Name: Todo-Cell Gravação de Cálcio O cálcio Release-Ativado (CRAC) Correntes em linfócitos humanos T (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: Aprenda a registrar correntes de cálcio CRAC em linfócitos T humanos usando a técnica de patch clamp de célula inteira. Este método permite medir atividade de canais de cálcio essencial para ativação de células T.

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Somos gratos ao Departamento de Fisiologia e Biologia Molecular, Universidade da Califórnia Davis por nos fornecer instalações e um excelente ambiente para os estudos de canais iônicos.

1. Preparação de repouso Linfócitos T Humanos <ol><li> Usando RosetteSep Humanos Cocktail de Enriquecimento de células T e Medium Density RosetteSep, purificar as células T a partir de amostras de sangue humano de acordo com as instruções do fabricante. A população de células resultante deve conter 95% CD3 + células T em repouso. Purificamos linfócitos T humanos a partir de amostras coletadas do sangue periférico de voluntários saudáveis, em conformidade com o protocolo aprovado pelo Internal UC Davis Board Review. </li><li> Após o isolamento, descansando ressuspender as células T com uma densidade de 0,5 x 10 6 células / mL em meio de cultura de células contendo RPMI-1640 meio com glutamina e HEPES, suplementado com 10% de soro fetal bovino, 2% Glutamax-I, 1% RPMI 1640 vitamina solução, 1% solução de RPMI 1640 aminoácidos, piruvato de sódio a 1%, e 0,03% β-mercaptoetanol. </li><li> Suspensão lugar célula em frascos de cultura de células e manter a 37 ° C em uma incubadora umidificada com 5% de CO 2 para até 24 h antes do experimento. </li></ol> 2. Preparação da Câmara de gravação <ol><li> A seguir são necessários para preparar as câmaras de gravação: a) de silício O-rings, b) redondo, 25 mm lamínulas limpos com álcool 70% e destilada H 2 O, c) mista Sylgard184, preparados de acordo com as instruções do fabricante, e d) dois 60 x 15 mm placas de Petri. </li><li> Coloque ~ 0,5 mL de Sylgard184 misturado em uma placa de Petri 60x15 mm. </li><li> Mergulhe a parte inferior do O-ring para o forceps Sylgard184 usando. </li><li> Retire o excesso de Sylgard184 da borda do anel, colocando-o O-ring em uma superfície limpa, como uma outra placa de Petri. </li><li> Coloque o anel sobre a lamínula e pressione-o para baixo. </li><li> Curar a Sylgard184 pelo aquecimento das câmaras a 85 ° C por 40-60 min ou até que o Sylgard184 é polimerizado. </li><li> Armazenar as câmaras de gravação em um recipiente de pó. </li></ol> 3. Preparação de Pipetas patch <ol><li> No dia do experimento, puxe pipetas com um diâmetro da ponta ~ 2 mícrons usando capilares de vidro e um puxador de pipeta. Usamos tubos de borosilicato com filamento (OD: 1,5 mm e ID: 1.10 mm). Pipetas loja em um local livre de poeira. </li><li> Brasão da pipeta pontas com Sylgard184 ou revestimento Semiconductor Hipec R6101 de proteção, de acordo com um procedimento padrão 9. </li><li> Suavemente-fogo polonês as pipetas antes do experimento. </li></ol> 4. Remendo Preparação Setup Grampo <ol><li> Configurar e salvar as macros para a formação gigaseal no software de controle de seu amplificador de patch-clamp. Nós usamos um amplificador EPC-10 suportados pelo Windows XP e software de pulso para a aquisição de dados. Vamos definir o "set-up", "na célula", e "todo-cell" macros de acordo com o manual de EPC-10 e usá-las para todos os experimentos. </li><li> Preparar soluções de banho e soluções pipeta listadas na Tabela 1 antes do experimento e armazená-los a 4 ° C por até 1 semana. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Produtos químicos </td><td colspan="3"> Soluções de banho (mM) </td><td> Pipeta Solutions (mM) </td></tr><tr><td></td><td> # 1 </td><td> # 2 </td><td> # 3 </td><td></td></tr></tbody><tbody><tr><td> CH 3 SO 3 Na </td><td> 130 </td><td> 110 </td><td> 125 </td><td> - </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> - </td></tr><tr><td> Ca (OH) 2 </td><td> - </td><td> 20 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> HEDTA </td><td> - </td><td></td><td> 10 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> Cs-aspartate </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 125 </td></tr><tr><td> BAPTA </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 12 </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Soluções para toda célula CARC gravações atuais. Todos os produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. <ol start="3"><li> Determinar potenciais de junção líquida (LJ) entre a solução de pipeta patch e cada solução de banho de 10. Salvar o valor LJ no local apropriado utilizar o seu software de aquisição. Por exemplo, no programa Pulso inserir o valor LJ em "LJ" no controle "amplificador" janela. </li><li> Configurar e salvar os protocolos de estimulação, como mostrado na Figura 1, no local apropriado do seu software de aquisição antes dos experimentos. No programa Pulse, vamos definir o protocolo de aquisição na "Geração Pulse" janela. <img src="/files/ftp_upload/2346/2364fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. . Protocolo de estimulação Rampa de tensão de -120 a +100 mV de 50 ms de duração é aplicado a cada 0,2-2 s (5-0,5 Hz). Potencial de exploração (V h) entre rampas é mantida em 30 mV. </li></ol> 5. As células de montagem no Palco Microscópio <ol><li> Revestimento das câmaras de gravação com poli-L-lisina para ~ 20 minutos e lave com H 2 O e depois com solução salina balanceada de Hank (HBSS) antes do plaqueamento das células. </li><li> ML placa de 500 de suspensão de células contendo 0,2-0,5 x10 6 células na câmara e incubar por 20 min a 37 ° C. </li><li> Segura a câmara de gravação com as células anexado em um suporte de câmara. Usamos um suporte de câmara custom-made, onde a base de suporte na parte inferior da lamela, enquanto a parte de cima delicadamente pressiona contra a parte superior da lamínula. </li><li> Coloque o suporte da câmara no palco do microscópio invertido. </li><li> Foco sobre as células em luz transmitida. Nós usamos uma objetiva de imersão 40X de petróleo. </li><li> Coloque o eletrodo de referência Ag / AgCl para o banho. </li><li> Alinhar o multibarrel, sistema de perfusão gravidade-driven. A ponta do tubo de entrada deve ser colocado em um ângulo de 45 ° até o fim lamela para o campo de visão. </li><li> Posicione o tubo de sucção em frente à ponta do tubo de entrada. </li><li> Perfundir a câmara com tampão fosfato (PBS) ou HBSS para lavar os meios de cultura celular e células frouxamente ligados. </li></ol> 6. CRAC Canal Gravação Correntes <ol><li> Encontrar uma célula que está firmemente ligado à lamela. Nós geralmente seleciona uma média de tamanho de célula, redonda com uma superfície lisa exterior. </li><li> Perfundir da câmara gravando com Ca 2 + livre, 3 mM Mg 2 + solução de banho contendo # 1 (Tabela 1) contendo 0,5-1 tapsigargina M para 80-10 min para bloquear a bomba SERCA. Realizamos este passo para empobrecem a loja antes da formação gigaseal. </li><li> Usando um microloader Eppendorf e um P-20 pipeta deslocamento, encher a pipeta patch com a solução da pipeta (Tabela 1) e inserir a pipeta patch para o titular pipeta na headstage amplificador. O Ca 2 + quelante BAPTA está incluído na solução de pipeta para passivamente empobrecem a loja e para reduzir o Ca 2 + dependentes de inativação do canal CRAC. </li><li> Aplique uma pequena quantidade de pressão positiva (~ 3 cm de H 2 O) no interior da pipeta de patch antes de entrar no banho. Nós usamos um dispositivo feito sob medida de pressão de sucção conectado ao ar pressurizado e linhas de vácuo para criar uma pressão positiva ou negativa dentro de uma pipeta patch. </li><li> Inferior da pipeta patch para o banho sob controle visual através do microscópio. No "Osciloscópio" janela, você deve ver uma corrente que flui através da pipeta. A mudança de patamar-como na amplitude da corrente deve ser induzido por um pulso de pequena amplitude da tensão (teste de pulso), aplicadas pela macro predefinida. Neste momento, você deve ser capaz de determinar o valor da resistência da pipeta. A resistência de nosso pipetas é tipicamente 5-6 mohms. </li><li> Corrigir o "offset" potencial gerado entre a pipeta eo eletrodo de referência. </li><li> Sob controle visual através do microscópio, traga a ponta da pipeta mais próximo da célula até tocar a membrana celular. </li><li> Aplicar pressão negativa (20-40 polegadas de H 2 O) no interior da pipeta patch. </li><li> Monitorar a formação gigaseal no "osciloscópio" janela. Você vai ver a amplitude da corrente, induzido pelo pulso de teste, diminui e aumenta o valor da resistência pipeta&gt; 5 GÊ. Formas normalmente gigaseal dentro de um fesegundo w, mas pode demorar 1-2 minutos para conseguir um gigaseal estável. </li><li> Compensar a capacitância pipeta ("C-Fast"). </li><li> Ruptura da membrana correção através da aplicação de pressão negativa adicional, usando uma seringa de 20 cc. </li><li> Definir o potencial de exploração para 30 mV. Um potencial de detenção positivo ajuda a prevenir cálcio-dependente inativação do canal CRAC. </li><li> Compensar a capacitância da membrana da célula ("C-slow"); salvar ou gravar o valor de C-lenta. </li><li> Verificar o valor da resistência de acesso "R s". Em nossos experimentos, o s R é tipicamente 70-20 mohms. </li><li> Começar a aplicar uma série de rampas de tensão com uma freqüência de 0,5 Hz (Figura 1) em Ca 2 + livre mM 3 Mg 2 + solução de banho contendo o 1 º. Nesta solução, atual CRAC é pequeno em comparação com o "vazamento" de corrente devido à pouca permeabilidade dos canais CRAC para Mg 2 +. Salvar e usar os traços atuais gravadas em solução de banho # 1 em análises futuras como "vazamento" das correntes. A amplitude absoluta do "vazamento" corrente a -100 mV deve ser menor ou igual a 5 pA. Se a célula é "furado", interromper a experiência e começar de novo com uma pipeta de novo adesivo e uma nova célula. </li><li> Para gravar Ca 2 + através de canais atuais CRAC (I Ca-CRAC), substituir Ca 2 + livre 3 mM Mg 2 + solução de banho contendo # 1 com 20 mM Ca 2 + contendo solução de banho # 2 (Tabela 1), alternando as válvulas de perfusão. Isto permite Ca 2 + a fluir através de canais de CRAC e produzir uma corrente dentro. No "Osciloscópio" janela, você verá o desenvolvimento de retificar interiormente eu Ca-CRAC (Figura 2). A amplitude da corrente com tensões negativas continuará a aumentar para cerca de 1 min, devido ao Ca 2 + dependentes de potenciação da corrente CRAC. </li><li> Aumentar a freqüência de estimulação com rampas de tensão para 5 Hz, que é necessário para gravar o Na + transitória atuais através de canais CRAC. </li><li> Substituir os 20 mM Ca 2 + contendo solução de banho # 2 com Na +-ção contendo solução livre de bivalentes # 3 (Tabela 1), alternando as válvulas de perfusão. No "Osciloscópio" janela, você verá um desenvolvimento transitório de maior amplitude dentro retificar Na + atual através dos canais CRAC (I Na-CRAC; Figura 2). </li><li> Pode-se aplicar 20 mM Ca 2 + contendo solução de banho # 2 contendo 1-5 mM La 3 +, no final do experimento para gravar o "vazamento" atual. No entanto, não encontramos essa abordagem útil porque o "vazamento" mudanças em curso ao longo do tempo e pode se tornar maior ou menor no final do experimento. Nós preferimos tomar a atual registrado no Ca 2 + livre mM 3 Mg 2 + contendo solução de banho de # 1 no início do experimento como uma "fuga" atual. </li><li> Guardar os vestígios gravados atual para posterior análise. </li></ol> 7. Análise de Dados <ol><li> Recuperar os registros salvos atual em software de análise. Usamos o programa de pulso para análise. </li><li> Medir a amplitude atual no início e no final das rampas de tensão. Normalmente, medir a amplitude atual em -100 mV e em 100 mV usando pares de cursores no "Osciloscópio" janela do programa Pulse. </li><li> Exportar os valores de amplitudes atual em um programa gráfico para posterior análise e apresentação gráfica. Usamos Graphing Origem Científica e Software Análise, versão 7. </li></ol> 8. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2346/2346fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Correntes CRAC em uma célula T humano descansando. (A), o curso Tempo de correntes CRAC registrados em todo o celular de configuração de voltagem clamp-a -100 mV (círculos cheios) e 100 mV (círculos abertos). Antes da formação gigaseal, a célula foi pré-incubado por ~ 10 min em Ca 2 + livre mM 3 Mg 2 + contendo solução de banho # 1 contendo 0,5 mM tapsigargina. Após invasão, soluções de banho foram seqüencialmente aplicados da seguinte forma: Ca 2 + livre 3 mM Mg 2 + contendo solução de banho # 1 (0 Ca + Mg 3), seguido por 20 mM Ca 2 + solução de banho contendo # 2 (20 Ca), seguido por divalente-cação solução livre de banho # 3 (DVF), seguido pela solução de banho # 2 (20 Ca). A célula foi estimulado com uma série de rampas de tensão, como mostrado na Figura 1. A freqüência de rampas foi de 5 Hz em solução de banho # 3 (DVF) e 0,5 Hz em todas as outras soluções. Observe o lento desenvolvimento de I Ca-CRAC após a aplicação de 20 mM Ca 2 + contendo solução de banho # 2 eo rápido desenvolvimento transitória da I Na-CRAC na DVF solução de banho # 3. (B), Representante traços corrente registou durante rampas de tensão em Ca 2 + livre 3 mM Mg 2 + solução de banho contendo # 1 ("Vazamento"), 20 mM Ca 2 + contendo solução de banho # 2 (20 Ca), e uma solução de banho # 3 (DVF). (C, D), atual tensão relações de I Ca-CRAC (C) e eu Na-CRAC (D) obtida subtraindo-se "vazar" atual das correntes registradas durante tensão rampas em 20 mM Ca 2 + contendo banho solução # 2 (20 Ca), e uma solução de banho # 3 (DVF) mostrado no painel (B).

<ol><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRAC+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">CRAC channelopathies.</a> Pflugers Arch. , (2010).</li>
<li>Lewis, R. S., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2%2B+and+transmembrane+Ca2%2B+current+in+human+leukemic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current+%28ICRAC%29+due+to+local+calcium+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback.</a> J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+calcium-dependent+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current.+Store-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms.</a> J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+potentiation+of+store-operated+calcium+channels+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).</li>
<li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+characterization+of+currents+through+store-operated+CRAC+channels+and+Mg2%2B-inhibited+cation+%28MIC%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels.</a> J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).</li>
<li>Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+channel+properties+and+regulated+expression+of+Ca%282%2B%29+release-activated+Ca%282%2B%29+%28CRAC%29+channels+in+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells.</a> J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A investigação eletrofisiológicos de correntes CRAC em repouso células T humanas é uma tarefa desafiadora, porque a amplitude CRAC de corrente endógena dessas células é pequeno devido ao tamanho de pequenas células (o diâmetro de células T humanas em repouso está na faixa de 5-8 mm). Aqui, apresentamos um procedimento passo-a-passo para registro confiável correntes CRAC em repouso linfócitos T humanas isoladas a partir de células mononucleares do sangue periférico. Esta tecnologia permite-nos investigar a fisiologia e e...

<table><tbody><tr><td>Coquetel de Enriquecimento de Células T Humanas RosetteSep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Densidade RosetteSep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15705</td><td></td></tr><tr><td>Meio RPMI 1640 com glutamina/HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Bezerro Fetal</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (solução 100X)</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Solução de vitaminas RPMI 1640 (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7256</td><td></td></tr><tr><td>Solução de aminoácidos 1640 (50X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapt&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Trifosfato de inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19766</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina Hidrobrometo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de lantânio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>262072</td><td></td></tr><tr><td>Tapsigargina</td><td>Calbiochem</td><td>586005</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Elastômero de Silício Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Revestimento Protetor para Semicondutores HIPEC R6101</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mesa de Laboratório de Isolamento de Vibração de Alta Performance Série 63-500</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td>63-540</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de clamp de patch EPC 10 com estágio de cabeçote</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido Olympus 1X71 com objetiva de imersão em óleo 40x</td><td>Olympus Corporation</td><td>1X71</td><td></td></tr><tr><td>Computador com Windows</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Pulse</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de Gráficos e Análise Científica Origin</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puxador de pipetas para patch</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Vidro borossilicatado com filamento (diâmetro externo: 1,5 mm e diâmetro interno: 1,10 mm)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Microforja Narashige&amp;rsquo;s</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Anéis O de silicone</td><td>McMaster-Carr</td><td>111 S70</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura de 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25 mm 25CIR.-1</td><td></td></tr></tbody></table>

todo-cell gravação de cálcio o cálcio release-ativado (crac) correntes em linfócitos humanos t

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

Em linfócitos T, a depleção de Ca 2 + intracelular do Ca 2 + loja leva a ativação de plasmalemmal Ca 2 + canais, chamados de cálcio Release-Activated cálcio (CRAC) canais. CRAC canais desempenham um papel importante na regulação da proliferação de células T e expressão gênica. Função de canal de anormal CRAC nas células T tem sido associada a doenças de imunodeficiência combinada severa e auto-imunes 1, 2. Estudar a função de canal CRAC em células humanas T pode descobrir novos mecanismos moleculares que regulam as respostas imunes normais e desvendar as causas de doenças relacionadas com o humano. Gravações eletrofisiológicas das correntes de membrana uma avaliação mais precisa das propriedades do canal funcional e sua regulamentação. Avaliação eletrofisiológica das correntes CRAC canal em células Jurkat T, um ser humano da leucemia de células T de linha, foi realizado mais de 20 anos atrás 3, no entanto, as medições atuais CRAC em condições normais de células T humanas permanece uma tarefa desafiadora. As dificuldades na gravação correntes canal CRAC em células T normais são agravados pelo fato de que os linfócitos T derivados do sangue são muito menores em tamanho do que as células T Jurkat e, portanto, o endógeno correntes de célula inteira CRAC são muito baixos em amplitude. Aqui, damos um procedimento passo-a-passo que usam rotineiramente para gravar o Ca 2 + ou Na + correntes através de canais CRAC em repouso células T humanas isoladas do sangue periférico de voluntários saudáveis. O método descrito aqui foi adotado a partir dos procedimentos utilizados para a gravação das correntes CRAC em células Jurkat T e ativação de células T humanas 4-8.

Nós fornecemos um protocolo passo a passo para a gravação de célula inteira patch clamp de Cálcio O cálcio Release-Ativado (CRAC) correntes em sangue periférico mononuclear de células derivadas de linfócitos T humanos.

Todo-Cell Gravação de Cálcio O cálcio Release-Ativado (CRAC) Correntes em linfócitos humanos T

Nos linfócitos T, a depleção de Ca2+ do estoque intracelular de Ca2+ leva à ativação de canais de Ca2+ plasmalemais, chamados Canais de Liberação de Cálcio Ativados...

Os canais de cálcio ativados pela liberação de cálcio, ou canais CRAC, localizados na membrana plasmática, desempenham um papel importante na proliferação de linfócitos T e na estimulação da expressão gênica dos receptores de linfócitos T. A ativação dos receptores de linfócitos T por um antígeno resulta na formação do segundo mensageiro trifosfato de adenosina e na ativação da liberação de cálcio do reservatório por meio dos receptores de trifosfato de inositol 1,4,5-trifosfato. A redução na concentração de cálcio dentro do reservatório leva à ativação dos canais CRAC e ao consequente aumento da concentração de cálcio no citosol. Anormalidades na função dos canais CRAC em linfócitos T estão associadas a diversas doenças humanas, incluindo distúrbios de imunodeficiência combinada grave e doenças autoimunes.Aqui é apresentado um método que permite o registro confiável e reprodutível de correntes endógenas de cálcio e sódio por canais de crack em linfócitos T humanos. Primeiro, aplica-se o FSA garin, um bloqueador da ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático, em uma solução extracelular livre de cálcio e contendo três milimolares de magnésio para esgotar o reservató

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Biology

Biologia

A compartimentação de proteínas, quer no interior da membrana plasmática ou em localizações intracelulares é um mecanismo de regulação que pode influenciar grandemente os resultados de sinalização, daí, para compreender a sinalização é importante para estudar o comportamento espacial e temporal das proteínas envolvidas. Descrevemos aqui um sistema de microscopia TIRF base para estudar a transdução de sinal em células T, mas é amplamente aplicável.

A técnica de microscopia TIRF para imagens em tempo real, simultâneo da TCR e seus associados proteínas sinalizadoras

Este vídeo analisa o influxo de cálcio induzido por receptor de células T em células T. Os anticorpos anti-CD3 ativam as vias de sinalização das células T, levando a um aumento nos íons de cálcio intracelulares que se ligam ao corante Indo-1. Na citometria de fluxo, uma mudança de espectro do estado livre de cálcio para o estado ligado ao cálcio se correlaciona com o influxo de cálcio induzido pelo receptor de células T.

Avaliação do influxo de cálcio induzido por receptor de células T usando um corante indicador de cálcio

Descrevemos o isolamento de miócitos atriais humanos, que podem ser utilizados para a intracelular de...

Isolamento de miócitos atriais humanos para Medições Simultâneas de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitórios e correntes de membrana

Os procedimentos são descritos para realizar registros simultâneos do potencial ou corrente de membrana e alterações da concentração de cálcio intracelular. Os neurônios do núcleo supraquiasmático são preenchidos com o indicador de cálcio bis-fura-2 usando um eletrodo de patch clamp na configuração de patch clamp de célula inteira.

Registro eletrofisiológico simultâneo e imagem de cálcio de neurônios do núcleo supraquiasmático

Registrar correntes de Ca2+ na membrana facial de liberação pré-sináptica é a chave para uma compreensão precisa da entrada de Ca2+ e da liberação de neurotransmissores. Apresentamos uma dissociação aguda da medula espinhal da lampreia que produz axônios reticuloespinhais isolados funcionais, permitindo o registro diretamente da membrana facial de liberação de terminais pré-sinápticos individuais.

Aguda dissociação de lampreia reticulospinais axônios para permitir a gravação do lançamento Rosto Membrana de terminais pré-sinápticos funcionais individuais

Aqui apresentamos técnicas para imagens de eventos locais de Ca2+ mediados por IP3 usando microscopia de fluorescência em células intactas de mamíferos carregadas com indicadores de Ca2+, juntamente com um algoritmo que automatiza a identificação e análise desses eventos.

Imagem local Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sinais em células de mamíferos em cultura

Modelos murinos permitem estudar os principais mecanismos da arritmogênese. Para isso, cardiomiócitos de alta qualidade são necessários para a realização de medidas de patch-clamp. Aqui, é descrito um método para isolar miócitos murinos atriais e ventriculares via perfusão retrógrada de Langendorff baseada em enzimas, que permite medidas simultâneas de transientes de cálcio e corrente de cálcio tipo L.

Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L

Aqui são descritos métodos usados para estudar o efeito funcional das mutações RYR1 expressas endógenamente no Vírus Epstein Barr, linfócitos B humanos e células de satélite derivadas da biópsia muscular diferenciadas em miótubos.

Caracterização funcional de variantes ryr1 humanas expressas e endógenas

O influxo de cálcio, uma medida da sinalização de células T, é uma maneira eficaz de analisar as respostas à estimulação de receptores de células T. Este protocolo para multiplexação de Indo-1 com painéis de anticorpos direcionados a moléculas de superfície celular aproveita as capacidades altamente flexíveis da citometria de fluxo de espectro completo.

Análise do Influxo de Cálcio Induzido por Receptores de Células T em Células T Primárias Murinas por Citometria de Fluxo de Espectro Completo

Aqui, fornecemos um protocolo abrangente para resolver sinais locais iniciais de Ca2+ , conhecidos como microdomínios de Ca2+ , em células T murinas e humanas primárias usando microscopia de fluorescência. Este protocolo serve como um recurso valioso para pesquisadores que examinam as vias de sinalização de Ca2+ dentro das células imunes e para desvendar ainda mais sua função.

Imagem de microdomínios iniciais de Ca2+ em células T primárias

Este artigo apresenta um método para monitoramento quantitativo em tempo real das concentrações de íons cálcio (Ca2+) em células usando imagens de Ca2+ de célula única com o corante Fura-2/AM. Essa técnica permite o carregamento eficiente de corantes e o cálculo preciso dos níveis de Ca2+ por meio de taxas de intensidade de fluorescência, tornando-a uma abordagem simples e rápida para aplicações de pesquisa.

Imagem de cálcio de célula única para estudar a ativação de canais de íons de cálcio

Aprenda a registrar correntes de cálcio CRAC em linfócitos T humanos usando a técnica de patch clamp de célula inteira. Este método permite medir atividade de canais de cálcio essencial para ativação de células T.

Todo-Cell Gravação de Cálcio O cálcio Release-Ativado (CRAC) Correntes em linfócitos humanos T

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