Name: Produção de C. elegans Transgenes via Recombineering com o GalK Marcador selecionável (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:58:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprenda a produzir transgenes em Caenorhabditis elegans usando DNA genômico de clones da biblioteca SMID. Este método preserva elementos reguladores nativos através de recombinação lambda red com marcador selecionável GalK.

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Os autores gostariam de agradecer a Lindsey Nash para ajudar a desenvolver a técnica. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder AG028977 a ALF, uma bolsa de projeto piloto da Universidade de Pittsburgh OAIC (AG024827), e fundos de sementes da Universidade de Pittsburgh.

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<li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-3+mediates+the+initial+clustering+and+apical+localization+of+junction+and+polarity+proteins+during+C.+elegans+intestinal+epithelial+cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization.</a> Development. 137, 1833-1842 (2010).</li>
<li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+cloning+of+unc-119%2C+a+gene+expressed+in+the+Caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Genetics. 141, 977-988 (1995).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A geração de transgenes de fosmids oferece o benefício de manter todos os elementos promotor nativo, splice variantes, e três elementos &#39;UTR de regulamentação. Isso pode levar à construção de um transgene que é mais um reflexo do padrão de expressão nativa, ou a construção de um transgene funcional quando outras abordagens não 5. Os transgenes resultante pode carregar uma variedade de etiquetas de epítopo incluindo GFP ou um tag TAP. A construção de transgenes envolveu três pa...

<table><tbody><tr><td>Kit FosmidMAX</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>FMAX046</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq</td><td>Promega Corp.</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Meio MOPS</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2120</td><td></td></tr><tr><td>Solução de fosfato de potássio 0,132 M</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2102</td><td></td></tr><tr><td>D-galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>2-desoxigalactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4407</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Leucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Polimerase Phusion de DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>F-530S</td><td></td></tr><tr><td>Base de ágar MacConkey</td><td>BD Biosciences</td><td>281810</td><td></td></tr><tr><td>Araquino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3131</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Ágar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr></tbody></table>

produção de c. elegans transgenes via recombineering com o galk marcador selecionável

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

A criação de animais transgênicos é amplamente utilizada em C. elegans pesquisa, incluindo o uso de proteínas de fusão GFP para estudar a regulação e padrão de expressão de genes de interesse ou de geração de conjunto de purificação de afinidade (TAP) com a tag versões de genes específicos para facilitar a sua purificação. Tipicamente transgenes são gerados pela colocação de um promotor a montante de um gene repórter GFP ou cDNA de interesse, e isso muitas vezes produz um padrão de expressão representativa. No entanto, elementos críticos da regulação de genes, como elementos de controle na região não traduzida 3 &#39;ou promotores alternativos, podem ser perdidos por esta abordagem. Mais apenas uma variante única emenda pode ser geralmente estudado por este meio. Em contraste, o uso de DNA genômico verme transportado por clones DNA fosmid provavelmente inclui a maioria se não todos os elementos envolvidos na regulação de genes in vivo que permite a maior capacidade de capturar o padrão de expressão genuína e timing. Para facilitar a geração de transgenes usando DNA fosmid, descrevemos um E. coli baseado recombineering procedimento para inserir GFP, a TAP tag, ou outras seqüências de interesse em qualquer local do gene. O procedimento utiliza o gene galK como o marcador de seleção para as duas etapas de seleção positiva e negativa em recombineering o que resulta na obtenção da modificação desejada com alta eficiência. Além disso, plasmídeos contendo o gene galK ladeado por braços homologia com GFP comumente usados ​​e TAP genes de fusão estão disponíveis que reduzem o custo de oligos em 50% ao gerar um GFP, ou proteína de fusão TAP. Estes plasmídeos use a origem de replicação R6K que impede a necessidade de purificação extensa produto da PCR. Finalmente, também demonstram uma técnica para integrar o marcador unc-119 para o backbone fosmid que permite que o fosmid a ser injetado diretamente ou bombardeados em vermes para gerar animais transgênicos. Este vídeo demonstra os procedimentos envolvidos na geração de um transgene através recombineering utilizando este método.

A capacidade de produzir transgenes para<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Usando DNA genômico realizado por fosmids é particularmente atraente como todos os elementos nativos reguladoras são retidos. Descrito é um procedimento simples e robusto para a produção de transgenes via recombineering com o<em&gt; GalK</em&gt; Marcador selecionável.

Produção de C. elegans Transgenes via Recombineering com o GalK Marcador selecionável

A criação de animais transgênicos é amplamente utilizada na pesquisa com C. elegans, incluindo o uso de proteínas de fusão com GFP para estudar a regulação e...

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar transgenes utilizando o DNA genômico de vermes contido em um clone de biblioteca SMID. O uso de DNA genômico preserva todos os elementos reguladores nativos, como os enhancers nas regiões UTR três primas. Isso é alcançado ao transferir o SMID FO para a linhagem de E. coli SW106, a fim de utilizar a maquinaria de recombinação lambda red induzível.Como segundo passo, o gene GAL K é inserido na posição desejada no FO smid, marcando o local onde a GFP ou a marcação tap será colocada. Em seguida, o gene Gade é substituído pela GFP ou por uma marcação tap TAC por meio de recombinação homóloga, seguida por seleção negativa utilizando galactose desoxi, a fim de criar o transgene modificado. Os resultados obtidos mostram que esses transgenes podem ser criados rapidamente e com sucesso, com base na verificação da inserção do T por PCR de colônia.Olá, meu nome é Love Ship. Trabalho no Laboratório Fisher na Universidade de Pittsburgh. Hoje estou demonstrando a técnica de criação de transgênicos em C. elegans.Por que a recombinação com GK como marcador selecionável. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes de criação de transgenes Cogan é que, neste método, utilizamos o DNA genômico do gene de interesse e, assim, conseguimos abranger todos os elementos críticos da regulação gênica, como elementos reguladores na região UTR três prima, transcritos de splicing alternativo, promotores alternativos e regiões distais que poderiam ser omitidos nas abordagens convencionais baseadas em clonagem padrão. Então, vamos começar.Pedir o clone FO smid para o gene de interesse ou GOI a partir de um serviço de genes, utilizando o Worm Base como guia. Ao selecionar os clones, escolhemos aqueles em que o GOI está no centro da sequência. Clones que excluem genes vizinhos podem ser preferíveis, mas podem ser difíceis de encontrar em cultura.O clone SMID para o GOI em LB contendo 12,5 microgramas por mililitro de cloranfenicol, os smid são enviados na linhagem EPI 300 e podem ser cultivados a 37 graus Celsius. Em seguida, cultive uma cultura de 1,5 mililitro durante a noite do SMID a 37 graus Celsius e faça a mini-prep do DNA smid. Utilizando o kit de preparação SMID da Epicenter, siga o protocolo alternativo descrito nas instruções, que envolve adicionar a mistura Ribo shorter em uma etapa anterior, determine a concentração de DNA FOSS.Usar um espectrofotômetro, o campo é geralmente muito baixo, mas adequado. Para uma eletroporação bem-sucedida, prepare células eletrocompetentes SW106 cultivando um cultivo noturno de cinco mililitros em meio LB a 32 graus Celsius em um tubo de tampa rosqueável de 14 mililitros.Na manhã seguinte, inocular um mililitro da cultura em 100 mililitros de lb em um frasco de dois litros. Crescer as bactérias SW 1 0 6 até uma DO600 de 0,6 a 0,8.Não faça choque térmico. Peliculize as células por centrifugação a 5.000 Gs durante cinco minutos. Re-suspenda o pellet por vortexagem suave em um mililitro de glicerol a 10% gelado.Em seguida, adicione 50 mililitros de glicerol a 10% gelado. Repita este passo de lavagem uma vez. Por fim, pelote o SW 1 0 6 por centrifugação novamente e despreze tudo, exceto cerca de 500 microlitros de cada sobrenadante Resus.Suspenda os pellets com vortex suave, congele 100 microlitros de Ali Watts em nitrogênio líquido ou sobre gelo seco e armazene a menos 80 graus Celsius até o momento da transformação. Transforme o DNA fosmídeo em células eletrocompetentes SW106 por eletroporação das bactérias com cerca de 50 nanogramas de DNA fosmídico em cubetas com entreferro de 0,1 centímetro, utilizando um eletroporador EOR 2510 a 1.350 volts. Recupere as bactérias em um mililitro de LB durante uma hora a 32 graus Celsius, plaque em placas de LB com cloranfenicol e incube a 32 graus Celsius durante a noite.Verifique a presença do gene de interesse utilizando PCR de colônia, cultivando um cultivo de cinco mililitros durante a noite em LB com 12,5 microgramas por mililitro de cloranfenicol a 32 graus Celsius. Em seguida, adicione 0,5 microlitros do cultivo a uma reação-padrão de PCR com os oligos flanqueadores e aumente a incubação inicial a 95 graus Celsius para cinco minutos para lisar as bactérias antes da reação. Por fim, prepare um estoque glicerolado para armazenamento de longo prazo para inserir o gene gal K no FO smid que carrega seu gene de interesse.Primeiro, prepare placas de meio mínimo MOPS contendo 0,2% de galactose. Consulte a parte escrita deste protocolo para a receita. Em seguida, amplifique por PCR o cassete P mod four gal, k, g ou P mod four gal K GT.Utilizamos gel de fusão ou go tac. Purifique o produto da PCR resultante. Quantifique o rendimento em um gel ou utilizando um espectrofotômetro NanoDrop.Armazene o produto da PCR a quatro graus Celsius até o momento de usar. Inocule cinco mililitros de lb com cloranfenicol com células SW 1 0 6 contendo o DNA Foss. Incube durante a noite a 32 graus Celsius. Adicione um mililitro da cultura de crescimento noturno a 100 mililitros de lb com cloranfenicol. Em um frasco de dois litros, cultive até uma DO de 0,6 a 0,8.Isso geralmente leva de três a quatro horas enquanto o cultivo está crescendo. Ajuste um banho-maria agitador a 42 graus Celsius para aquecer, com um frasco estéril de 250 mililitros no suporte. O uso de um banho-maria agitador na próxima etapa é essencial para obter alta eficiência.Em seguida, transfira 50 mililitros da cultura SW 1 0 6 para o frasco de 250 mililitros e submeta-a a choque térmico a 42 graus Celsius e 100 RPM por exatamente 20 minutos no banho de água agitado. Mantenha as bactérias restantes a 32 graus Celsius para utilizá-las como controle não induzido. Resfrie as bactérias induzidas e não induzidas em gelo por 10 minutos.Transfira as amostras para dois tubos estéreis de centrífuga e faça a pelotização a cerca de 5.000 Gs durante cinco minutos. Descarte todo o sobrenadante e re-suspenda o pellet em um mililitro de glicerol a 10% gelado mediante vortexagem suave. Adicione mais 49 mililitros de glicerol a 10% gelado.Repita esta lavagem e, em seguida, centrifugue mais uma vez. Remova o sobrenadante invertendo os tubos e ressuspenda o pellet na pequena quantidade restante de líquido Eloqua em amostras de 100 microlitros. Congele em gelo seco e armazene a menos 80 graus Celsius no dia seguinte.Parada eletro, as células SW 1 0 6 induzidas e não induzidas com 150 nanogramas do produto de PCR preparado utilizando cubetas de 0,1 centímetro de afastamento em um eletroporador einor 25 ton. Ajustado em 1.350 volts. Recupere as bactérias em um mililitro de LB em um tubo Falcon de 14 mililitros.Incube a 32 graus Celsius por quatro horas e meia; após a incubação, pelletize as bactérias a 13.200 RPM por 15 segundos e re-suspenda em meio M nove. Consulte a parte escrita deste protocolo para a receita. Repita esta etapa de lavagem duas vezes.Para remover qualquer meio rico, faça uma nova centrifugação das células e re-suspenda em um mililitro de M nove antes de realizar a diluição seriada em mops. Incube o meio mínimo por três a cinco dias a 32 graus Celsius em uma incubadora. Tenha paciência, pois os verdadeiros positivos crescem lentamente; risque uma colônia em ágar Macon para purificar a colônia e verificar se ela é positiva para GLK.As colônias devem ficar rosa brilhante. Escolha uma única colônia e inocule um cultivo noturno de cinco mililitros de lb com cloranfenicol, incubado a 32 graus Celsius. Confirme a inserção do bloqueio de gal na localização correta por meio de PCR utilizando os oligos flanqueadores.Consulte a tabela um na parte escrita deste protocolo. Para as sequências de oligonucleotídeos, adicione 0,5 microlitros da cultura a uma reação padrão de PCR e aumente a incubação inicial a 95 graus Celsius para cinco minutos para lisar as bactérias. O produto de PCR deve apresentar um aumento no tamanho devido à presença do gene GAL K.Por fim, prepare um estoque de glicerol para armazenamento. Prepare placas de meio mínimo MOPS contendo 0,2% de galactose desoxigenada ou DOG e 0,2% de glicerol. Consulte a parte escrita deste protocolo para a receita.PCR.Amplifique os fragmentos marcadores do PMO 4G FP PBS 1761 ou PBS 1479 utilizando os mesmos oligos usados na primeira rodada ou oligos mais curtos específicos para GFP ou tap. Se você estiver produzindo múltiplos construtos, é particularmente útil usar os oligos mais curtos, pois o mesmo produto de PCR pode ser utilizado para todos os construtos. Purifique o produto de PCR em gel e meça a concentração em gel ou com um espectrofotômetro. Gere células competentes induzidas e não induzidas W 1 0 6 portadoras do SMID com o gene Gale K conforme descrito anteriormente. Transforme as células SW 1 0 6 induzidas e não induzidas com cerca de 100 nanogramas do produto de PCR utilizando cubetas de 0,1 centímetro de folga em um eletroporador EINOR 25 10 ajustado a 1.350 volts.Recupere em um mililitro de LV em um tubo com tampa de rosca de 14 mililitros e incube em um agitador a 32 graus Celsius por quatro horas e meia. Lave e dilua as células em M nove conforme mostrado anteriormente. Plaque as bactérias em MOPS, meio mínimo contendo 0,2% DOG e 0,2% glicerol, e incube as placas a 32 graus Celsius por três dias para confirmar a presença da inserção.Utilize quatro colônias para inocular culturas de cinco mililitros em LB com 12,5 microgramas por mililitro de cloranfenicol. Realize PCR de colônia conforme descrito anteriormente. Utilizamos tanto os oligos específicos mais curtos para GFP quanto os oligos flanqueadores para demonstrar o inserto correto e o local correto.GFP possui cerca de 800 pares de bases. TAP tem cerca de 550 pares de bases e gal KT tem 1,4 quilobases. Finalmente, prepare um estoque glicerinado para armazenamento de longo prazo.A modificação de FO smed por meio de recombinação fornece resultados robustos e taxas de sucesso superiores a 90% na etapa de seleção negativa, o que é rotineiramente observado. Além disso, este protocolo leva cerca de duas semanas para ser concluído, o que torna o preparo de transgenes relativamente rápido, conforme demonstrado pelas 48 colônias identificadas em placas DOG e utilizadas para PCR de colônia com os oligos flag GFP, que amplificaram o inserto GFP neste experimento. 47 das 48 colônias estão corretas e uma colônia não foi modificada corretamente, conforme mostrado pelas 48 colônias identificadas em placas DOG e utilizadas para PCR de colônia com os oligos flag GFP, que amplificaram o inserto GFP neste experimento.46 das 48 colônias estão corretas e duas colônias não foram modificadas corretamente. O ponto mais importante a ser lembrado ao realizar este experimento é que as bactérias SW 1 0 6 devem ser cultivadas a 32 °C e não a temperaturas mais altas, pois o crescimento em temperaturas elevadas selecionará mutantes com mutações que prejudicam a maquinaria Lambda red. Desejamos boa sorte em seu experimento.

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Proteínas, muitas vezes contêm vários domínios que podem exercer diferentes funções celulares. Gene knock-out (KO) não consideram essa diversidade funcional. Aqui, relatamos uma abordagem de estrutura-função com base na troca de cassete mediada por recombinação (RMCE) em KO células estaminais embrionárias que permite a dissecação molecular de vários domínios funcionais ou variantes de uma proteína.

Estudos de estrutura-função em células estaminais embrionárias Rato Usando recombinase mediada por troca cassete

Aqui, apresentamos um método para engenheiro do genoma de c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteínas e modelos de reparo dependente de homologia.

Uma rápida e superficial Pipeline para gerar Genomic ponto mutantes em c. elegans usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

Descrito aqui é um método para exclusão genética direcionada e sem marcadores em Chlamydia trachomatis usando mutgênese de troca de floxed, FLAEM.

Exclusão genética sem marcadores por Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagênese em Chlamydia trachomatis

Um fluxo de trabalho de microinjeção CRISPR/Cas9 para marcação fluorescente endógena na linha germinativa de Caenorhabditis elegans , visando obter linhas homozigotas knock-in para análise in vivo de localização de proteínas.

Marcação Endógena Fluorescente Mediada por CRISPR/Cas9 de Genes Específicos da Linhagem Germântica em Caenorhabditis elegans

Aplicação de eletrofisiologia às sinapses acessível fornece uma medida quantificável de atividade sináptica, útil na análise de mutantes sináptica. Este artigo descreve um método de dissecação usada para expor as junções neuromusculares (MNJ)...

Dissecação e gravação a partir da junção neuromuscular C. Elegans

Aprenda a produzir transgenes em Caenorhabditis elegans usando DNA genômico de clones da biblioteca SMID. Este método preserva elementos reguladores nativos através de recombinação lambda red com marcador selecionável GalK.

Produção de C. elegans Transgenes via Recombineering com o GalK Marcador selecionável

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