Name: Experimentação fisiológicas com o intestino posterior Crayfish: Um Exercício Laboratório de Student (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprenda técnicas de dissecação e registro de contrações no intestino posterior de lagostins para estudos de neurofisiologia e farmacologia. Este método ensina estudantes a analisar dados fisiológicos e construir curvas dose-resposta.

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Apoiada pela Universidade de Kentucky, Departamento de Biologia, Instituto de Estudos de Graduação e Faculdade de Artes e Ciências.

1. Introdução A visão mais recente abrangente do intestino posterior crustáceo foi cumprido em uma dissertação pelo Dr. Barbara E. Musolf (2007, Georgia State University, Atlanta, Georgia, EUA), que concentrou-se principalmente na modulação serotoninérgica e inervação (Musolf et al., 2009 ). Hindguts crustáceo foram primeiramente estudados mais de 100 anos atrás por Alexandrowicz, um pioneiro na anatomia comparativa (Alexandrowicz, 1909), que descreveu os vários aspectos da sua inervação. Pesquisa continuada ao longo dos anos, identificando os tipos de camadas musculares e arquitetura, abordando a função global do intestino grosso na osmorregulação para o animal inteiro, e examinando o controle moduladores da contratilidade hindgut por vários compostos (ver revisão por Musolf, 2007). É interessante notar que a parte anal do intestino posterior age não só para expulsar as fezes, mas também para levar até a água do ambiente para osmorregulação. Esta região do intestino pode sofrer frente ou para trás o peristaltismo, dependendo das necessidades do animal. Alexandrowicz (1909) identificou dois plexos nervosos que inervam o intestino posterior crustáceo, um plexo interno e um plexo externo, que mais tarde provou ser ricas fontes para a identificação e caracterização de neurotransmissores. Na década de 1950 Dr. Ernst Florey começou uma série de estudos farmacológicos no intestino posterior lagostas e demonstrou que as contrações são modulados pela acetilcolina e seus compostos relacionados e também pela adrenalina e noradrenalina (Florey, 1954). Florey, o descobridor de uma substância inibidora conhecido como "fator-I", estudou os efeitos desta substância em várias preparações, incluindo o sistema GI em lagostas (Florey, 1961). Fator-I foi posteriormente demonstrado ser GABA. Assim, o intestino posterior lagostas desempenhou um papel importante nos estudos iniciais da inibição sináptica. Após a descoberta do GABA, outros transmissores putativa também foram mostrados para ser associados com os plexos e intestino posterior para provocar respostas fisiológicas. Tais transmissores incluem dopamina (Elekes et al 1988;. Elofsson et al 1968.) Proctolin (RYLPG-OH;. Mercier et al 1997) dois peptídeos orcokinin (NFDEIDRSGFGFN e AFDEIDRSGFGFN; Bungart et al 1994;.. Dircksen et al 2000) , orcomyotropin (FDAFTTGFamide; Dircksen et al 2000). myosuppressin e um peptídeo (Mercier et al 1997;... pQDLDHVFLRFamide mais provável, cf Stemmler et al 2007). Cada uma destas substâncias modula hindgut contrações espontâneas, e todos, exceto GABA parece ser excitatório. O intestino grosso também responde a glutamato e quisqualato (Jones, 1962;. Errado et al 2003), mas as evidências claras para a inervação glutamatérgica não foi relatado. Mensageiros intracelulares que medeiam os efeitos dos diversos transmissores são em grande parte inexplorado, mas há evidências para o envolvimento de AMPc na capacidade da dopamina para aumentar as contrações (Knotz &amp; Mercier, 1995). Embora o intestino grosso crustáceos contratos espontaneamente após desnervação, tais contrações são tipicamente fraco e desorganizado (País de Gales, 1982; Winlow &amp; Laverack, 1972a). Movimento peristáltico exige saída do motor coordenado do sistema nervoso central, aparentemente originários do gânglio última abdominal (Winlow &amp; Laverack, 1972a, b, c). Nos lagostins, a saída do motor é transportado para o intestino grosso através da raiz 7 ª abdominal, que contém 75 axônios cujos corpos celulares estão localizados no gânglio última abdominal (Kondoh &amp; Hisada, 1986). Pelo menos alguns dos peptídeos parecem ser fornecido ao plexo hindgut dos neurônios originários da última gânglio abdominal (Dircksen et al 2000;.. Mercier et al, 1991b; Siwicki &amp; Bishop, 1986), mas a dopamina é fornecido pelos neurônios em mais gânglios anterior (Mercier et al. 1991a). Desde a saída do motor através da raiz 7 ª abdominal é necessária para as grandes, as contrações coordenadas, é provável que alguns ou todos os transmissores listados acima suposto contribuir de alguma forma para o peristaltismo. Suas contribuições relativas, no entanto, não são conhecidos. Alguns insights podem ser obtidos através do estudo dos seus efeitos sobre os músculos circulares e longitudinais em separado (Mercier &amp; Lee, 2002). Além de controlar o movimento de alimento não digerido, o plexo nervoso associado com o crustáceo intestino posterior parece desempenhar um importante função endócrina associada muda. O intestino posterior do caranguejo, Carcinus maenas, contém células endócrinas que liberam hormônio hiperglicêmico crustáceo e sua peptídeo precursor relacionadas durante ecdise (Webster et al. 2000), sugerindo um papel importante na absorção de água e inchaço associado a muda. Assim, o intestino grosso crustáceos, participa em diversos processos fisiológicos importantes. Este relatório é basicamente uma ferramenta de ensino para o ensino médio avançado e alunos de graduação em cursos de fisiologia que participam na experimentação. O significado, bem como o potencial mecanismo por trás de como os contratos hindgut e funções podem ser abordados pelos alunos. Agentes farmacológicos, os neurotransmissores e neuro-hormônios serão usados, e curvas dose-resposta será construída, que irá envolver os alunos em como adquirir e interpretar os dados fisiológicos e farmacológicos. Um entendimento geral da função do receptor em relação aos agonistas e antagonistas também pode ser alcançado. Os alunos também aprenderão a apresentar os dados em forma gráfica para análise estatística. É muito fácil para dissecar e registrar as contrações do intestino posterior lagostim. Na preparação dissecado, o intestino é facilmente expostos a substâncias exógenas. A alteração na atividade peristáltica pode ser monitorada visualmente ou com um transdutor de força, o que também pode monitorar a força das contrações. Devido à sua simplicidade e confiabilidade como uma preparação bioensaio, o intestino posterior crustáceo ainda é muito útil para investigar questões muitas pesquisas sobre os mecanismos de peristaltismo, modulação de saída do motor e da contração muscular e função do receptor. O intestino grosso também é útil para testes de inseticidas, crustaceancides e poluentes para os mecanismos específicos de ações. 2. Métodos 2.1) Materiais <ul><li> lagostim </li><li> lagostas salina </li><li> instrumentos de dissecção (tesoura grossa e fina, grossa e uma pinça fina) </li><li> Sylgard de fundo placa de Petri </li><li> pinos de aço de dissecação </li><li> copos (para segurar soluções químicas) </li><li> parafilme (para cobrir a mistura e soluções) </li></ul> 2,2 Dissection) <ol><li> Lagostim (Procambarus clarkii), medindo 60-10 cm de comprimento do corpo deve ser colocado em gelo por 5 a 10 minutos para anestesiar o animal antes da dissecação começa. </li><li> Segure o lagostim anestesiados por trás as garras com uma mão. Rapidamente, corte da tomada de olho no meio da cabeça de ambos os lados, e depois decapitar o lagostim (Nota: o sangue da preparação será pegajoso quando seca, então lave as ferramentas quando concluída). <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Decapitação de crustáceo </li><li> Cortar a chelipeds e pernas andar. </li><li> Cortar a tailfins esquerda e direita, deixando apenas o meio tailfin (uropod). </li><li> No lado dorsal do crustáceo corte ventralmente, tanto do lado esquerdo e direito da cutícula dorsal. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: Remoção de Cutícula Dorsal </li><li> Cortadas transversalmente no lado dorsal da cutícula, certificando-se que o corte é superficial para evitar danos ao GI Em seguida, retire a parte inferior da cutícula dorsal abdominal. </li><li> Coloque o crustáceo dissecado em um prato Sylgard-alinhado. </li><li> Pin do crustáceo para o prato na ponta do tailfin. Pode-se usar mais pinos de cada lado do GI, conforme necessário para manter o corpo para baixo. </li><li> Encha o prato com solução salina lagostas cobrindo o GI Certifique-se continuamente para apagar o GI com solução salina usando uma pipeta. Salina é uma solução modificada de Van Harreveld (1936), que é feita com 205 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 13,5 mM CaCl 2 2H 2 O, 2,45 mM MgCl 2 6H 2 O, 5 mM HEPES e ajustada para pH 7.4. O lagostim dissecados deve aparecer como mostrado na Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: lagostas dissecado com GI intacta. </li></ol> 2.3) Experimentos 2.3.1) As contrações no animal <ol><li> Ter soluções do composto a ser testado pronto e à mesma temperatura como o soro fisiológico banho. Pode usar em soluções individuais de serotonina (100 nM, 1microM), glutamato (1microM) e dopamina (1microM) feita em solução salina lagostas como substâncias começam a ser testados. </li><li> Permitir que o lagostim dissecados para sentar-se na solução de lagostas por cerca de 10 minutos para permitir que ele se adaptar ao choque de dissecção e exposição salina. As contrações peristaltismo lento do intestino grosso deve começar a ocorrer. </li><li> Uma vez que as contrações começam, registre o número de contrações que ocorrem em trinta segundos (note o tipo de contrações que ocorrem: ou seja, tipo o peristaltismo, ou espástica, ea direção de qualquer ondas peristálticas). Tabela 1: Contrações no Crayfish Saline <table border="1"><tbody><tr><td> Número de contrações </td><td> Tipo de Contrações </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Usando um piPette, retire o soro fisiológico dentro da cavidade do abdômen expostos os lagostins, e aplicar soro fisiológico contém a substância a ser analisada diretamente no intestino grosso. </li><li> Imediatamente após a adição da solução, registrar o número de contrações que ocorrem depois de trinta segundos e observe o tipo de contrações que ocorrem (ou seja, peristálticas, ou espástica). Tabela 2: Contrações com a exposição a compostos <table border="1"><tbody><tr><td> Composto testado </td><td> Concentração </td><td> Número de contrações </td><td> Tipo de Contrações </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Imediatamente após a gravação a resposta à substância de ensaio, lavar os tempos GI várias lagostas com solução salina normal. Deixe a preparação descansar por 5 minutos, enquanto a lavagem a cada 30 segundos com solução salina lagostim. </li><li> Com uma pipeta, colocar algumas salina contendo o composto próximo a ser examinado ou uma concentração variada de a substância última testado diretamente no intestino grosso. É melhor começar com uma concentração mais baixa e uma forma de trabalho para concentrações mais elevadas. </li><li> Imediatamente após a adição de cada nova substância ou a cada nova concentração, registre o número de contrações que ocorrem depois de trinta segundos e observe o tipo de contrações. </li></ol> 2.3.2) as forças de contração de gravação em preparações excisadas <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: Setup <ol><li> Anexar o transdutor para o pod ponte. </li><li> Anexar o pod ponte para o PowerLab 26T. </li><li> Anexar o 26T PowerLab à porta USB no computador. </li><li> Abra LabChart7, clicando no ícone labchart7 na área de trabalho. <ul><li> A caixa de LabChart Welcome Center vai abrir. Fechá-la. </li><li> Clique em Setup </li><li> Clique em configurações de canal. Alterar o número de canais a 1 (parte inferior esquerda da caixa) empurrar OK. </li><li> Na parte superior esquerda do gráfico do conjunto de ciclos por segundo para cerca de 2k. Definir o volts (eixo y) para cerca de 500 ou 200 mV. </li><li> Clique no Canal 1 da direita do gráfico. Clique em Amplificador de Entrada. Garantir que as configurações: single-ended, ac acoplado, e invertido (inverte o sinal se necessário), e anti-alias, são verificados. </li><li> Para começar a começar a gravação, prima. </li></ul></li><li> Pick up a preparação e corte o trato gastrointestinal na junção entre o tórax eo abdômen. Em seguida, corte cuidadosamente em torno da parte telson da cauda. Remova o trato GI do crustáceo dissecados e colocá-lo no prato Sylgard. Há um vaso sanguíneo que corre ao longo do aspecto dorsal do trato gastrointestinal. Puxe cuidadosamente esta longe do trato gastrointestinal. Despeje salina lagostas frescas sobre o preparo. </li><li> Coloque o transdutor de força na pinça perto do crustáceo dissecados. </li><li> Ligar o transdutor de força no GI lagostas, como mostrado na Figura 5. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5: hindgut isolada da lagosta em soro fisiológico ligado ao gancho do transdutor de força </li><li> Aguarde até que o GI começa a se contrair, e empurre começar na LabChart7. </li><li> Deixe o programa rodar por cerca de 20 segundos. Push "parar", e adicionar um comentário rotulados ", Saline só". Preencha a Tabela 4. Tabela 4: Contrações com o composto de interesse <table border="1"><tbody><tr><td> Número de contrações </td><td> Amplitude das contrações (mV) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Adicione o teste de compostos de interesse, e imediatamente pressione "start" na LabChart7. </li><li> Deixe o programa rodar por cerca de 20 segundos. Push "stop" e adicionar um comentário diretamente sobre o arquivo gráfico de que substância foi adicionada e sua concentração. Preencha a tabela abaixo. Tabela 5: Contrações com composto _________ <table border="1"><tbody><tr><td> Número de contrações </td><td> Amplitude das contrações (mV) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Enxaguar a preparação com solução salina lagostas utilizando uma pipeta. </li><li> Adicionar outras substâncias ou várias concentrações de maneira similar. Imediatamente push "start" na LabChart7. </li><li> Deixe o programa rodar por cerca de 20 segundos. Push "parar", e adicionar um comentário e etiqueta diretamente sobre o arquivo gráfico que indica o compound utilizado e da concentração. </li></ol> 3. Análise de Dados <ol><li> 2.3.1 a partir do experimento, o gráfico do número de contrações de cada solução (serotonina, soro fisiológico, o glutamato) em função do tempo. Explicar todas as tendências. </li><li> 2.3.2 a partir do experimento, o gráfico do número de contrações de cada solução (solução salina, a serotonina, glutamato) versus a amplitude das contrações em mV. Explicar todas as tendências. </li></ol> 3.1) A medição da velocidade e força das contrações Para indexar as taxas de contrações sobre pode medir o tempo desde o início de um desvio para o início do próximo ou contar as deflexões total, durante um minuto ou dois. Os valores podem então ser colocada em termos de contrações por minuto ou por segundo, dependendo de como rápido eles estão ocorrendo. Para indexar a força das contrações uma medida relativa poderia ser usado para comparar diferentes condições. Sobre o arquivo salvo pode-se usar o marcador "M" e ir para a linha de base. Em seguida, use o cursor e mover-se para o pico da deflexão e anote o valor listado na parte superior direita da tela como um valor de delta (a diferença de M para o pico). Observe o cursor precisa ser mantida estacionária para a medida da mudança. Seguida, mova o M para a forma próxima onda de interesse e repetir a medida.

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<li>Webster, S. G., Dircksen, H., Chung, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+cells+in+the+gut+of+the+shore+crab+Carcinus+maenas+immunoreactive+to+crustacean+hyperglycaemic+hormone+and+its+precursor-related+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocrine cells in the gut of the shore crab Carcinus maenas immunoreactive to crustacean hyperglycaemic hormone and its precursor-related peptide.</a> J. Exp. Biol. 300, 193-205 (2000).</li>
<li>Winlow, W., Laverack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+hindgut+motility+in+the+lobster+Homarus+gammarus+%28L.%29.+1.+Analysis+of+hindgut+movements+and+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 1. Analysis of hindgut movements and receptor activity.</a> Mar. Behav. Physiol. 1, 1-28 (1972).</li>
<li>Winlow, W., Laverack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+hindgut+motility+in+the+lobster+Homarus+gammarus+%28L.%29.+2.+Motor+output%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 2. Motor output.</a> Mar. Behav. Physiol. 1, 29-47 (1972).</li>
<li>Winlow, W., Laverack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+hindgut+motility+in+the+lobster+Homarus+gammarus+%28L.%29.+3.+Structure+of+the+sixth+abdominal+ganglion+%286+A.G.%29+and+associated+ablation+and+microelectrode+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 3. Structure of the sixth abdominal ganglion (6 A.G.) and associated ablation and microelectrode studies.</a> Mar. Behav. Physiol. 1, 93-121 (1972).</li>
<li>Wrong, A. D., Sammahin, M., Richardson, R., Mercier, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+properties+of+glutamate+receptors+associated+with+the+crayfish+hindgut%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological properties of glutamate receptors associated with the crayfish hindgut.</a> J. Comp. Physiol. 189, 371-378 (2003).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os detalhes fornecidos no filme e texto associados descrevem os principais passos necessários para registrar a atividade no intestino posterior do crustáceo in situ, assim como in vitro. Um dos objetivos do nosso relatório é aumentar a sensibilização para o potencial desta preparação no aluno executar laboratórios de investigação que ensinam conceitos fundamentais em fisiologia e farmacologia. Estas preparações podem ser utilizados para investigar uma série de perguntas experimental que levará a uma melhor compreensão das funções fisiológicas do intestino posterior. Os mecanismos subjacentes regulação das ondas peristálticas e sua reversão ainda não são conhecidos. Os mecanismos para maior controle do trato GI todo também não são totalmente compreendidos. A questão de como integrar os centros superiores a sua actividade com a saída autônomo que controla diretamente o sistema GI continua a ser um espaço aberto de investigação (Shuranova et al., 2006). Além disso, as capacidades osmorregulatório do intestino grosso crustáceos e as funções de osmorregulação durante o estresse de muda e ambientais não foram completamente elucidados. Há ainda muitas perguntas à espera de respostas nesta preparação.

<ol><li> Lagostim (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., EUA. </li><li> Padrão lagostas salina: Modificado de solução de Van Harreveld (1936). (Em mM) 205 NaCl; 5,3 KCl, 13,5 CaCl 2 2H 2 O, 2,45 MgCl 2 6H 2 O, 5 e HEPES pH ajustado para 7,4. Glutamato, serotonina e dopamina são feitas em solução salina lagostim. Todos os produtos químicos são obtidos da Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). </li><li> Ferramentas de dissecção: Fine # 5 pinças, tesoura fina, lâmina de faca, # 26002-20 pinos de insetos (todos obtidos a partir de Ferramentas Ciência Fine (EUA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) </li><li> Sylgard de fundo placa de Petri </li><li> Copos (para segurar soluções químicas) </li><li> Sinais elétricos são registrados na linha de uma interface PowerLab 26T para um computador (ADInstruments, Colorado Springs, CO, EUA). Nós usamos software padrão de ADInstruments chamado gráfico ou Âmbito. <li> Pod ponte para o transdutor de força (vagens Ponte diferentes são necessários para diferentes tipos de transdutores de força). </li><li> MLT0402 transdutor de força (2 gramas) é o grau de pesquisa, como mostrado no vídeo. MLT 0210 / D (10 mg a 25 gramas) ea MLT 500 / A (0-500g) são os transdutores de ensino graus (ADInstruments). </li></ol>

experimentação fisiológicas com o intestino posterior crayfish: um exercício laboratório de student

Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

O objectivo do relatório é descrever as técnicas de dissecação para a preparação do intestino posterior lagostas e demonstrar como fazer gravações fisiológico com um transdutor de força para controlar a força de contração. Além disso, demonstrar como visualmente monitorar a atividade peristáltica, que pode ser usado como um bioensaio para vários peptídeos, aminas biogênicas e neurotransmissores. Esta preparação é passível de laboratórios de estudante em fisiologia e para demonstrar conceitos farmacológicos para os estudantes. Esta preparação tem sido usado por mais de 100 anos, e ainda oferece muito como modelo para investigar a geração e regulação dos ritmos peristáltica e para descrever os mecanismos subjacentes à sua modulação. Os ensaios farmacológicos e receptor sub digitação que foram iniciados há 50 anos no intestino grosso ainda contribuir para a investigação hoje em dia. Esta preparação robusta é bem adequado para os alunos de formação em fisiologia e farmacologia.

Neste relatório, demonstram técnicas que podem ser usados ​​para investigar a biologia do intestino posterior lagostim. Nós mostramos como dissecar um abdômen lagostas e estudar a anatomia associados, fisiologia e modulação da atividade. A atividade peristáltica e força das contrações são medidos através de um transdutor de força.

Experimentação fisiológicas com o intestino posterior Crayfish: Um Exercício Laboratório de Student

O objetivo do relatório é descrever as técnicas de dissecção para a preparação do intestino posterior do lagostim e demonstrar como realizar registros fisiológicos ...

O objetivo geral deste relatório é servir como uma ferramenta didática para estudantes do ensino médio avançado e de graduação em cursos de fisiologia que participam de experimentação fisiológica. Os alunos aprendem a expor e registrar contrações no intestino posterior de lagostim. Um passo adicional é a excisão do intestino posterior do animal, o que permite a aplicação direta de compostos.Em seguida, a força e o ritmo das contrações do músculo liso do intestino posterior são monitorados enquanto se aplicam diversos agentes farmacológicos para examinar os mecanismos que alteram a intensidade da contração. São obtidos resultados que demonstram a ação de moduladores sobre a inervação neural ou diretamente sobre o músculo, com base em ensaios farmacológicos e subtipagem de receptores. Olá, sou o Dr. J. Mercier do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Brock.Estou utilizando o intestino posterior de lagostim como preparação para realizar pesquisas sobre neurotransmissores que controlam músculos viscerais. Também tenho usado esta preparação como ferramenta didática e, como parte de uma colaboração com o laboratório da Dra. Robin Cooper na Universidade do Kentucky, estamos aperfeiçoando diversos experimentos conduzidos por alunos para fins educacionais. Este método pode proporcionar insights sobre a função do intestino posterior de lagostim.Também pode ser aplicado em estudos de doenças, como aquelas envolvendo ritmos peristálticos. Pode ser usado ainda para descrever os mecanismos subjacentes à modulação da inervação muscular e neural. Os alunos aprenderão a interpretar dados fisiológicos e farmacológicos por meio da utilização de agentes farmacológicos, neurotransmissores e neuro-hormônios, e adquirirão uma compreensão geral da função dos receptores.No que diz respeito a agonistas e antagonistas, os alunos construirão curvas de dose-resposta e apresentarão os dados na forma gráfica para análise estatística. Para anestesiar o animal, coloque um camarão de seis a 10 centímetros de comprimento corporal sobre gelo por cinco a 10 minutos. Segure o camarão anestesiado por trás das garras com uma das mãos. Corte rapidamente da órbita ocular até o meio da cabeça em ambos os lados e, em seguida, decapite o camarão.O sangue da preparação será pegajoso quando for manipulado, portanto lave as ferramentas ao finalizar. Em seguida, corte as pernas e as garras. Depois, remova as nadadeiras caudais esquerda e direita, deixando a nadadeira caudal mediana, e corte ao longo do lado dorsal do abdômen até alcançar o último segmento.Em seguida, corte ao longo do último segmento e desça pelo outro lado. Remova a carapaça dorsal. Coloque o camarão-de-água-doce dissecado na placa de Petri forrada com papel de seda.Solução salina de baixa qualidade para lagostim. Para cobrir o preparado, utilize pinos de dissecação para fixar o preparado ao recipiente de Petri. O intestino posterior geralmente é cercado por uma massa de vasos sanguíneos e tecido conjuntivo.Remova-os com pinça, tomando cuidado para não danificar o intestino. O intestino posterior está agora visível ao longo do abdome.Deixe a preparação de lagostim dissecada em repouso na solução salina por cerca de 10 minutos, para que possa se recuperar do choque da dissecção e da exposição à solução salina. Observe as contrações peristálticas lentas do intestino posterior. Para iniciar, a taxa de contrações pode agora ser calculada.Conte o número de contrações que ocorrem em 30 segundos e registre em um log. Registre também o tipo de contrações que ocorrem e se são peristálticas ou espásticas. Anote a direção de quaisquer ondas peristálticas.Conte a frequência de contrações próximas ao ânus e no ponto médio do abdômen, verificando se há diferenças na frequência entre essas duas regiões. Tenha uma variedade de soluções de teste prontas e à mesma temperatura do salino de banho. A primeira solução testada aqui será serotonina de um micromolar preparada em salino de camarão. Usando uma pipeta, remova o salino da cavidade do abdômen exposto do lagostim e aplique a solução de serotonina de um micromolar diretamente sobre o intestino posterior. Imediatamente após adicionar a nova solução, espere 30 segundos e, em seguida, conte as contrações ocorridas durante 30 segundos na região próxima ao ânus e, depois, conte as contrações dos próximos 30 segundos no ponto médio do abdômen. Registre esses números em um gráfico e também anote o tipo de contrações que ocorrem. Próximo.Despeje a solução de teste do recipiente de gravação e enxágue o intestino posterior várias vezes com solução salina normal para lagostim. Em seguida, enxágue o preparo a cada 30 segundos durante cinco minutos. Neste momento, você pode adicionar a próxima solução de teste, que, nesta demonstração, é uma micromolar de Topamina.Registre suas observações como antes e repita este processo para os demais compostos em teste. Ao usar múltiplas concentrações da mesma substância, certifique-se de começar com a concentração mais baixa e avançar para concentrações mais altas. A montagem para medir a força das contrações gastrointestinais inclui um laptop com o software LabChart 7, o Bridge Pod, o PowerLab 26T e o transdutor de força.Antes de poder medir a força das contrações musculares do trato gastrointestinal, você precisa isolar o trato gastrointestinal. Para isso, corte os músculos no último segmento abdominal, insira dois ou mais alfinetes através da cutícula ventral mole em ambos os lados do ânus e, em seguida, remova o restante do abdômen, deixando o intestino posterior e o ânus presos a um pequeno pedaço de cutícula. O intestino deve ser cortado próximo à junção entre o tórax e o abdômen.Agora, transfira o trato gastrointestinal para um recipiente raso com fundo revestido por sard. Há um vaso sanguíneo que percorre a face dorsal do trato gastrointestinal. Remova-o cuidadosamente do trato gastrointestinal.Derrame salina fresca de lagostim sobre o preparo. Posicione o transdutor de força sobre o preparo. Observe atentamente o pino que está colado na parte inferior do transdutor de força.A extremidade que se prende ao intestino possui uma pequena curvatura. Prenda a pequena curvatura do pino à extremidade cortada do intestino posterior. Após prender o intestino posterior, mova levemente o recipiente até que o intestino posterior fique esticado.Tenha cuidado com este passo, pois o intestino deve estar tenso, mas não muito apertado. Estar muito apertado pode danificar o músculo. Quando a placa estiver na posição ideal, use cera ou argila para manter a placa firme.Em seguida, inicie o software. Para começar a gravação, abra o software do laboratório de gráficos. Feche o laboratório de gráficos, centro de boas-vindas.Vá até a configuração no canto superior esquerdo. Clique em configurações do canal no canto inferior esquerdo. Altere as configurações do canal para ter apenas um canal.Clique em ok no lado direito da tela. Vá para o canal um, abra o módulo de ponte. Defina a escala na configuração mais sensível, 200 microvolts neste caso, na parte superior do gráfico no canto direito.Defina os ciclos por segundo em 2K. Agora você está pronto para gravar. Clique em iniciar para garantir que a configuração está funcionando corretamente.Toque levemente a ponta do transdutor com uma pipeta. Você deverá observar uma alteração na força registrada pelo software. Clique em parar no software, depois clique em iniciar e deixe o programa rodar.Durante cerca de 20 segundos, clique em parar e adicione um comentário rotulado como salina. Calcule apenas a frequência das contrações medindo o tempo desde o início de um desvio até o início do próximo, ou contando o número total de desvios ao longo de um ou dois minutos. Calcule a frequência em contrações por minuto ou em contrações por segundo, dependendo da rapidez com que ocorrem.Para medir a força das contrações, utilize uma medida relativa para comparar as contrações sob diferentes condições no arquivo salvo. Mova o marcador M até a linha de base, depois mova o cursor até o pico do desvio e anote o valor indicado no canto superior direito da tela. Este é um valor delta que representa a diferença entre M e o pico.Observe que o cursor precisa ser mantido estacionário no pico para medir a alteração. Em seguida, mova o marcador M e o cursor para a próxima forma de onda de interesse e repita a medida para examinar o efeito dos moduladores. Neste preparo, troque lentamente o salino por uma solução de teste.Neste caso, utilize um micromolar de serotonina e continue registrando a taxa e a força das contrações como último teste. Para este experimento, verifique se os inibidores de junções comunicantes alteram a taxa ou a força das contrações; os inibidores de junções comunicantes incluem etanol a 1 % ou solução salina que foi borbulhada com dióxido de carbono. Esses compostos são usados por último, pois podem danificar as fibras musculares após exposição prolongada. Para comparar o efeito dos diversos compostos, represente os dados em um gráfico.Um outro uso interessante dessa preparação é registrar a força gerada pelos músculos circulares. No entanto, se você aplicou inibidores de junções comunicantes à sua preparação, os inibidores podem ter danificado os músculos circulares, caso em que você deve usar uma preparação fresca do intestino posterior para testar os músculos circulares. Para expor os músculos circulares, faça um corte longitudinal no tubo do intestino com uma tesoura fina.Use pinos finos para fixar firmemente um lado ao prato. Prenda o pino com gancho do transdutor ao outro lado da tira. Exponha o preparado aos mesmos compostos testados nos músculos longitudinais; a relação entre os compostos testados e o número e tipo de contrações está mostrada aqui.Você pode representar graficamente o número de contrações versus o tempo para as soluções de salina, serotonina e glutamato. Você pode representar graficamente o número de contrações versus a força das contrações em milivolts para as soluções de salina, serotonina e glutamato. Esses gráficos podem ser feitos tanto para os músculos longitudinais quanto para os circulares, a fim de testar se os músculos longitudinais e circulares em diferentes regiões do intestino apresentam respostas distintas aos diversos moduladores.Os experimentos acima podem ser repetidos em diferentes regiões a partir do ânus e ao longo do abdômen. Ao realizar este procedimento, é importante ter cuidado para não danificar o trato gastrointestinal com a pinça e para não puxar com muita força usando o transdutor de força após este procedimento. Outros métodos, como gravações eletrofisiológicas do músculo, podem ser realizados para investigar outras questões, como funções e modulações de canais iônicos, e podem servir como modelo para outros tecidos em outros modelos animais.

physiological-experimentation-with-crayfish-hindgut-student

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Experimentação fisiológicas com o intestino posterior Crayfish: Um Exercício Laboratório de Student

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