Name: Determinação de metilação de DNA de genes marcados em Arabidopsis Endosperma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-28T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprenda a determinar a metilação de DNA de genes marcados no endosperma de Arabidopsis usando sequenciamento por bisulfito. Este método permite analisar o status de metilação de alelos maternos e paternos.

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Os autores agradecem a Sra. Jennifer M. Lommel e Tara N. Rognan para a manutenção de plantas de Arabidopsis. Este trabalho foi financiado por fundos start-up de Saint Louis University e dos Institutos Nacionais de Saúde concede 1R15GM086846-01 e 3R15GM086846-01S1 para W. Xiao.

I. Genética Travessia 1. Castrar o pai do sexo feminino A fim de distinguir os alelos maternos e paternos, usando polimorfismo de DNA seqüência, dois ecótipos diferentes, por exemplo, Columbia-0 (Col-0) e Ler, serão escolhidos como pais feminino e masculino. As plantas devem ser jovens e saudáveis. Pode-se castrar o pai do sexo feminino, usando um microscópio de dissecação, ampliando viseira, ou olho nu. Localize estágio-12 flores (Smyth et al., 1990) e remover qualquer flores ou siliques acima e abaixo deles pelo recorte da base do pedicelo com a tesoura. Esterilizar fórceps por imersão a base da ponta suavemente para um copo de etanol a 95%, o que irá remover quaisquer grãos de pólen sobre o forceps e matar o pólen também. Force suavemente para além dos botões florais utilizando fórceps, e remova cuidadosamente 4 sépalas, 4 pétalas e 6 estames, deixando o pistilo nua e intacta. Tente evitar danos ao carpelos durante este processo. 2. Escolher o doador de pólen e realizar a polinização Os doadores de pólen são melhores anthesed flores abertas na fase 14 com as pétalas estendendo em um ângulo de 90 ° para o pistilo (Smyth et al., 1990), em que uma grande quantidade de pólen é derramamento. Pegue a flor na base e um pouco acima do pedicelo, que fará com que a flor a espalhar aberto. Poeira o estigma do pistilo preparado com a antera. Após a polinização, o estigma será coberto com o pólen amarelo, que pode ser facilmente observado sob um microscópio. 3. Rotulagem da cruz Depois de polinizadores todos os pistilos emasculados em uma planta, nós rotulamos a cruz com uma etiqueta de jóias e informações dos pais do sexo feminino e masculino e data. Coloque uma estaca no solo próximo à planta, use uma corda para amarrar a haste da inflorescência para a fogueira, e cobrem os pistilos polinizados com um saco plástico. II. Isolamento de tecidos endosperma em Arabidopsis 1. Preparando materiais Costumamos receber materiais necessários pronto antes da colheita do endosperma e dos tecidos do embrião: um tanque de nitrogênio líquido, nitrogênio líquido, um microscópio de dissecação, dois novos pares de fina ponta pinças (5 INOX FST por Dumont biologia, na Suíça.), Lâminas de vidro de microscópio ( 3 "X 1" X 1.0 mm), um pH 5,7 solução de 0,3 M sorbitol e 5 mM MES. 2. Siliques coleta Aos 7 - ou 8 dias de pós-polinização (DAP), as sementes estão prontas para serem colhidas em meados dos anos para a fase final da embriogênese torpedo e dissecados para endosperma e embrião. Às vezes, pode levar 90-10 DAP se as flores emasculadas são muito jovens. 3. Endosperma e embrião isolando Desde sementes Arabidopsis são pequenos, nós usamos um microscópio de dissecação para isolar endosperma e embrião. Pôr silique 8 DAP-sob um microscópio, use uma pinça para segurar o pedicelo silique e usar a ponta de um outro par de fórceps para deslizar silique a céu aberto na margem onde fundir dois carpelos. Use uma pinça para pegar uma semente em soluções de pH 5,7 a 0,3 M sorbitol e 5 mM MES, faça um pequeno corte no final micrópila a deslizar para fora do embrião, aperte o fim uncut a empurrar para fora endosperma e endosperma separado do tegumento (Kinoshita et al., 2004). Coloque o embrião e endosperma em microtubos separados em nitrogênio líquido. Continue até que acumulamos embrião ou endosperma 10-15 siliques e depois guardar o tubo em um freezer -80 C °. Em alguns casos, endosperma não tem que ser separada da casca da semente, ou seja, pode-se isolar RNA total do endosperma e tegumento mistura para a análise de imprinting gene. III. Seqüenciamento bissulfito 1. Reagentes necessários Brometo de amônio cetiltrimetilamônio (CTAB) para a preparação do DNA genômico, enzimas de restrição, 3 M NaOH (recém-feitos), 6,42 M de uréia / 4 bissulfito de sódio M (2 metabissulfito de sódio M, Sigma-Aldrich, S9000, Na2S2O5, Peso Molecular: 190), 10 mM hidroquinona, um kit de purificação de DNA (Promega Assistente de DNA Sistema Clean-up, Cat. # A7280), TE buffer, 6,3 M NaOH (recém feitos), 10 M NH 4 OAc, 20 mcg / mL tRNA e etanol 100% . 2. Detalhes do protocolo de tratamento bissulfito <ol><li> Endosperma isolar DNA genômico ou embrião através de um procedimento CTAB (Rogers e Bendich, 1988). </li><li> Digest 100 ng - 2 mg de DNA genômico em 20 mL a 100 mL com volume total enzimas de restrição que cortam fora da região a ser analisada. Para o promotor MEA, usamos XhoI, NdeI e PstI ou HindIII. </li><li> Desnaturar as enzimas de restrição do DNA por fervura durante cinco minutos e depois apagar no gelo. </li><li> Adicione 1 / 9 do volume (2,2 mL para 20 mL de DNA digerido) de 3 M NaOH e incubar a 37 ° C por 15 minutos. </li><li> Transferir a solução para um tubo de PCR 250 mL. </li><li> Dissolver 7,5 g de uréia em 10 mL de água destilada estéril; Lentamente, adicionar 7,6 g de metabissulfito de sódio durante 1-2 horas e aquecimento geralmente ajuda a dissolver; Ajustar o pH para 5 com recém feitos 10 M NaOH; Adicionar água destilada estéril para a final volume para 20 mL. Este é 6,24 M de uréia / 4 M de solução de bissulfito de sódio. </li><li> Adicionar 6,24 M de uréia / 4 M de solução de bissulfito de sódio para uma concentração final de 5,36 M e 3,44 M, respectivamente (Paulin et al., 1998). Por exemplo, adicione 208 mL de 6,42 M de uréia / 4 M de solução de bissulfito de sódio para o mL 22,2 acima do DNA genômico desnaturado (Xiao et al., 2003). </li><li> Adicionar 10 mM hidroquinona ao DNA em uma concentração final de 0,5 mM (12 mL para 20 mL a digestão). </li><li> Realizar tratamento em uma máquina de bissulfito PCR: 30 ciclos de 55 ° C por 15 minutos e 95 ° C por 30 segundos. </li><li> Dessalinizar o DNA bissulfito tratado utilizando o Assistente do Sistema DNA Clean-Up da Promega e acompanhar o protocolo (Jacobsen et al., 2000). </li><li> Medir o volume exato de TE recuperado da coluna após dessalinização e adicionar 6,3 M NaOH a uma concentração final de 0,3 M. Incubar a 37 ° C por 15 minutos. </li><li> Adicionar 10 M NH 4 OAc (pH 7,0) para uma concentração final de 3 M, 2 mL de 20 mcg / mL tRNA e 3 volumes de etanol 100% e, em seguida, misture. Centrifugar por 15 minutos a 14.000 rpm. </li><li> Lave o pellet uma vez com etanol 70%, faça uma centrífuga curto, e remover o etanol extra. </li><li> Pellet seco em um speedvac por 5-10 minutos e ressuspender em 25-100 mL tampão TE dependendo de partida quantidade de DNA. O tratado pelo bissulfito de sódio DNA está pronto para a análise PCR. </li></ol> 3. Amplificação por PCR <ol><li> Desde citosinas não metiladas são convertidas em uracila, é difícil para amplificar um fragmento grande usando o DNA tratado pelo bissulfito como um modelo. Assim, costumamos projetar primers para amplificar um produto não superior a 500 pb. Para a seqüência de 4 kb promotor MEA, nós projetamos muitos conjuntos de primers e amplificado 14 fragmentos sobrepostos para cobrir toda a região (Xiao et al., 2003). </li><li> Para seqüenciar o top-fio, na concepção de uma cartilha para a frente, I) escolher um G (guanina) rica região a fim de ter uma maior temperatura de tratamento térmico, sem extras nucleotídeos na primers; II) mudança C (citosina) para Y ( pirimidina) em CG e contextos CNG e alterar o restante para C T (timina). Na concepção de um primer reverso, I), escolha uma região C-ricos; II) para mudar G R (purina) em CG e contextos CNG e alterar o G restantes para A (adenina). </li><li> Para seqüenciar o fundo vertente, na concepção de uma cartilha para a frente, I), escolha uma região C-ricos; II) a mudança para R G em CG e contextos CNG e alterar o G restantes para A. Ao projetar um primer reverso, I) escolha uma região rica em G; II) mudança C para Y (pirimidina) em CG e contextos CNG e alterar o C restantes para T. </li><li> Nós usamos geralmente 1-2 mL do sódio DNA tratado pelo bissulfito como um modelo para cada PCR (Xiao et al., 2003). O produto da PCR deve ser analisado por eletroforese em gel para confirmar o tamanho correto do fragmento, então a ser purificado com gel e clonados no vetor de clonagem TOPO TA pCR2.1 (Invitrogen), como uma inserção. A única colônia é captado e culta; DNA plasmidial extraídos e enviados para o seqüenciamento. </li></ol> 4. Análise da seqüência O princípio do seqüenciamento bissulfito é que citosina unmethylated será convertido para uracil devido à desaminação hidrolítica pela alta concentração de bissulfito de sódio a pH5.0 que será amplificada como timina no produto de PCR, enquanto 5-metil citosina não será modificado por bissulfito de sódio e continuam a ser citosina após a amplificação (Clark et al, 1994;. Frommer et al, 1992).. Depois de obter o resultado de seqüenciamento, que compará-lo com o modelo vertente específica que é usado para a amplificação PCR. Se um resíduo citosina no modelo lê como uma timina no resultado seqüenciamento, isso indica que a citosina não está metilado. Se um resíduo citosina no modelo continua a ser uma citosina no seqüenciamento, isso significa que a citosina é metilado. IV. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2327/2327fig1.jpg" alt="Figura 1 /" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1 /"> Figura 1.

<ol><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+bisulphite+sequencing+of+the+Arabidopsis+genome+reveals+DNA+methylation+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning.</a> Nature. 452, 215-219 (2008).</li>
<li>Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).</li>
<li>Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+glycosylase+establishes+MEDEA+polycomb+gene+self-imprinting+by+allele-specific+demethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation.</a> Cell. 124, 495-506 (2006).</li>
<li>Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+sodium+bisulfite+sequencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Accurate sodium bisulfite sequencing in plants.</a> Epigenetics. 5, 47-49 (2010).</li>
<li>Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+demethylation+of+Arabidopsis+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm.</a> Science. 324, 1451-1454 (2009).</li>
<li>Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+hypermethylation+of+flower-specific+genes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).</li>
<li>Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-way+control+of+FWA+imprinting+in+Arabidopsis+endosperm+by+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation.</a> Science. 303, 521-523 (2004).</li>
<li>Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+integrated+single-base+resolution+maps+of+the+epigenome+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis.</a> Cell. 133, 523-536 (2008).</li>
<li>Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462, 315-322 (2009).</li>
<li>Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urea+improves+efficiency+of+bisulfite-mediated+sequencing+of+5%27-+methylcytosine+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5'- methylcytosine in genomic DNA.</a> Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).</li>
<li>Rogers, S. O., &amp, B. endich, J, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Manual%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from plant tissues.</a> Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Flower+Development+in+Arab%C3%ADdopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early Flower Development in Arabídopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinting+of+the+MEA+Polycomb+gene+is+controlled+by+antagonism+between+MET1+methyltransferase+and+DME+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase.</a> Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

É relativamente fácil separar embrião do endosperma e tegumento, mas é entediante para separar endosperma de tegumento, especialmente para sementes na fase inicial ou média torpedo da embriogênese. Desde tegumento contribui apenas com uma pequena quantidade de tecido, para alguns genes, por exemplo, MEA e FWA, não temos para separar endosperma de tegumento. Isso significa que podemos isolar RNAs de uma mistura de endosperma e tecidos tegumento, verificar a expressão dos alelos maternos e paternos de um...

Abastecimento <ul><li> Microscópio de dissecação </li><li> Tesoura </li><li> Pinça Ponta Fina </li><li> Tag da jóia </li><li> Estacas de plantas </li><li> Barbante ou fios de arame </li><li> 4 &quot;X 2&quot; X 8 &quot;sacos de polietileno </li><li> 3 &quot;X 1&quot; X 1,0 milímetros Lâminas de microscopia </li><li> Nitrogênio líquido </li><li> Recipientes de azoto líquido </li><li> Bloco de calor </li><li> PCR Tubes </li><li> Termociclador </li><li> Tubos de microcentrífuga </li><li> Microcentrífuga </li><li> Instalação de eletroforese em gel </li><li> Arabidopsis thaliana Columbia-0 Plantas </li><li> Arabidopsis thaliana Landsberg Plantas erecta </li></ul> Reagentes <ul><li> Etanol 70% </li><li> Etanol 95% </li><li> O etanol 100% </li><li> 0,3 M de sorbitol e 5 mM MES-pH 5,7 </li><li> Brometo de amônio cetiltrimetilamônio (CTAB) </li><li> O etanol 100% </li><li> Cholorform </li><li> Enzimas de Restrição </li><li> 3 M NaOH </li><li> 6,3 M NaOH </li><li> 6,24 M de uréia / 4 bissulfito de sódio M </li><li> Destilada estéril H 2 O </li><li> 10 mM hidroquinona </li><li> Assistente de DNA Sistema Clean-Up (Promega) </li><li> 10 M NH 4 OAc </li><li> 20 mcg / mL tRNA </li><li> Tampão TE </li><li> O TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) </li></ul>

determinação de metilação de dna de genes marcados em arabidopsis endosperma

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana é um organismo excelente modelo para estudar mecanismos epigenéticos. Uma das razões é o mutante nulo de perda de função de DNA metiltransferases é viável, proporcionando assim um sistema para estudar como a perda da metilação do DNA em um genoma afeta o crescimento e desenvolvimento. Imprinting refere-se a expressão diferencial dos alelos maternos e paternos e desempenha um papel importante no desenvolvimento da reprodução em ambos os mamíferos e plantas. Metilação do DNA é fundamental para determinar se os alelos maternos ou paternos de um gene é expresso impressa ou silenciados. Em plantas com flores, há um evento de fertilização dupla na reprodução: um espermatozóide fertiliza o óvulo para formar um embrião e esperma fusíveis segundo com a célula central para dar origem a endosperma. Endosperma é o tecido onde imprinting ocorre nas plantas. MEDEA, a SET domínio gene grupo Polycomb e FWA, um fator de transcrição que regulam a floração, são os dois primeiros genes mostrado para ser impressa no endosperma e sua expressão é controlada por metilação do DNA e desmetilação em plantas. , A fim de determinar o status de impressão de um gene e padrão de metilação no endosperma, precisamos ser capazes de isolar endosperma primeiro. Desde que a semente é pequena em Arabidopsis, ele continua sendo um desafio para isolar endosperma Arabidopsis e examinar a sua metilação. Neste protocolo de vídeo, relatamos como conduzir um cruzamento genético, para isolar o tecido de endosperma de sementes, e para determinar o estado de metilação de seqüenciamento bissulfito.

Imprinting é um fenômeno em plantas e da reprodução de mamíferos. Metilação do DNA desempenha um papel importante nos mecanismos de imprinting. Isolando endosperma e determinação do estatuto de metilação de genes imprinted em<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Pode ser difícil. Neste protocolo, descrevemos como isolar endosperma e determinar a metilação por seqüenciamento bissulfito.

Determinação de metilação de DNA de genes marcados em Arabidopsis Endosperma

Arabidopsis thaliana é um excelente organismo modelo para o estudo de mecanismos epigenéticos. Uma das razões é o mutante nulo de perda de função de DNA...

O objetivo geral deste procedimento é determinar o estado de metilação do DNA em genes impressos no endosperma. Isso é realizado primeiramente mediante a emasculação da planta feminina. Em seguida, a planta feminina é polinizada com o pólen da planta masculina.Em seguida, o endosperma é dissecado a partir da semente proveniente da polinização cruzada. O passo final do procedimento é realizar o sequenciamento com bissulfito do DNA do endosperma. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o estado de metilação do DNA do alelo materno ou paterno de um gene imprintado por meio de polimorfismo de sequenciamento de DNA em diferentes ecótipos e do sequenciamento com bissulfito.Olá, sou o Dr. Yang Shaw do Departamento de Biologia da Universidade de St. Louis. Olá, sou Matthew Ray do laboratório do Dr. J e do Departamento de Biologia da Universidade de St. Louis. Sou Diman Panu do laboratório do Dr. J.Hoje vamos mostrar um procedimento para dissecar um oficial de rúgbi e determinar o status de metilação do DNA por sequenciamento sulf FER. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a impressão gênica regulada pela metilação e desmetilação do DNA. Então, vamos começar.Para iniciar este procedimento, escolha dois ecótipos diferentes de Arabidopsis para atuarem como pais feminino e masculino, a fim de distinguir os alelos maternos e paternos utilizando polimorfismo de sequência de DNA. Aqui, Columbia zero e Landsberg Erecta são escolhidos como pais feminino e masculino, respectivamente. Tenha o cuidado de escolher plantas jovens e saudáveis.Emasculhe o progenitor feminino com a ajuda de um microscópio estereoscópico. Localize flores no estágio 12 e remova quaisquer flores ou primórdios florais acima e abaixo delas cortando a base do pedúnculo com tesoura. Esterilize a pinça mergulhando suavemente a base da ponta em um béquer contendo etanol a 95%.Isso removerá quaisquer grãos de pólen da pinça e matará o pólen. Abra cuidadosamente as gemas florais usando a pinça e remova com cuidado quatro sépalas, quatro pétalas e seis estames, deixando o pistilo exposto e intacto. Tente evitar danos aos carpelos durante este processo.O próximo passo é escolher o doador de pólen e realizar a polinização. Os melhores doadores de pólen são flores abertas no estágio 14, com pétalas estendidas em um ângulo de 90 graus em relação ao pistilo, nos quais há grande liberação de pólen. Segure a flor pela base e logo acima do pedúnculo, o que fará com que a flor se abra e solte o pólen. Toque o estigma do pistilo preparado com a antera.Após a polinização, o estigma ficará coberto com pólen amarelo, o qual pode ser facilmente observado ao microscópio. Após polinizar todos os pistilos emasculados em uma planta, identifique o cruzamento com uma etiqueta de joalheria. Inclua a data e as informações sobre os genitores feminino e masculino.Coloque uma estaca no solo próximo à planta. Use um barbante para amarrar o caule do indivíduo em fluorescência à estaca e cubra os pistilos polinizados com um saco plástico. Sete ou oito dias após a polinização, ou DAP, a semente deverá estar pronta para ser colhida no estágio médio a tardio do embrião em forma de torpedo e dissecada.Para o endosperma e embrião, posicione um salic de oito DAP sob o microscópio estereoscópico. Usando um par de pinças, segure a célula EK P e utilize a ponta de outro par de pinças para abrir suavemente a sola na margem onde os dois carpelos se fundem. Use um par de BPS para pegar uma semente e colocá-la sobre uma lâmina de vidro.Em seguida, faça um pequeno corte na extremidade do microtubo para retirar o embrião. Aperte a extremidade não cortada para expelir o endosperma e separá-lo da casca da semente. A seguir, coloque o embrião e o endosperma em microtubos separados e no nitrogênio líquido.Continue este procedimento até que seja acumulada quantidade suficiente de embrião ou endosperma de 10 a 15 CLICs. Em seguida, armazene os tubos em um congelador a menos 80 graus Celsius antes do tratamento com bissulfito. Isole o DNA genômico de endosperma ou embrião utilizando um procedimento sutil de brometo de trimetilamônio ou CTAB.Uma vez que o DNA genômico do endosperma tenha sido isolado, digira 100 nanogramas em uma reação com volume total de 20 microlitros com enzimas de restrição que cortam fora da região a ser analisada. Para o promotor ME, as enzimas de restrição XhoI, HindIII e PSTI são utilizadas. Desative as enzimas de restrição fervendo o DNA por cinco minutos.Em seguida, interrompa a reação em gelo. Adicione um nono volume ou 2,2 microlitros de hidróxido de sódio 3 molar e incube a 37 graus Celsius por 15 minutos. Após a incubação, transfira a solução para um tubo PCR de 250 microlitros.Em seguida, prepare uma solução de ureia 6,24 molar e tiossulfato de sódio 4 molar dissolvendo 7,5 gramas de ureia em 10 mililitros de água destilada estéril, adicionando lentamente 7,6 gramas de metabissulfito de sódio ao longo de uma a duas horas, enquanto a solução é aquecida e agitada. Após completa dissolução, ajuste o pH para 5,0 com hidróxido de sódio 10 molar recém-preparado.Adicione água destilada estéril até um volume final de 20 mililitros. Transfira 208 microlitros desta solução para 22,2 microlitros do DNA genômico de endosperma desnaturado. Em seguida, adicione 12 microlitros de hidroquinona recém-preparada 10 milimolar ao DNA.Realize o tratamento com bissulfito em uma máquina de PCR com 30 ciclos de 55 graus Celsius por 15 minutos, seguidos por 95 graus Celsius por 30 segundos. Em seguida, dessaline o DNA tratado com bissulfito utilizando o sistema Wizard de purificação de DNA da Promega. De acordo com as instruções do fabricante, meça o volume exato de TE recuperado da coluna após a dessalinização.Em seguida, adicione hidróxido de sódio 6,3 molar para atingir uma concentração final de 0,3 molar. Incube a mistura a 37 graus Celsius por 15 minutos. Após a incubação, adicione acetato de amônio 10 molar para uma concentração final de três molar, dois microlitros de TRNA a 20 microgramas por microlitro e três volumes de etanol a 100%.Homogeneíze a amostra e centrifugue por 15 minutos a 14.000 RPM. Lave o pellet uma vez com etanol 70%, seguido por uma breve centrifugação para remover o etanol em excesso. Por fim, seque o pellet em um speed vac por cinco minutos e reconstitua em 25 microlitros de tampão TE.O DNA tratado com bisulfito de sódio está agora pronto para análise por PCR. Para sequenciar o promotor Madea de quatro quilobases, projete vários conjuntos de iniciadores e amplifique 14 fragmentos sobrepostos para cobrir toda a região. Comece projetando um iniciador direto para sequenciar a fita superior.Primeiro, escolha uma região rica em guanina para obter uma temperatura de anelhamento mais alta sem nucleotídeos excessivamente longos nos iniciadores. Em seguida, substitua a citosina por uracila nos contextos CG e CNG. Depois, substitua qualquer outra citosina por timina.Ao projetar um iniciador reverso, escolha uma região rica em citosina. Altere guanina para purina nos contextos CG e CNG e qualquer outra guanina para adenina. Para sequenciar novamente a fita inferior, comece projetando um iniciador direto.Escolha uma região rica em citosina e substitua a guanina por purina nos contextos CG e CNG. Substitua as demais guaninas por adenina. Ao projetar a ponta reversa, escolha uma região rica em AINE.Altere a citosina para paridina em contextos CG e CNG e altere as citosinas restantes para timina. Após o design dos iniciadores, prepare uma reação de PCR utilizando dois microlitros do DNA tratado com bissulfito de sódio como molde para cada amplificação por PCR. Execute a reação de PCR e analise o produto por eletroforese em gel para confirmar o tamanho correto do fragmento.Próximo gel. Purifique o produto de PCR e clone-o no vetor de clonagem topo TA da Invitrogen PCR 2.1. Como inserto, sequencie clones individuais; o princípio do sequenciamento com bissulfito é que a citosina não metilada será convertida em uracila devido à desaminação hidrolítica por alta concentração de bissulfito de sódio em pH 5,0.Por outro lado, a cinco metilcitosina não será modificada pelo sulfito de sódio. A uracila será amplificada como timina no produto da PCR, enquanto a citosina metilada permanecerá como citosina após a amplificação por PCR. Após obter o resultado do sequenciamento, compare-o com o molde específico da fita utilizado para a amplificação por PCR.Se um resíduo de citosina no molde for lido como timina no resultado do sequenciamento, isso indica que a citosina não está metilada. Se um resíduo de citosina no molde permanecer como citosina no resultado do sequenciamento, significa que a citosina está metilada. O estado de metilação do alelo materno de MEA na região de menos 500 pares de base do promotor de MEA para cinco sítios CpG metilados nos clones sequenciados de Columbia, g Clarus cruzado com endosperma RLD é mostrado; citosinas metiladas são indicadas por círculos pretos preenchidos e citosinas não metiladas por círculos brancos sem preenchimento. De forma semelhante, o estado de metilação para o alelo materno de Madea de Columbia, Gladys cruzado com embrião RLD é apresentado.Acabamos de mostrar como isolar o endosperma e realizar o sequenciamento por sulfito ao executar este procedimento. É importante lembrar de seguir o protocolo corretamente. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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