ser monitorada durante a gravação. </li><li> Contagem direta de eventos quântica é possível com freqüências de estimulação baixa. Para cada resposta evocada, o número de eventos quântica pode ser facilmente determinado para os terminais de saída baixa (Figure 16). Estas contagens diretas podem ajudar a estimar o teor médio quântica (Del Castillo &amp; Katz, 1954;. Cooper et al, 1995). Desde o evocado NMJs saída de alta produção de multi-quantal eventos evocados, a amplitude média da zona de desvios, juntamente com a amplitude de pico média ou área de eventos espontâneos, pode ser usado para aproximar o conteúdo significa quântica (Cooper et al. , 1995). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig16.jpg" alt="Figura 16" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 16"> Figura 16 traços Focal gravados de um fásica e tônica MNJ. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig17.jpg" alt="Figura 17" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 17"> Figura 17 </li></ol>

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Physiol. 35, 310-331 (1907).</li><li>Lucas, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+summation+of+propagated+disturbances+in+the+claw+of+Astacus+and+on+the+double+neuromuscular+system+of+the+abductor.">On summation of propagated disturbances in the claw of Astacus and on the double neuromuscular system of the abductor.</a> J. Physiol. 51, 1-35 (1917).</li><li>Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+that+stain+living+nerve+terminals.">Fluorescent probes that stain living nerve terminals.</a> J. Neurosci. 7, 1207-1214 (1987).</li><li>Millar, A. G., Bradacs, H., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+relationship+between+release+probability+and+readily+releasable+vesicles+in+depressing+and+facilitating+synapses.">Inverse relationship between release probability and readily releasable vesicles in depressing and facilitating synapses.</a> J. Neurosci. 22, 9661-9667 (2002).</li><li>Millar, A. G., Zucker, R. S., Ellis-Davies, C. G., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sensitivity+of+neurotransmitter+release+differs+at+phasic+and+tonic+synapses.">Calcium sensitivity of neurotransmitter release differs at phasic and tonic synapses.</a> J. Neurosci. 25, 3113-3125 (2005).</li><li>Msghina, M., Govind, C. K., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+structure+and+transmitter+release+in+crustacean+phasic+and+tonic+motor+neurons.">Synaptic structure and transmitter release in crustacean phasic and tonic motor neurons.</a> J. Neurosci. 18, 1374-1382 (1998).</li><li>Msghina, M., Millar, A. G., Charlton, M. P., Govind, C. K., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+entry+related+to+active+zones+and+differences+in+transmitter+release+at+phasic+and+tonic+synapses.">Calcium entry related to active zones and differences in transmitter release at phasic and tonic synapses.</a> J. Neurosci. 19, 8419-8434 (1999).</li><li>Mykles, D. L., Medler, S. A., Koenders, A., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibrillar+protein+isoform+expression+is+correlated+with+synaptic+efficacy+in+slow+fibres+of+the+claw+and+leg+opener+muscles+of+crayfish+and.">Myofibrillar protein isoform expression is correlated with synaptic efficacy in slow fibres of the claw and leg opener muscles of crayfish and.</a> 205 (4), 513-522 (2002).</li><li>Sparks, G., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-HT+offsets+homeostasis+of+synaptic+transmission+during+short-term+facilitation.">5-HT offsets homeostasis of synaptic transmission during short-term facilitation.</a> J. Applied Physiol. 96, 1681-1690 (2004).</li><li>Sohn, J., Mykles, D. L., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical,+physiological+and+biochemical+characterization+of+muscles+associated+with+the+articulating+membrane+in+the+dorsal+surface+of+the+crayfish+abdomen.">The anatomical, physiological and biochemical characterization of muscles associated with the articulating membrane in the dorsal surface of the crayfish abdomen.</a> J. Exp. Zool. 287, 353-377 (2004).</li><li>Tsien, R. W., Harata, N. C., Choi, S. W. P. y. l. e., Aravanis, A. M., AM, G. C. h. e. n. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles,+quanta+and+synaptic+plasticity.+Molecular+Mechanisms+of+synaptic+function.">Vesicles, quanta and synaptic plasticity. Molecular Mechanisms of synaptic function.</a> , (2001).</li><li>Van Harreveld, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+solution+for+freshwater+crustaceans.">A physiological solution for freshwater crustaceans.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34, 428-432 (1936).</li><li>Van Harreveld, A., Wiersma, C. A. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+triple+innervation+of+the+crayfish+muscle.">The triple innervation of the crayfish muscle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 22, 667-667 (1936).</li><li>Wiersma, C. A. G., Van Harreveld, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+frequency+of+stimulation+on+the+slow+and+fast+contraction+in+crustacean+muscle.">The influence of the frequency of stimulation on the slow and fast contraction in crustacean muscle.</a> Physiol. Zool. 11, 75-81 (1938).</li><li>Wojtowicz, J. M., Smith, B. R., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+recruitment+of+silent+synapses.">Activity-dependent recruitment of silent synapses.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 627, 169-179 (1991).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós demonstramos neste relatório como dissecar, registrar e quantificar as respostas sinápticas em uma preparação neuromuscular lagostas único em que ambos os terminais de alta e de baixa produção inervam as fibras musculares mesmo. Os preparativos neuromuscular na lagostas oferecem muitas vantagens sobre as junções neuromusculares vertebrados, uma vez que apenas alguns neurônios motores excitatórios são necessários para inervam um músculo, e uma vez que os neurônios são identificáveis, desde a preparação para a preparação (Atwood, 1976). Além disso, o neurotransmissor excitatório é o glutamato, e os potenciais pós-sinápticos excitatórios (EPSP) são classificados, assim, as propriedades biofísicas de eventos classificados são análogas às dendrites dos neurónios no SNC de vertebrados. As correntes quântica, no entanto, podem ser monitoradas diretamente nos locais pós-sinápticos (Cooper et al., 1995). Estimulação repetitiva 5 Hz do nervo fásica dá origem a EPSPs grandes que se tornam extremamente deprimida depois de vários minutos. Este tipo de depressão é comum em artrópodes fásica neuromuscular junções (Atwood e Cooper, 1996). A presença dos terminais tônica ao lado dos terminais fásica permite avaliar se o alvo pós-sináptica é bastante modificado durante e após a depressão do fásica do neurônio motor. Além disso, os terminais de saída de baixa fornecer uma preparação boa para investigar os mecanismos que estão por trás de facilitação sináptica (Desai-Shah et al, 2008;. Desai-Shah e Cooper, 2009) Os terminais de saída de alta proporcionar um play ground para investigar a modulação da taxa de depressão sináptica eo processo de recuperação. Preparações acessível e viável deve ajudar a decifrar os mecanismos por trás da depressão sináptica. Nessa preparação extensor lagostas perna, aplicação exógena de serotonina é outra ferramenta para investigar a recuperação da depressão sináptica e, potencialmente, um meio de promover investigação sobre a mobilização de piscinas das vesículas sinápticas. Esta preparação proporciona várias vantagens experimental, já que as fibras musculares individuais são inervadas por neurônios motores tanto fásicas e tônicas. Como a serotonina aumenta o número de vesículas que são liberados com a estimulação evocada, e uma vez que promove a recuperação durante a depressão, é evidente que há alguma modulação das piscinas vesícula para aumentar a probabilidade de fusão com a presença de serotonina (Johnstone et al., 2008 ; Logsdon et al, 2006;. Sparks et al, 2004).. Modelos que explicam a dinâmica das piscinas vesícula dentro do terminal nervoso pré-sináptico durante a estimulação de baixa freqüência, em oposição a um estado depressivo, também precisam ser considerados entre os diferentes protocolos experimentais que são possíveis com esta preparação. Tem-se observado em outros sistemas que cerca de 30% do pool vesícula passa por uma reciclagem rápida, enquanto que o resto das vesículas reciclados passar por um caminho tradicional de reciclagem lenta através do retículo endoplasmático (Harata et al, 2001;. Tsien et al. , 2001). Tais caminhos dupla também podem estar presentes neste sistema. Se ATP está faltando no estado depressivo do terminal pré-sináptico, em seguida, encaixe e desencaixe pode não ser capaz de ocorrer, assim, muitas vesículas mais descarregados permaneceria na superfície sináptica. Desde vesículas são mais rapidamente liberado quando os terminais estão expostos a 5-HT, é possível que mais estão contidos dentro da piscina prontamente liberável (RRV). No entanto, no estado depressivo, com redução da ATP, a atracação e desatracação podem ser bloqueados, mesmo na presença de 5 HT, que novamente sai vesículas descarregado na superfície sináptica. Desde que os dados preliminares sugerem que as vesículas são liberados ao longo do tempo com a exposição prolongada HT 5 e estimulação, a distribuição da piscina vesícula dos caminhos de reciclagem rápida e lenta pode ser inclinado para ter vesículas competente para re-lançamento (de Johnstone et al. , 2008; ver reviews-Desai-Shah et al, 2008;. Desai-Shah e Cooper, 2009) Com as técnicas de gravações macropatch focal das correntes pós-sináptico e medidas de quanta única das regiões definidas do terminal nervoso motor, pode-se fazer perguntas para determinar se a depressão sináptica está ocorrendo como resultado de vesículas menos ser liberado ou por causa de alterações da função de receptores pós-sinápticos. Tem sido demonstrado que as vesículas são mais sensíveis à fusão no MNJ fásica da preparação para uma exposição de cálcio iguais (Miller et al. 2005), o que provavelmente contribui para o maior teor médio de quantal dos terminais fásica (Msghina et al. , 1998, 1999). Além disso, as diferenças no frequenin proteínas, cálcio binding (Jeromin et al., 1999) e ultra-estrutura (King et al., 1996) contribuem para a eficácia diferencial sináptica (Cooperet al., 2003). Alguns estudos anteriores têm explorado o fenótipo muscular das fibras musculares extensor (Bradacs et al, 1997;. Cooper et al, 2003).. Comparando-se a regulação da diferenciação muscular para tipos de fibras puramente tônica e fásica do crustáceo para tipos de fibras mistas, como para os extensores da perna que é inervada devidamente, pode fornecer pistas para a expressão muscular fenótipo e regulação (LaFramboise et al, 2000;. Sohn et al, 2000;. Griffis et al, 2001;. Mykles et al, 2002).. Muitas questões fundamentais continuam a ser combatidos em neurobiologia, e esta preparação pode ajudar na luta contra alguns deles. A alguns tópicos de interesse no campo, hoje, que pode ser abordada com o extensor da perna incluem: 1) Determinar os mecanismos celulares subjacentes à depressão sináptica dentro alta terminais de saída (Is a depressão devido a uma redução de Ca2 + entrada, falta de uma competente prontamente liberável vesícula piscina (RRV), e / ou pós-sinápticos receptividade alteradas?) 2) Determinar o papel mecanicista da 5-HT, quando aplicado após a indução de depressão sináptica para promover uma recuperação mais rápida, e 3) Determinar se as formas das quantal correntes que surgem a partir da estimulação fásica terminais estão sendo alterados durante a indução de depressão para tratar componentes pré e pós-sináptico de depressão sináptica. Este MNJ é importante para a investigação em curso e futuros pesquisadores, porque permite-nos obter informação pertinente que aborda os mecanismos de subalterno de desempenho sináptica medida diretamente nos locais de lançamento. A pesquisa atual nesta área é fornecer informações sobre a modulação da depressão sináptica de 5-HT e da dinâmica das piscinas vesícula. Temas dizem respeito aos princípios fundamentais da transmissão sináptica relevantes para todos os sistemas neural.

<ol><li> Lagostim (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., EUA. </li><li> Padrão lagostas salina: <ul><li> Modificada a partir da solução de Van Harreveld (1936). (Em mM) 205 NaCl; 5,3 KCl, 13,5 CaCl 2 2H 2 O, 2,45 MgCl 2 6H 2 O, 5 e HEPES pH ajustado para 7,4 </li></ul></li><li> Ferramentas de dissecção: Fine # 5 pinças, tesoura fina, lâmina de faca, # 26002-20 pinos de insetos (todos obtidos a partir de Ferramentas Ciência Fine (EUA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) </li><li> Sylgard prato dissecção revestido, um prato de gravação seja construída com eletrodos de sucção ou usar um eletrodo de sucção e manipulador antera para segurar um eletrodo de sucção. </li><li> Dissecando microscópio com função de zoom para gravações intracelular. Focal para a gravação em terminais visualizado um microscópio composto com os objetivos de pé (4 x e 20x) é usado. Um precisa de uma fonte de luz Hg. </li><li> Amplificador intracelular padrão e A / D placa para gravação em linha para um computador. Sinais elétricos são registrados na linha de uma interface PowerLab/4s (ADInstruments, Austrália). Nós usamos software padrão de ADInstruments chamado gráfico ou Âmbito. </li><li> Produtos químicos: <ul><li> Usamos um corante vital fluorescente, 4 [4 (dietilamino) styryl] N iodeto methylpyridinium (4 Di 2 Asp; Molecular Probes, Eugene, OR), para visualizar a varicosidades (Marigassi et al, 1987;. Cooper et al, 1995a. ). Todos os produtos químicos salinos foram obtidos da Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). </li></ul></li><li> Para gravações intracelular usamos um tubo de vidro capilar (30-31-0 catalogo de FHC, Brunswick, ME, 04011, EUA) e para os eletrodos macropatch focal usamos Kimax-51, Kimble Art Products. N º 34.502, ID 0,8 1,1 milímetros, comprimento 100mm. O eletrodo intracelular deve ter uma resistência de 20 a 30 mOhm. O eletrodo é construído por macropatch quebrando a ponta do vidro após uma ponta fina foi feita a partir de um extrator de eletrodo. A ponta fora quebrado precisa ser uma ruptura perpendicular limpo sobre 20Hm de diâmetro. A dica é, então, o calor polido para cerca de 10μM de diâmetro interior. O eixo do eletrodo é então executado ao longo de um elemento de aquecimento para fazer com que ele dobre cerca de 45 graus com uma curvatura gradual. Isso produz um lúmen eletrodo plana ou perpendicular sobre o terminal nervoso como o ângulo com o micro-manipulador irá produzir cerca de mais 45 graus para a preparação. </li></ol>

gravações fisiológicos de nmjs output high and low no músculo extensor crayfish leg

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

Nós explicamos em detalhes como expor e realizar gravações eletrofisiológicas de respostas sináptica de alta (fásica) e baixo (tônica) neurônios motores saída inervação do músculo extensor da perna andando de um lagostim. Diferenças distintas estão presentes na fisiologia e morfologia dos terminais nervosos fásicas e tônicas. O axônio tônica contém muitos mais mitocôndrias, permitindo-lhe tirar uma mancha vital mais intensa do que o axônio fásica. Os terminais têm varizes tônica e fásica do terminal é filiforme. Os terminais tônica são baixos em eficácia sináptica, mas mostram dramáticas respostas facilitada. Em contraste, os terminais fásica são ricos em eficácia quântica, mas apresentar depressão sináptica com a estimulação de alta freqüência. A saída quântica é medido com um eletrodo macropatch focal colocados diretamente sobre os terminais nervosos visualizado. Ambos os terminais fásicas e tônicas inervam as fibras musculares mesmo, o que sugere que as diferenças inerentes aos neurônios, em vez de um feedback diferencial retrógrada do músculo, conta para a diferenciação morfológica e fisiológica.

Este artigo demonstra como realizar gravações eletrofisiológicas de respostas sináptica no músculo extensor da perna andando de um lagostim e como os terminais nervosos são visualizados para mostrar as diferenças morfológicas bruta de alta e de baixa produção terminais nervosos.

Gravações fisiológicos de NMJs Output High and Low no músculo extensor Crayfish Leg

Explicamos detalhadamente como expor e realizar registros eletrofisiológicos de respostas sinápticas para neurônios motores de alta (fásica) e baixa (tônica) saída...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como expor e distinguir os terminais motores fásicos e tônicos por meio de coloração morfológica e gravação eletrofisiológica no músculo extensor da lagosta. Isso é realizado primeiramente pinçando a primeira ou segunda perna locomotora de uma lagosta de tamanho médio, removendo o esqueleto externo e retirando o músculo flexor no segmento meita. Isso expõe o músculo extensor e o feixe nervoso.O segundo passo do procedimento é corar a preparação com iodo de tetraetilamino estéril e metilperitonéio, ou quatro D dois asp, para visualizar os axônios e terminações nervosas. O terceiro passo do procedimento é estimular seletivamente neurônios tônicos e/ou fásicos, e simultaneamente realizar gravações intracelulares de PEPS evocados na fibra muscular. O passo final do procedimento é usar um eletrodo focal para registrar eventos quânticos espontâneos e evocados a partir das terminações.No final, podem ser obtidos resultados que separam os terminais tônicos e fásicos, morfológica e fisiologicamente, por meio de microscopia de imunofluorescência e eletrofisiologia. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da fisiologia sináptica, como fadiga muscular, depressão sináptica e crosstalk sináptico. O experimento começa com a coleta cuidadosa do camarão, evitando suas garras.Destaque a perna do corpo no segmento do podísio. Um aperto firme no segmento do podísio induz o lagostim a automatizar, ou seja, a desprender naturalmente a primeira perna ambulatória. O lagostim interromperá a hemorragia e deverá ser devolvido ao seu tanque de contenção.O lagostim não é sacrificado. Coloque a pata sobre um pedaço de papel de tecido para que o preparo possa ser girado facilmente durante os cortes. Gire a pata até que o lado externo, que é o lado lateral, fique voltado para cima no prato de dissecação.Isso geralmente tem o lado arqueado voltado para cima. Usando uma lâmina de barbear afiada presa a um quebra-lâminas de bisturi, risque a cutícula dentro do segmento meite seguindo o padrão mostrado na figura. Tenha cuidado para não cortar muito distalmente na incisão de dorsal para ventral ao longo da articulação carpopodal do meite.Esse corte resulta em uma janela na camada de meite acima dos músculos da perna subjacentes. Deixe a cutícula no lugar por enquanto. Coloque a preparação em um recipiente de dissecação contendo solução salina fisiológica para lagostim.Neste momento, insira um alfinete no centro do segmento carpod e na face dorsal do segmento ischia pod com pin&ccedil;as finas, levante levemente a janela cortada na cut&iacute;cula a partir da extremidade distal e, usando a l&acirc;mina, corte as fibras do m&uacute;sculo flexor afastando-as da cut&iacute;cula. Continue cortando de maneira distal para proximal e, por fim, remova a janela da cut&iacute;cula. Para expor o m&uacute;sculo extensor, o m&uacute;sculo flexor subjacente deve ser removido.Se pare o tendão do músculo flexor deslocando-o do músculo flexor com um pino. Em seguida, corte o tendão na articulação metacarpo-carpal. Como mostrado, tenha muito cuidado para puxar o tendão para longe da cavidade da perna antes de fazer o corte e para cortar apenas o tendão, e não o nervo principal da perna que está no lado interno do tendão.Pince o tendão no local onde foi cortado com pin&ccedil;as e retire o m&uacute;sculo flexor da perna levantando-o em dire&ccedil;&atilde;o distal. Para expor o nervo do m&uacute;sculo extensor, corte o nervo principal da perna na articula&ccedil;&atilde;o meropodocarpal e puxe cuidadosamente o nervo principal da perna de volta sobre o m&uacute;sculo extensor. A separa&ccedil;&atilde;o do nervo do m&uacute;sculo extensor do nervo principal da perna pode ser facilitada puxando suavemente o coto distal do nervo principal da perna para o lado da prepara&ccedil;&atilde;o. Ao descolar o nervo principal da perna sobre o m&uacute;sculo extensor, pode ser necess&aacute;rio cortar pequenos ramos do ax&ocirc;nio inibit&oacute;rio.O feixe nervoso pode ser visualizado com coloração por azul de metileno. No entanto, o azul de metileno não seria utilizado para gravações eletrofisiológicas nesta imagem superior. Setas vermelhas indicam o trajeto nervoso de interesse.O feixe nervoso de interesse é o feixe maior que se ramifica do nervo principal da perna próximo à extremidade proximal de onde está o meropodito. Observe os ramos axonais e os dois axônios facilmente visíveis dentro do nervo. Agora que o nervo e o músculo estão expostos, prepare o aparato utilizado para o experimento.Os registros intra e extracelulares são realizados com um estágio padrão de cabeça e amplificador. Utilizamos um amplificador modelo Axon Clamp dois B e um estágio de cabeça um XLU. São necessários três eletrodos, sendo um intracelular e dois extracelulares.Os dois eletrodos extracelulares serão usados para estimular o nervo e registrar eventos sinápticos evocados e espontâneos. Polir as pontas dos eletrodos focais com chama e curvá-los ligeiramente sobre um elemento aquecedor. Após encher um eletrodo focal com solução salina, colocá-lo no suporte do eletrodo estimulador e inserir o fio do estimulador de modo que entre em contato com a solução salina.Isso é conectado a uma unidade de isolamento de estimulação P 15 de grama, que por sua vez está conectada a um estimulador S 88 da grama. Durante as gravações eletrofisiológicas, o corante vital para D dois ASP é usado para visualizar os axônios e corar os axônios; troque o salino do banho por salino contendo cinco micromolares de quatro D dois como corante por cinco minutos. Após cinco minutos, reabasteça o recipiente com salino fisiológico de lagostim, coloque o preparado sob um microscópio e utilize uma objetiva Forex.E com ocular de 10 x, mova o eletrodo estimulante para a área de interesse. O próximo passo é posicionar a luz do eletrodo estimulante tipo macro patch sobre o axônio fásico ou o tônico. Esta fotografia de uma preparação corada com dois corantes entre quatro mostra que o axônio tônico é mais visível devido ao maior conteúdo mitocondrial.Os terminais tônicos apresentam numerosas varicosidades e os terminais fásicos são de natureza mais fina sob microscopia de fluorescência. E o objetivo de 20 x posiciona o eletrodo sobre o axônio tônico ou fásico. Aqui, o eletrodo está sendo posicionado sobre o axônio tônico.Coloque o eletrodo intracelular em seu micromanipulador e insira o eletrodo intracelular em uma célula muscular extensora. Isso será usado para registrar potenciais pós-sinápticos excitatórios intracelulares ou EPSPs. Para gravação de EPSPs qualitativos.Coloque o segundo eletrodo focal em um micromanipulador. Isso é feito removendo o eletrodo intracelular anterior e seu suporte e substituindo-os pelo suporte de eletrodo limpo. Use o micromanipulador para posicionar a luz do segundo eletrodo focal diretamente sobre uma varicosidade sináptica.A resistência do eletrodo e do selo é determinada pela passagem de pulsos de corrente de teste através do eletrodo. Em nossos experimentos, as resistências de selo variaram de 0,3 a um mega ohm e a resistência do eletrodo variou de 0,5 a um. A resistência de selo em mega ohm pode ser monitorada durante toda a gravação.Quando estiver pronto para iniciar a estimulação, ligue o software scope 5.0 e comece a estimular o axônio isolado. No feixe nervoso, o axônio tônico é estimulado pelo eletrodo de sucção e os PEPSs da fibra muscular são registrados com um eletrodo intracelular ou extracelular. Os PEPSs são registrados em um computador por meio de uma interface power lab forest.Após a estimulação do axônio tônico, o eletrodo estimulador pode ser movido para o axônio fásico e o experimento pode ser repetido após a estimulação do nervo. O eletrodo intracelular registra os PEPS gerados em resposta à atividade dos neurônios motores tónicos e fásicos. A facilitação sináptica das junções neuromusculares tônicas depende da frequência da estimulação nervosa, conforme mostrado aqui para trens sucessivos de aproximadamente 20 estímulos cada, com frequência de 60 hertz.Observe a facilitação que ocorre com múltiplos estímulos. Esta figura compara as amplitudes dos PEPS gerados pela estimulação do nervo tônico em frequências de 20 hertz em azul, 40 hertz em verde e 60 hertz em vermelho; observe a acentuada facilitação demonstrada em frequências mais altas de estimulação. Os terminais tônicos possuem baixa eficácia sináptica, mas exibem respostas facilitadas acentuadas, como mostrado.Aqui estão os PEPS tônicos isolados, e em seguida as respostas fásicas são sobrepostas na mesma escala. Em contraste com os terminais tônicos, os terminais fásicos apresentam alta eficácia qualitativa, mas exibem depressão sináptica com estimulação de alta frequência. A depressão sináptica nos terminais fásicos também está relacionada à frequência de estimulação, conforme mostrado aqui.Uma estimulação contínua de cinco hertz durante 30 minutos deprime a resposta na junção neuromuscular. Com frequência de estimulação mais alta, o preparado apresentará depressão mais rapidamente com a estimulação apropriada. A junção neuromuscular do lagostim gera EPSPs sem potenciais de ação.Esses PEPS podem ser usados para investigar as propriedades graduais que compõem os sinais elétricos graduais nesses músculos. Aqui, são mostradas as respostas sinápticas graduais do terminal tônico. Observe que nem todos os ensaios de estimulação resultam em um evento gradual.A contagem direta de eventos quantais é possível com estimulação de baixa frequência para cada resposta evocada. O número de eventos quantais pode ser facilmente determinado para os terminais tônicos. Ao contar os eventos quantais, as respostas sinápticas do neurônio motor fásico podem ser registradas da mesma maneira.No entanto, as respostas evocadas são multiquantitativas por natureza. O conteúdo médio quantitativo é estimado utilizando-se a amplitude média ou a área dos desvios, juntamente com a amplitude média do pico ou a área dos eventos espontâneos. Um lembrete final: tenha cuidado ao remover o músculo flexor para não danificar o nervo que inerva o músculo extensor.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

physiological-recordings-high-low-output-nmjs-on-crayfish-leg

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui nós descrevemos métodos eletrofisiológicos para medir a transmissão sináptica na junção neuromuscular de larva Drosophila. Liberação evocada é iniciado artificialmente estimulando os axônios do neurônio motor ea transmissão através do MNJ pode ser medida pela resposta pós-sináptica evocado no músculo.

Métodos eletrofisiológicos de gravação Potenciais Synaptic do MNJ de larvas de Drosophila

Aplicação de eletrofisiologia às sinapses acessível fornece uma medida quantificável de atividade sináptica, útil na análise de mutantes sináptica. Este artigo descreve um método de dissecação usada para expor as junções neuromusculares (MNJ)...

Dissecação e gravação a partir da junção neuromuscular C. Elegans

Medidas não invasivas de padrões de atividade neural em animais livremente comportando são obtidos através da combinação de gravações neurofisiológicos com videografia de alta velocidade.

Gravações da ativação do circuito neural no Livremente Behaving Animais

O músculo da perna opener crustáceo é apresentado por sua importância histórica e versatilidade experimental no fenótipo muscular, fisiologia e plasticidade sináptica.

Ver histórico e demonstração Fisiologia da MNJ da Muscle Opener Crayfish

Os experimentos demonstram um método fácil para que os estudantes ganham experiência em examinar a estrutura muscular, respostas sináptica, os efeitos de gradientes de íons e permeabilidade em potenciais de membrana. Além disso, um sensório-motoras CNS-músculo-circuito é apresentado para mostrar um meio para testar os efeitos de compostos em um circuito neuronal.

Potenciais de membrana, Responses Synaptic, circuitos neuronais, neuromodulação e Histologia Muscle Usando a lagosta: Exercícios Laboratório Student

O objetivo principal desta experiência é entender como os neurônios sensoriais primários transmitir informações de movimentos comuns e de posições como as informações proprioceptivas para um animal. Um objetivo adicional deste relatório é apresentar a anatomia da preparação por dissecção e visualização de neurônios em um microscópio de dissecação.

Muscular órgãos receptores no abdômen Crayfish: Um Exercício em Laboratório Student Propriocepção

Nós descrevemos um método para medir diretamente a força muscular, a força muscular, a cinética contráteis e fatigabilidade de músculos esqueléticos isolados em...

Avaliação ex vivo de Fatigabilidade Contratilidade e Alternans em músculos esqueléticos isolados

Técnicas fisiológicas e anatômicas são demonstrados para lidar com a função e estrutura para proprioceptores articulares e receptores de tensão muscular em membros de passeio de crustáceos.

Propriocepção e tensão Receptores em Caranguejo Limbs: Exercícios Laboratório Student

Muscle neurônios sensoriais estão envolvidos na sinalização proprioceptor e também informar sobre eventos estaduais e lesão relacionada com o metabolismo. Nós descrevemos um rato adulto em preparação músculo-nervo vitro para estudos sobre músculos aferentes ativado por estiramento.

Um In Vitro Adulto mouse para estudar as propriedades de queima de músculos aferentes

Uma avaliação funcional da junção neuromuscular (JNM) pode fornecer informações essenciais sobre a comunicação entre o músculo e do nervo. Aqui descrevemos um protocolo para avaliar exaustivamente o músculo e o MNJ funcionalidade usando duas preparações diferentes de nervo-músculo, ou seja, sóleo-isquiático e frênico-diafragma.

Medir a funcionalidade da junção Neuromuscular

Apresenta-se um protocolo para produzir diferentes tipos de lesões nervosas medianas (MN) e reparar no rato. Além disso, o protocolo mostra como avaliar a recuperação funcional do nervo utilizando vários testes comportamentais não invasivos e medidas fisiológicas.

Métodos funcionais e fisiológicos de avaliação da regeneração do nervo mediano no rato

Aprenda a realizar gravações eletrofisiológicas de terminais motores tônicos e fásicos no músculo extensor da perna de lagostim. Este método combina coloração morfológica e técnicas de registro intracelular para estudar respostas sinápticas.

Gravações fisiológicos de NMJs Output High and Low no músculo extensor Crayfish Leg

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