Name: Isolamento e In vitro A ativação do Caenorhabditis elegans Sperm (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-31T19:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Aprenda a isolar e ativar espermatozoides de Caenorhabditis elegans in vitro usando dissecação e tratamento com protease. Este método permite visualizar a morfologia espermática para estudos de biologia reprodutiva.

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Agradecemos a Samuel Ward, Diane C. Shakes e Gregory Nelson de pioneiro dessa técnica. Agradecemos a Pavan Kadandale e Brian Geldziler para vídeos mostrando espermatozóides ativados; membros do laboratório Singson para discussões úteis; CGC para as estirpes e NIH para apoiar-nos através de subvenção (R01HD054681).

1) O enriquecimento da população masculina <ol><li> Dependendo da necessidade experimental, um grande número de homens pode ser obtida através do emprego de uma das seguintes estratégias: <ol><li> grande população de machos do tipo selvagem pode ser obtida através do cruzamento 5 machos tipo selvagem e um hermafrodita em um gramado pequeno de OP50 semeado no centro da placa NGM. Cerca de 50% da geração seguinte será do sexo masculino do tipo selvagem. </li><li> ele-5 (e1490) ou ele-8 (e1489) hermafroditas jogar grande número de machos.-lo-5-8 e ele os machos são férteis e não há nenhum defeito óbvio na morfologia espermática e função. Então, ele-5 ou ele-8 do sexo masculino pode ser usado no lugar de homens do tipo selvagem de muitos experimentos. </li></ol></li></ol> 2) Identificação e isolamento dos machos <ol><li> Examinar a morfologia da cauda de vermes; cauda do verme macho é arredondada. </li><li> Escolha L4 machos palco e transferi-los para uma placa NGM semeado com E. coli OP50 e deixá-los crescer para um dia ou dois. Crescente homens celibatários na ausência de hermafroditas evitar a perda de esperma e, assim, grande número de espermátides estaria disponível durante o procedimento experimental. </li><li> No dia da dissecção, a transferência dos machos celibatários em uma placa NGM sem bactérias e deixá-los rastejar por alguns minutos. Este passo ajuda a remover pequena camada de E. coli aderidas na superfície de worms. Alternativamente, pipeta pequeno volume de tampão M9 (6g Na 2 HPO 4, 3g KH 2 PO 4, 5g de NaCl, 0,25 g MgSO 4 .7 H 2 O por litro) em um vidro de relógio e os machos de transferência para a reserva. </li></ol> 3) Dissecção do sexo masculino e na ativação in vitro <ol><li> Dê uma lâmina de vidro e marcar um pequeno círculo com uma caneta pap. Pipeta 30-50 mL de esperma Médio 1X (50 mM HEPES, 25mM KCl, 45mm NaCl, 1mM MgSO 4, CaCl 5mM 2, 10mM Dextrose; pH 7.8) dentro do círculo. O círculo hidrofóbico ajuda a manter a média de esperma dentro de sua fronteira. </li><li> Transferir os machos 50-10 para o meio do esperma. </li><li> Visualizando o slide ao microscópio, segure duas seringas anexado com 27 agulhas em ambas as mãos. </li><li> Use uma agulha para 'hold' do verme e use a outra agulha para cortar a extremidade posterior dos machos para liberar espermátides. </li><li> Corte o worm normalmente expele grande número de espermátides instantaneamente. O espermátides são visíveis como minuto grânulos "sob o microscópio estéreo. No entanto, por vezes, parte ou a maioria das espermátides podem ser retidos dentro da carcaça. Nesse caso, gentilmente 'arrastar' a carcaça sobre a lâmina de vidro podem facilitar a liberação de espermátides da carcaça. </li><li> Para ativar o espermátides, dissecar o worms no Médio Esperma 1X contendo E pronase (20μg/ml) e deixe-os descansar por 5 minutos. </li><li> Não permita que os slides para tornar-se seca em nenhum momento do experimento. Adicionar Médio Esperma mais 1X, se necessário. </li></ol> 4) Visualização de spermtids e espermatozóides <ol><li> Delicadamente, coloque uma lamela na superfície da amostra dissecados. </li><li> Encontrar o campo de espermátides em pequeno aumento (10x) </li><li> Detalhes de espermátides ou espermatozóides podem ser observadas movendo-se para maior ampliação - geralmente em imersão em óleo 100X. </li></ol> 5) Resultados Representante Um exemplo de imagem DIC de espermátides isolado de C. elegans macho é mostrado na Figura 1. Espermátides são esféricas e os núcleos são proeminentes. In vitro de espermatozóides ativados são mostrados na Figura 2. <img src="/files/ftp_upload/2336/2336fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. DIC imagem de C. espermátides elegans. <img src="/files/ftp_upload/2336/2336fig2.jpg" alt="Figura 2"> Figura 2. DIC de imagem in vitro ativada C. elegans espermatozóides.

<ol><li>Kimble, J., Crittenden, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+of+germline+stem+cells%2C+entry+into+meiosis%2C+and+the+Sperm%2FOocyte+decision+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).</li>
<li>Lhernault, S. W., Roberts, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLhernault%2C+SW+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. , Vol. 48 273-301 (1995).</li>
<li>Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondisjunction+Mutants+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 91, 67-94 (1979).</li>
<li>Altun, Z. F., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+male+C.+elegans+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22WormAtlas%22%5BJournal%5D)">Introduction to male C. elegans anatomy.</a> WormAtlas. , ColdSpring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2008).</li>
<li>Shakes, D., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+spermiogenesis+in+C.+elegans%3A+a+pharmacological+and+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis.</a> Dev Biol. 134, 189-200 (1989).</li>
<li>Nelson, G. A., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+fusion%2C+pseudopod+extension+and+amoeboid+motility+are+induced+in+nematode+spermatids+by+the+ionophore+monensin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin.</a> Cell. 19, 457-464 (1980).</li>
<li>L'Hernault, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+and+cell+biology+of+spermatogenesis+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).</li>
<li>Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+spe-38+gene+encodes+a+novel+four-pass+integral+membrane+protein+required+for+sperm+function+at+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization.</a> Development. 132, 2795-2808 (2005).</li>
<li>Xu, X., Sternberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+sperm+TRP+protein+required+for+sperm-egg+interactions+during+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization.</a> Cell. 114, 285-297 (2003).</li>
<li>Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+spermatozoan+locomotion%3A+amoeboid+movement+with+almost+no+actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin.</a> J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).</li>
<li>Machaca, K., DeFelice, L. J., L'Hernault, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+chloride+channel+localizes+to+Caenorhabditis+elegans+spermatids+and+chloride+channel+blockers+induce+spermatid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation.</a> Dev Biol. 176, 1-16 (1996).</li>
<li>LaMunyon, C., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+viability+of+mutant+and+manipulated+sperm+by+artificial+insemination+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 138, 689-692 (1994).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Além de analisar os mutantes Spe, este protocolo tem outras aplicações importantes, tais como analisar a morfologia espermática com o envelhecimento. Espermátides e espermatozóides isolados usando este protocolo pode ser usado em outras experiências, como a jusante, imunocoloração do tipo selvagem e mutante de esperma 8, 9, motilidade do esperma em lâminas de 10, medidas fisiológicas 9, 11, ou até mesmo a inseminação artificial 12.

<table><tbody><tr><td>Seringa tuberculínica</td><td>BD Biosciences</td><td>309623</td><td>Seringa: 1 ml, agulha:&lt;br/&gt;27G X &amp;#189; in</td></tr><tr><td>Caneta Pap</td><td>Zymed Laboratories, Inc.</td><td>00-8888</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas microscópicas VWR VistaVision HistoBond</td><td>VWR international</td><td>16004-406</td><td>Dimensão:&lt;br/&gt;75X25X1mm</td></tr><tr><td>Lâmina de cobertura</td><td>VWR international</td><td>48366045</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6911</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e in vitro a ativação do caenorhabditis elegans sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Machos e hermafroditas são as duas formas encontradas naturalmente sexual na nemátodo C. elegans. Os espermatozóides amebóides são produzidos por machos e hermafroditas. Na fase anterior do gametogênese, as células germinativas dos hermafroditas diferenciar em número limitado de espermatozóides - cerca de 300 - e são armazenados em um &quot;saco&quot; pequena chamada espermateca. Mais tarde, os hermafroditas produzem continuamente oócitos 1. Em contraste, os homens produzem espermatozóides durante toda a sua exclusiva idade adulta. Os machos produzem espermatozóides tanto que representa&gt; 50% do total de células em um 2 adulto típico worm. Portanto, isolar os espermatozóides dos machos é mais fácil do que da de hermafroditas. Apenas uma pequena proporção dos machos são naturalmente gerados devido à espontânea de não-disjunção do cromossomo X 3. Cruzamento com os machos hermafroditas ou mais convenientemente, a introdução de mutações a dar origem a Ele (alta incidência de machos) fenótipo são algumas das estratégias através das quais pode-se enriquecer a população masculina 3. Os machos podem ser facilmente distinguidos dos hermafroditas, observando os 4 morfologia da cauda. Cauda hermafrodita é apontado, ao passo que no sexo masculino é de cauda arredondada com estruturas de acasalamento. Corte a cauda libera grande número de espermátides armazenada dentro do trato reprodutivo masculino. Dissecção é realizada sob um microscópio estéreo com 27 agulhas. Desde espermátides não estão fisicamente conectados com quaisquer outras células, a pressão hidráulica expele o conteúdo interno do corpo masculino, incluindo espermátides 2. Os machos são diretamente dissecado em uma pequena gota de &#39;Medium esperma&#39;. Espermátides são sensíveis a alteração no pH. Assim, HEPES, um composto com boa capacidade de tamponamento é utilizada nos meios de comunicação de esperma. Glicose e outros sais presentes na mídia esperma ajudar a manter a pressão osmótica para manter a integridade dos espermatozóides. Pós-meiótica diferenciação de espermátides em espermatozóides é denominado espermiogênese ou ativação de esperma. Shakes 5, 6 e Nelson anteriormente mostrou que espermátides arredondadas podem ser induzidas a se diferenciarem em espermatozóides pela adição de compostos de ativar diversos, incluindo pronase E. Aqui demonstramos in vitro espermiogênese de C. espermátides elegans utilizando pronase E. Espermiogênese de sucesso é pré-requisito para a fertilidade e, portanto, os mutantes defeituosos em espermiogênese são estéreis. Até então vários mutantes foram mostrados para ser defeituoso, especificamente no processo de espermiogênese 7. Anormalidade encontrada durante a ativação in vitro de romance Spe (Espermatogênese defeituoso) mutantes iria nos ajudar a descobrir jogadores adicionais participar neste evento.

Um protocolo para isolar e ativando espermátides de macho<em&gt; C. elegans</em&gt; É descrito aqui. Cortar a extremidade posterior de espermátides macho libera. O espermátides pode ser ativado por adição de protease.

Isolamento e In vitro A ativação do Caenorhabditis elegans Sperm

Machos e hermafroditas são as duas formas sexuais encontradas naturalmente no nemátodo C. elegans. Os espermatozoides ameboides são produzidos tanto por machos quanto por...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a morfologia dos espermatozoides. Isso é realizado primeiramente isolando os machos para dissecação um dia antes. O segundo passo do procedimento é dissecar os machos para liberar os espermatozoides.O terceiro passo do procedimento é visualizar a morfologia dos espermatozoides. O passo final do procedimento é preparar os espermatozoides para aplicações posteriores. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a morfologia dos espermatozoides e a capacidade de ativação mediante tratamento com ativadores in vitro.O protocolo de isolamento e ativação de espermatozoides foi desenvolvido pela primeira vez há mais de 30 anos por Sam Ward, Diane Shakes e Gregory Nelson. Atualmente, utilizamos este procedimento para caracterizar mutações que alteram a função espermática e a fertilidade em C. elegans. O objetivo geral deste procedimento é visualizar a morfologia de espermatozoides de C. elegans.Isso é realizado isolando os machos um dia antes da dissecação, a fim de mantê-los celibatários. O segundo passo envolve a dissecação dos machos para liberar espermátides redondas não modais. O terceiro passo consiste em visualizar, in v

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Biologia

Vampiric Isolamento de fluido extracelular a partir de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

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