Modelagem de Membranas Biológicas, com placas de circuito e medição de sinais elétricos em Axônios: Exercícios Laboratório Student

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como as membranas biológicas podem ser compreendidas utilizando modelos elétricos e mostrar os procedimentos para registrar potenciais de ação do cordão nervoso ventral do lagostim. Esta demonstração utiliza primeiramente componentes de um circuito em uma placa de prototipagem para representar as propriedades elétricas das membranas. O segundo passo do procedimento consiste em variar a resistência e a capacitância em um circuito modelo para observar os efeitos nas curvas de tensão.

O terceiro passo do procedimento consiste em aplicar os conceitos aprendidos a partir de um circuito modelo a um preparo nervoso vivo. O passo final do procedimento é registrar potenciais de ação compostos e compreender as propriedades dos períodos refratários limiares e da transmissão sináptica. Em última análise, os resultados demonstram como o estudo de modelos de circuitos elétricos de membranas biológicas e das propriedades de nervos vivos pode ser útil como ferramenta didática, conforme demonstrado pela alteração dos componentes de um circuito modelo e pela variação da estimulação do nervo vivo.

Este método pode fornecer uma compreensão de como as membranas biológicas podem ser interpretadas em termos de modelos elétricos. Também pode ser aplicado a outros tecidos, como o músculo Visual. A demonstração deste método é essencial, pois a dissecação do cordão nervoso ventral e a montagem do sistema de gravação podem ser difíceis no início, sendo necessário ter cuidado para não danificar os nervos, a fim de obter uma boa configuração para estimular e registrar atividade no cordão nervoso.

No primeiro momento do experimento, resistores e capacitores são utilizados para simular a atividade elétrica da membrana da célula nervosa. O circuito inicial possui apenas resistores. Capacitores são adicionados em uma etapa posterior.

As propriedades resistivas passivas da membrana nervosa são representadas pelo circuito mostrado aqui. A matriz de contatos é montada com resistores em paralelo de 33 kilo ohms, representando a resistência transversal da membrana, e resistores em série de 10 kilo ohms, representando a resistência intracelular. Este circuito assume que a resistência do fluido externo é desprezível em comparação com as resistências intracelular e transversal da membrana.

Quando seu modelo de célula estiver completo, conecte os cabos de saída do laboratório de energia à placa de prototipagem. O laboratório de energia gera o estímulo e possui uma sonda de medição para registrar a tensão. Em seguida, conecte o laboratório de energia ao computador.

O computador é usado para exibir os sinais elétricos registrados a partir da matriz de contatos. O próximo passo é configurar o software do computador que controlará o estímulo enviado pelo laboratório de potência à célula nervosa modelo. Abra o programa de gravação de laboratório a partir da área de trabalho.

Selecione novo arquivo, selecione configuração e, em seguida, configurações de canal. Selecione um canal para ser exibido, depois selecione o painel do estimulador. São necessários pulsos longos de 1,5 volts.

Para esta parte do experimento, ajuste a amplitude para um volt. O laboratório de potência emitirá uma tensão que flutua entre 0,5 volts positivo e negativo, o que resulta em um estímulo de pico a pico de um volt. Defina a frequência em 0,75 hertz e a duração do pulso em um segundo.

Para as configurações do canal, selecione o canal um para monitoramento, clique no amplificador de entrada e, na caixa, clique no botão diferencial e defina a faixa em cinco volts e selecione Ok. O próximo passo é aplicar um sinal elétrico ao modelo de célula nervosa e examinar a perda do sinal ao longo do comprimento do modelo. Aplique uma tensão em uma extremidade do circuito entre A e B clicando em iniciar no computador.

Meça a tensão na primeira unidade de comprimento ao longo do axônio modelo e monitore-a no computador. Mantenha o cabo vermelho da sonda de medição de tensão fixo no ponto A da placa de circuitos, enquanto move o outro cabo para diferentes posições entre os resistores em série. Observe a queda de tensão nos locais mais distantes.

Agora pare a gravação pressionando parar no computador. Meça as diferenças de tensão salvas nas curvas armazenadas no computador usando o cursor para mover a curva até cada pulso registrado. Use o cursor do marcador M, encontrado no canto inferior esquerdo, para marcar a base da curva e posicione o cursor livre no pico da curva para medir a diferença de tensão.

Leia a medição da diferença de tensão na tela e anote-a em seu caderno para cada local de medição ao longo do circuito. O próximo passo é calcular a constante de comprimento da célula modelo, que é usada para descrever o decaimento exponencial do sinal com a distância. Represente graficamente cada valor da diferença de tensão em um gráfico de diferença de potencial em função da distância em relação à fonte, onde os resistores da membrana são considerados como uma unidade.

Além do seu gráfico, determine a constante de comprimento deste circuito. A constante de comprimento de uma fibra nervosa é definida como a distância na qual uma diferença de potencial através da membrana decai para 37% do seu valor original no ponto de origem. Para simular melhor as propriedades passivas de cabos em fibras nervosas e musculares, a célula nervosa modelo será expandida para conter componentes resistivos e capacitivos.

Não só existe uma resistência transversal da membrana presente na membrana da célula nervosa, como também há uma capacitância da membrana superficial, que distorce o sinal da célula nervosa. Para simular isso, conecte capacitores de 10 microfarads em paralelo com a membrana transversal. Resistores na placa de circuitos no computador.

Configure o estimulador para usar um segundo, um volt, ou seja, um ajuste de amplitude de 0,5 volt e pulsos de 0,75 hertz. Também no canto superior direito do painel, defina a taxa de aquisição para 20 K por segundo. Em seguida, clique no canal um no lado direito da tela.

Clique no amplificador de entrada na caixa. Clique no botão diferencial e defina a faixa em cinco volts. Clique em OK.

Para salvar essas alterações, clique em iniciar para começar a coletar dados. Meça os dados nos mesmos pontos ao longo da matriz de contatos. Após a coleta de dados, use a janela de zoom para ampliar o tempo de subida em um dos pulsos quadrados.

Repita o aumento conforme necessário para expandir o traçado. Meça o tempo que o sinal leva para subir da linha de base até o topo do traçado de tensão, logo antes de se estabilizar.

Observe o curso temporal da alteração do potencial e a distorção dos pulsos quadrados. Observe também se a tensão medida está acima de 0,2 volts; utilizando o cursor M e o cursor livre como antes, leia a alteração na tensão e registre os dados em seu caderno, assumindo como tensão limiar o valor de 0,2 volts. Meça o tempo necessário para que o potencial atinja o limiar em cada resistor da membrana.

Represente graficamente os seus resultados como tempo em função da distância e observe que o aumento na espessura da bainha de mielina produz uma diminuição na capacitância da membrana. Simule isso substituindo os capacitores de 10 micro ferd na placa de prototipagem por capacitores menores de 0,1 micro ferd. Repita o experimento anterior.

Observe a alteração no tempo para atingir o limiar em um resistor selecionado. Sobreponha os dados com os capacitores maiores no gráfico anterior de tempo versus distância. O aumento na espessura da bainha de mielina permite que os sinais elétricos subam e caiam mais rapidamente em uma célula nervosa, aumentando assim a velocidade de condução.

Na próxima parte do experimento, as propriedades eletroquímicas dos axônios serão examinadas no cordão nervoso ventral do lagostim. As propriedades da propagação de corrente passiva apresentadas nos circuitos modelo também são observadas em preparações vivas. No entanto, um potencial de ação é necessário sempre que um sinal precise ser transmitido ao longo de uma distância de alguns milímetros, pois as propriedades elétricas passivas das células atenuariam os sinais nessa distância.

Quando os sinais percorrem o cordão nervoso ventral do lagostim com diferentes velocidades de condução, os mais rápidos serão observados primeiro e os mais lentos serão observados ligeiramente depois. Alguns dos sinais se somarão na gravação, dependendo da população de axônios com velocidades de condução semelhantes. Esse sinal elétrico somado proveniente de múltiplos axônios é denominado potencial de ação composto.

A próxima série de experimentos concentra-se na gravação de potenciais de ação compostos de nervos de lagostim para obter o cordão nervoso ventral do animal. Primeiro, prepare os instrumentos de dissecação para o prato de nervo e as soluções salinas. Coloque o lagostim sobre gelo por cerca de cinco minutos para anestesiá-lo.

Uma vez anestesiado, enrole o lagostim em uma toalha de papel úmida e segure-o com uma das mãos, com as garras entre o polegar e o indicador. Usando a outra mão, faça uma incisão com a tesoura através do rostro, entre as órbitas oculares. Corte em direção descendente a partir da incisão até que a cabeça seja completamente separada.

Remova as garras e as pernas de locomoção. Faça uma incisão na base do tórax cefálico acima do abdômen e separe o tórax cefálico. Remova a cauda e as nadadeiras natatórias.

Realize um corte ao longo de ambos os lados da face ventral do abdômen. Tenha cuidado para não danificar os tecidos mais profundos. Retire a seção solta do exoesqueleto até a base do leque caudal para expor o cordão nervoso ventral.

Usando a borda da pinça, remova cuidadosamente o cordão nervoso ventral pela ponta. Tenha cuidado para não esticar nem esmagar o cordão nervoso. Quaisquer nódulos observados no cordão nervoso são gânglios de lagostim.

Coloque o cordão nervoso sobre as barras metálicas na câmara nervosa. É imperativo manter o cordão nervoso ventral úmido. Para isso, adicione solução salina de lagostim suficiente na câmara nervosa até atingir o nível das barras metálicas transversais.

Em seguida, pipete uma quantidade suficiente da solução salina de lagostim para que o nível do líquido entre em contato apenas com a parte inferior das barras. Uma vez que o cordão nervoso esteja posicionado, conecte o cabo do estimulador com as duas ponteiras em gancho ao compartimento do nervo. Conecte a ponteira vermelha positiva a uma das alças metálicas externas próxima à extremidade do cordão nervoso e conecte a ponteira preta negativa à alça metálica adjacente que também está em contato com o cordão nervoso.

Use o manipulador para posicionar o eletrodo de sucção próximo à extremidade do nervo oposta aos terminais negativo e positivo. Aspire cuidadosamente a ponta da cadeia nervosa ventral para dentro do eletrodo de gravação. Fixe o eletrodo à sonda da etapa inicial conectando um fio do eletrodo de sucção à entrada positiva da sonda e o outro fio à entrada negativa.

Não importa qual fio vai para qual entrada. O eletrodo pode ser aterrado à gaiola de Faraday ou ao banho salino utilizando um fio de cloreto de prata, ou conectado à entrada de terra no amplificador diferencial para reduzir o ruído potencial de 60 hertz. Conecte o eletrodo ao amplificador diferencial e ligue o amplificador ao laboratório de energia.

Verifique as configurações do amplificador RS indicadas na tabela no artigo acompanhante. Use o cabo USB para conectar o PowerLab ao computador. Abra o software Scope na área de trabalho do computador, no canto superior direito da tela.

Selecione o canal dois e desligue. Ajuste a tela para que somente o canal um seja exibido, arrastando a barra do meio até a parte inferior da tela. Verifique o amplificador de entrada com as configurações indicadas no artigo suplementar.

Em seguida, no menu de configuração na parte superior da tela, selecione o estimulador e desligue o estímulo isolado, ajustando o atraso para cinco milissegundos, a duração para um milissegundo, dois pulsos, um intervalo de 15 milissegundos, um alcance de cinco volts e uma amplitude de 0,5 volts. Para iniciar a estimulação do cordão nervoso ventral, clique no botão iniciar no canto inferior esquerdo da tela. Um potencial de ação bem definido deve aparecer na caixa de coleta de dados do osciloscópio.

Esboce a forma geral do potencial de ação em seu caderno. Diminua lentamente a voltagem utilizando a aba no canto superior esquerdo da tela. O potencial de ação deve tornar-se menor em magnitude até que seu padrão de onda característico desapareça.

A redução da voltagem diminui o número de neurônios recrutados para contribuir com o potencial de ação composto; para reverter esse efeito, aumente progressivamente a voltagem. À medida que mais neurônios são recrutados, a onda do potencial de ação composto torna-se maior. Este exercício ilustra o fato de que neurônios individuais possuem diferentes limiares nos quais seus potenciais de ação são desencadeados.

Quando um aumento adicional na voltagem de estímulo não aumenta a resposta composta, todos os neurônios foram recrutados e dois picos distintos na onda do potencial de ação devem ser visíveis na tela do computador. A próxima parte do experimento examina o período refratário dos axônios. Altere o atraso entre os pulsos utilizando a aba no canto superior esquerdo da tela.

Continue encurtando o atraso até que o segundo potencial de ação composto não possa mais ser elicitado. O período refratário absoluto é definido como o atraso temporal entre pulsos no qual um segundo potencial de ação já não é elicitado. O período refratário relativo é definido como o tempo que vai do final do período refratário absoluto até o momento em que a aplicação de um segundo estímulo resulta em um segundo potencial de ação de amplitude máxima.

Agora você pode investigar as propriedades de um inibidor de junções comunicantes, como o heptanol. As diferenças no potencial de ação composto podem ser comparadas para os mesmos parâmetros de estimulação, a fim de determinar quais sinais são conduzidos por meio de junções comunicantes ao longo do cordão nervoso ventral. Você também poderia usar solução salina fria ou solução salina quente e medir as diferenças nas velocidades de condução das diversas entidades que compõem o potencial de ação composto.

Mostrados aqui estão dois potenciais de ação compostos registrados do cordão nervoso ventral de um camarão-de-água-doce. Esta figura ilustra o período refratário relativo, que é o tempo após um potencial de ação composto completo durante o qual um segundo estímulo provoca um potencial de ação composto menor. Esta figura mostra os efeitos do uso de heptano sobre o potencial de ação composto após este procedimento.

Os componentes do circuito da membrana biológica podem ser variados para responder perguntas adicionais, como o efeito de uma densidade alterada de canais de vazamento na membrana ou a função de canais ativados por voltagem após seu desenvolvimento. Essas técnicas e procedimentos abrem caminho para que pesquisadores na área de fisiologia explorem como as células funcionam como circuitos elétricos e como as junções comunicantes funcionam em tecidos vivos de animais.