Name: Todo-Cell Gravação de Cálcio O cálcio Release-Ativado (CRAC) Correntes em linfócitos humanos T (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: Aprenda a registrar correntes de cálcio CRAC em linfócitos T humanos usando a técnica de patch clamp de célula inteira. Este método permite medir atividade de canais de cálcio essencial para ativação de células T.

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Somos gratos ao Departamento de Fisiologia e Biologia Molecular, Universidade da Califórnia Davis por nos fornecer instalações e um excelente ambiente para os estudos de canais iônicos.

1. Preparação de repouso Linfócitos T Humanos <ol><li> Usando RosetteSep Humanos Cocktail de Enriquecimento de células T e Medium Density RosetteSep, purificar as células T a partir de amostras de sangue humano de acordo com as instruções do fabricante. A população de células resultante deve conter 95% CD3 + células T em repouso. Purificamos linfócitos T humanos a partir de amostras coletadas do sangue periférico de voluntários saudáveis, em conformidade com o protocolo aprovado pelo Internal UC Davis Board Review. </li><li> Após o isolamento, descansando ressuspender as células T com uma densidade de 0,5 x 10 6 células / mL em meio de cultura de células contendo RPMI-1640 meio com glutamina e HEPES, suplementado com 10% de soro fetal bovino, 2% Glutamax-I, 1% RPMI 1640 vitamina solução, 1% solução de RPMI 1640 aminoácidos, piruvato de sódio a 1%, e 0,03% β-mercaptoetanol. </li><li> Suspensão lugar célula em frascos de cultura de células e manter a 37 ° C em uma incubadora umidificada com 5% de CO 2 para até 24 h antes do experimento. </li></ol> 2. Preparação da Câmara de gravação <ol><li> A seguir são necessários para preparar as câmaras de gravação: a) de silício O-rings, b) redondo, 25 mm lamínulas limpos com álcool 70% e destilada H 2 O, c) mista Sylgard184, preparados de acordo com as instruções do fabricante, e d) dois 60 x 15 mm placas de Petri. </li><li> Coloque ~ 0,5 mL de Sylgard184 misturado em uma placa de Petri 60x15 mm. </li><li> Mergulhe a parte inferior do O-ring para o forceps Sylgard184 usando. </li><li> Retire o excesso de Sylgard184 da borda do anel, colocando-o O-ring em uma superfície limpa, como uma outra placa de Petri. </li><li> Coloque o anel sobre a lamínula e pressione-o para baixo. </li><li> Curar a Sylgard184 pelo aquecimento das câmaras a 85 ° C por 40-60 min ou até que o Sylgard184 é polimerizado. </li><li> Armazenar as câmaras de gravação em um recipiente de pó. </li></ol> 3. Preparação de Pipetas patch <ol><li> No dia do experimento, puxe pipetas com um diâmetro da ponta ~ 2 mícrons usando capilares de vidro e um puxador de pipeta. Usamos tubos de borosilicato com filamento (OD: 1,5 mm e ID: 1.10 mm). Pipetas loja em um local livre de poeira. </li><li> Brasão da pipeta pontas com Sylgard184 ou revestimento Semiconductor Hipec R6101 de proteção, de acordo com um procedimento padrão 9. </li><li> Suavemente-fogo polonês as pipetas antes do experimento. </li></ol> 4. Remendo Preparação Setup Grampo <ol><li> Configurar e salvar as macros para a formação gigaseal no software de controle de seu amplificador de patch-clamp. Nós usamos um amplificador EPC-10 suportados pelo Windows XP e software de pulso para a aquisição de dados. Vamos definir o "set-up", "na célula", e "todo-cell" macros de acordo com o manual de EPC-10 e usá-las para todos os experimentos. </li><li> Preparar soluções de banho e soluções pipeta listadas na Tabela 1 antes do experimento e armazená-los a 4 ° C por até 1 semana. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Produtos químicos </td><td colspan="3"> Soluções de banho (mM) </td><td> Pipeta Solutions (mM) </td></tr><tr><td></td><td> # 1 </td><td> # 2 </td><td> # 3 </td><td></td></tr></tbody><tbody><tr><td> CH 3 SO 3 Na </td><td> 130 </td><td> 110 </td><td> 125 </td><td> - </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> - </td></tr><tr><td> Ca (OH) 2 </td><td> - </td><td> 20 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> HEDTA </td><td> - </td><td></td><td> 10 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> Cs-aspartate </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 125 </td></tr><tr><td> BAPTA </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 12 </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Soluções para toda célula CARC gravações atuais. Todos os produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. <ol start="3"><li> Determinar potenciais de junção líquida (LJ) entre a solução de pipeta patch e cada solução de banho de 10. Salvar o valor LJ no local apropriado utilizar o seu software de aquisição. Por exemplo, no programa Pulso inserir o valor LJ em "LJ" no controle "amplificador" janela. </li><li> Configurar e salvar os protocolos de estimulação, como mostrado na Figura 1, no local apropriado do seu software de aquisição antes dos experimentos. No programa Pulse, vamos definir o protocolo de aquisição na "Geração Pulse" janela. <img src="/files/ftp_upload/2346/2364fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. . Protocolo de estimulação Rampa de tensão de -120 a +100 mV de 50 ms de duração é aplicado a cada 0,2-2 s (5-0,5 Hz). Potencial de exploração (V h) entre rampas é mantida em 30 mV. </li></ol> 5. As células de montagem no Palco Microscópio <ol><li> Revestimento das câmaras de gravação com poli-L-lisina para ~ 20 minutos e lave com H 2 O e depois com solução salina balanceada de Hank (HBSS) antes do plaqueamento das células. </li><li> ML placa de 500 de suspensão de células contendo 0,2-0,5 x10 6 células na câmara e incubar por 20 min a 37 ° C. </li><li> Segura a câmara de gravação com as células anexado em um suporte de câmara. Usamos um suporte de câmara custom-made, onde a base de suporte na parte inferior da lamela, enquanto a parte de cima delicadamente pressiona contra a parte superior da lamínula. </li><li> Coloque o suporte da câmara no palco do microscópio invertido. </li><li> Foco sobre as células em luz transmitida. Nós usamos uma objetiva de imersão 40X de petróleo. </li><li> Coloque o eletrodo de referência Ag / AgCl para o banho. </li><li> Alinhar o multibarrel, sistema de perfusão gravidade-driven. A ponta do tubo de entrada deve ser colocado em um ângulo de 45 ° até o fim lamela para o campo de visão. </li><li> Posicione o tubo de sucção em frente à ponta do tubo de entrada. </li><li> Perfundir a câmara com tampão fosfato (PBS) ou HBSS para lavar os meios de cultura celular e células frouxamente ligados. </li></ol> 6. CRAC Canal Gravação Correntes <ol><li> Encontrar uma célula que está firmemente ligado à lamela. Nós geralmente seleciona uma média de tamanho de célula, redonda com uma superfície lisa exterior. </li><li> Perfundir da câmara gravando com Ca 2 + livre, 3 mM Mg 2 + solução de banho contendo # 1 (Tabela 1) contendo 0,5-1 tapsigargina M para 80-10 min para bloquear a bomba SERCA. Realizamos este passo para empobrecem a loja antes da formação gigaseal. </li><li> Usando um microloader Eppendorf e um P-20 pipeta deslocamento, encher a pipeta patch com a solução da pipeta (Tabela 1) e inserir a pipeta patch para o titular pipeta na headstage amplificador. O Ca 2 + quelante BAPTA está incluído na solução de pipeta para passivamente empobrecem a loja e para reduzir o Ca 2 + dependentes de inativação do canal CRAC. </li><li> Aplique uma pequena quantidade de pressão positiva (~ 3 cm de H 2 O) no interior da pipeta de patch antes de entrar no banho. Nós usamos um dispositivo feito sob medida de pressão de sucção conectado ao ar pressurizado e linhas de vácuo para criar uma pressão positiva ou negativa dentro de uma pipeta patch. </li><li> Inferior da pipeta patch para o banho sob controle visual através do microscópio. No "Osciloscópio" janela, você deve ver uma corrente que flui através da pipeta. A mudança de patamar-como na amplitude da corrente deve ser induzido por um pulso de pequena amplitude da tensão (teste de pulso), aplicadas pela macro predefinida. Neste momento, você deve ser capaz de determinar o valor da resistência da pipeta. A resistência de nosso pipetas é tipicamente 5-6 mohms. </li><li> Corrigir o "offset" potencial gerado entre a pipeta eo eletrodo de referência. </li><li> Sob controle visual através do microscópio, traga a ponta da pipeta mais próximo da célula até tocar a membrana celular. </li><li> Aplicar pressão negativa (20-40 polegadas de H 2 O) no interior da pipeta patch. </li><li> Monitorar a formação gigaseal no "osciloscópio" janela. Você vai ver a amplitude da corrente, induzido pelo pulso de teste, diminui e aumenta o valor da resistência pipeta&gt; 5 GÊ. Formas normalmente gigaseal dentro de um fesegundo w, mas pode demorar 1-2 minutos para conseguir um gigaseal estável. </li><li> Compensar a capacitância pipeta ("C-Fast"). </li><li> Ruptura da membrana correção através da aplicação de pressão negativa adicional, usando uma seringa de 20 cc. </li><li> Definir o potencial de exploração para 30 mV. Um potencial de detenção positivo ajuda a prevenir cálcio-dependente inativação do canal CRAC. </li><li> Compensar a capacitância da membrana da célula ("C-slow"); salvar ou gravar o valor de C-lenta. </li><li> Verificar o valor da resistência de acesso "R s". Em nossos experimentos, o s R é tipicamente 70-20 mohms. </li><li> Começar a aplicar uma série de rampas de tensão com uma freqüência de 0,5 Hz (Figura 1) em Ca 2 + livre mM 3 Mg 2 + solução de banho contendo o 1 º. Nesta solução, atual CRAC é pequeno em comparação com o "vazamento" de corrente devido à pouca permeabilidade dos canais CRAC para Mg 2 +. Salvar e usar os traços atuais gravadas em solução de banho # 1 em análises futuras como "vazamento" das correntes. A amplitude absoluta do "vazamento" corrente a -100 mV deve ser menor ou igual a 5 pA. Se a célula é "furado", interromper a experiência e começar de novo com uma pipeta de novo adesivo e uma nova célula. </li><li> Para gravar Ca 2 + através de canais atuais CRAC (I Ca-CRAC), substituir Ca 2 + livre 3 mM Mg 2 + solução de banho contendo # 1 com 20 mM Ca 2 + contendo solução de banho # 2 (Tabela 1), alternando as válvulas de perfusão. Isto permite Ca 2 + a fluir através de canais de CRAC e produzir uma corrente dentro. No "Osciloscópio" janela, você verá o desenvolvimento de retificar interiormente eu Ca-CRAC (Figura 2). A amplitude da corrente com tensões negativas continuará a aumentar para cerca de 1 min, devido ao Ca 2 + dependentes de potenciação da corrente CRAC. </li><li> Aumentar a freqüência de estimulação com rampas de tensão para 5 Hz, que é necessário para gravar o Na + transitória atuais através de canais CRAC. </li><li> Substituir os 20 mM Ca 2 + contendo solução de banho # 2 com Na +-ção contendo solução livre de bivalentes # 3 (Tabela 1), alternando as válvulas de perfusão. No "Osciloscópio" janela, você verá um desenvolvimento transitório de maior amplitude dentro retificar Na + atual através dos canais CRAC (I Na-CRAC; Figura 2). </li><li> Pode-se aplicar 20 mM Ca 2 + contendo solução de banho # 2 contendo 1-5 mM La 3 +, no final do experimento para gravar o "vazamento" atual. No entanto, não encontramos essa abordagem útil porque o "vazamento" mudanças em curso ao longo do tempo e pode se tornar maior ou menor no final do experimento. Nós preferimos tomar a atual registrado no Ca 2 + livre mM 3 Mg 2 + contendo solução de banho de # 1 no início do experimento como uma "fuga" atual. </li><li> Guardar os vestígios gravados atual para posterior análise. </li></ol> 7. Análise de Dados <ol><li> Recuperar os registros salvos atual em software de análise. Usamos o programa de pulso para análise. </li><li> Medir a amplitude atual no início e no final das rampas de tensão. Normalmente, medir a amplitude atual em -100 mV e em 100 mV usando pares de cursores no "Osciloscópio" janela do programa Pulse. </li><li> Exportar os valores de amplitudes atual em um programa gráfico para posterior análise e apresentação gráfica. Usamos Graphing Origem Científica e Software Análise, versão 7. </li></ol> 8. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2346/2346fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Correntes CRAC em uma célula T humano descansando. (A), o curso Tempo de correntes CRAC registrados em todo o celular de configuração de voltagem clamp-a -100 mV (círculos cheios) e 100 mV (círculos abertos). Antes da formação gigaseal, a célula foi pré-incubado por ~ 10 min em Ca 2 + livre mM 3 Mg 2 + contendo solução de banho # 1 contendo 0,5 mM tapsigargina. Após invasão, soluções de banho foram seqüencialmente aplicados da seguinte forma: Ca 2 + livre 3 mM Mg 2 + contendo solução de banho # 1 (0 Ca + Mg 3), seguido por 20 mM Ca 2 + solução de banho contendo # 2 (20 Ca), seguido por divalente-cação solução livre de banho # 3 (DVF), seguido pela solução de banho # 2 (20 Ca). A célula foi estimulado com uma série de rampas de tensão, como mostrado na Figura 1. A freqüência de rampas foi de 5 Hz em solução de banho # 3 (DVF) e 0,5 Hz em todas as outras soluções. Observe o lento desenvolvimento de I Ca-CRAC após a aplicação de 20 mM Ca 2 + contendo solução de banho # 2 eo rápido desenvolvimento transitória da I Na-CRAC na DVF solução de banho # 3. (B), Representante traços corrente registou durante rampas de tensão em Ca 2 + livre 3 mM Mg 2 + solução de banho contendo # 1 ("Vazamento"), 20 mM Ca 2 + contendo solução de banho # 2 (20 Ca), e uma solução de banho # 3 (DVF). (C, D), atual tensão relações de I Ca-CRAC (C) e eu Na-CRAC (D) obtida subtraindo-se "vazar" atual das correntes registradas durante tensão rampas em 20 mM Ca 2 + contendo banho solução # 2 (20 Ca), e uma solução de banho # 3 (DVF) mostrado no painel (B).

<ol><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRAC+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">CRAC channelopathies.</a> Pflugers Arch. , (2010).</li>
<li>Lewis, R. S., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2%2B+and+transmembrane+Ca2%2B+current+in+human+leukemic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current+%28ICRAC%29+due+to+local+calcium+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback.</a> J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+calcium-dependent+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current.+Store-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms.</a> J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+potentiation+of+store-operated+calcium+channels+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).</li>
<li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+characterization+of+currents+through+store-operated+CRAC+channels+and+Mg2%2B-inhibited+cation+%28MIC%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels.</a> J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).</li>
<li>Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+channel+properties+and+regulated+expression+of+Ca%282%2B%29+release-activated+Ca%282%2B%29+%28CRAC%29+channels+in+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells.</a> J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A investigação eletrofisiológicos de correntes CRAC em repouso células T humanas é uma tarefa desafiadora, porque a amplitude CRAC de corrente endógena dessas células é pequeno devido ao tamanho de pequenas células (o diâmetro de células T humanas em repouso está na faixa de 5-8 mm). Aqui, apresentamos um procedimento passo-a-passo para registro confiável correntes CRAC em repouso linfócitos T humanas isoladas a partir de células mononucleares do sangue periférico. Esta tecnologia permite-nos investigar a fisiologia e e...

<table><tbody><tr><td>Coquetel de Enriquecimento de Células T Humanas RosetteSep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Densidade RosetteSep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15705</td><td></td></tr><tr><td>Meio RPMI 1640 com glutamina/HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Bezerro Fetal</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (solução 100X)</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Solução de vitaminas RPMI 1640 (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7256</td><td></td></tr><tr><td>Solução de aminoácidos 1640 (50X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapt&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Trifosfato de inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19766</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina Hidrobrometo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de lantânio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>262072</td><td></td></tr><tr><td>Tapsigargina</td><td>Calbiochem</td><td>586005</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Elastômero de Silício Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Revestimento Protetor para Semicondutores HIPEC R6101</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mesa de Laboratório de Isolamento de Vibração de Alta Performance Série 63-500</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td>63-540</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de clamp de patch EPC 10 com estágio de cabeçote</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido Olympus 1X71 com objetiva de imersão em óleo 40x</td><td>Olympus Corporation</td><td>1X71</td><td></td></tr><tr><td>Computador com Windows</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Pulse</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de Gráficos e Análise Científica Origin</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puxador de pipetas para patch</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Vidro borossilicatado com filamento (diâmetro externo: 1,5 mm e diâmetro interno: 1,10 mm)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Microforja Narashige&amp;rsquo;s</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Anéis O de silicone</td><td>McMaster-Carr</td><td>111 S70</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura de 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25 mm 25CIR.-1</td><td></td></tr></tbody></table>

todo-cell gravação de cálcio o cálcio release-ativado (crac) correntes em linfócitos humanos t

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

Em linfócitos T, a depleção de Ca 2 + intracelular do Ca 2 + loja leva a ativação de plasmalemmal Ca 2 + canais, chamados de cálcio Release-Activated cálcio (CRAC) canais. CRAC canais desempenham um papel importante na regulação da proliferação de células T e expressão gênica. Função de canal de anormal CRAC nas células T tem sido associada a doenças de imunodeficiência combinada severa e auto-imunes 1, 2. Estudar a função de canal CRAC em células humanas T pode descobrir novos mecanismos moleculares que regulam as respostas imunes normais e desvendar as causas de doenças relacionadas com o humano. Gravações eletrofisiológicas das correntes de membrana uma avaliação mais precisa das propriedades do canal funcional e sua regulamentação. Avaliação eletrofisiológica das correntes CRAC canal em células Jurkat T, um ser humano da leucemia de células T de linha, foi realizado mais de 20 anos atrás 3, no entanto, as medições atuais CRAC em condições normais de células T humanas permanece uma tarefa desafiadora. As dificuldades na gravação correntes canal CRAC em células T normais são agravados pelo fato de que os linfócitos T derivados do sangue são muito menores em tamanho do que as células T Jurkat e, portanto, o endógeno correntes de célula inteira CRAC são muito baixos em amplitude. Aqui, damos um procedimento passo-a-passo que usam rotineiramente para gravar o Ca 2 + ou Na + correntes através de canais CRAC em repouso células T humanas isoladas do sangue periférico de voluntários saudáveis. O método descrito aqui foi adotado a partir dos procedimentos utilizados para a gravação das correntes CRAC em células Jurkat T e ativação de células T humanas 4-8.

Nós fornecemos um protocolo passo a passo para a gravação de célula inteira patch clamp de Cálcio O cálcio Release-Ativado (CRAC) correntes em sangue periférico mononuclear de células derivadas de linfócitos T humanos.

Todo-Cell Gravação de Cálcio O cálcio Release-Ativado (CRAC) Correntes em linfócitos humanos T

Nos linfócitos T, a depleção de Ca2+ do estoque intracelular de Ca2+ leva à ativação de canais de Ca2+ plasmalemais, chamados Canais de Liberação de Cálcio Ativados...

Os canais de cálcio ativados pela liberação de cálcio, ou canais CRAC, localizados na membrana plasmática, desempenham um papel importante na proliferação de linfócitos T e na estimulação da expressão gênica dos receptores de linfócitos T. A ativação dos receptores de linfócitos T por um antígeno resulta na formação do segundo mensageiro trifosfato de adenosina e na ativação da liberação de cálcio do reservatório por meio dos receptores de trifosfato de inositol 1,4,5-trifosfato. A redução na concentração de cálcio dentro do reservatório leva à ativação dos canais CRAC e ao consequente aumento da concentração de cálcio no citosol. Anormalidades na função dos canais CRAC em linfócitos T estão associadas a diversas doenças humanas, incluindo distúrbios de imunodeficiência combinada grave e doenças autoimunes.Aqui é apresentado um método que permite o registro confiável e reprodutível de correntes endógenas de cálcio e sódio por canais de crack em linfócitos T humanos. Primeiro, aplica-se o FSA garin, um bloqueador da ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático, em uma solução extracelular livre de cálcio e contendo três milimolares de magnésio para esgotar o reservatório.Este procedimento abre os canais de crack, mas não induz corrente de crack devido à baixa permeabilidade dos canais de crack ao magnésio. Em seguida, é estabelecido um clamp de voltagem em célula inteira na membrana de uma célula T. A célula é perfundida com uma solução de pipeta contendo uma alta concentração do quelante de cálcio pta.Em seguida, soluções extracelulares contendo cálcio ou livres de cátions divalentes são aplicadas sequencialmente para ativar correntes mensuráveis de cálcio e sódio por meio de canais do tipo crack. Os dados resultantes demonstram o nível de expressão funcional dos canais do tipo crack em linfócitos T humanos em repouso. O estudo das correntes de membrana por meio dos canais do tipo crack pode fornecer informações valiosas sobre a regulação e as funções desses canais, além de estabelecer seu papel nas respostas imunes normais e nas doenças imunológicas.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades devido ao pequeno tamanho dos linfócitos T humanos e à baixa amplitude das correntes endógenas de estalos nessas células. Os linfócitos T humanos positivos para CD3 para este experimento foram obtidos a partir de uma amostra de sangue periférico de um voluntário saudável e isolados utilizando o coquetel de enriquecimento de linfócitos T humanos TEP e meio de densidade TEP. De acordo com as instruções no protocolo escrito fornecido, as células foram mantidas em meio de cultura de linfócitos T a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono.Prepare as seguintes soluções: solução número um contendo três milimolares de magnésio e sem cálcio; solução número dois, contendo 20 milimolares de cálcio; solução número três contendo 10 milimolares do quelante de cálcio H-E-D-T-A e sem íons bivalentes; e solução para pipeta contendo 12 milimolares do quelante de cálcio bta. Armazene as soluções a quatro graus Celsius por até uma semana. No dia do experimento, puxe as pipetas para obter um diâmetro de ponta de aproximadamente dois mícrons, utilizando capilares de vidro e um puxador de pipetas.Utilize tubos de sílica com filamento com a especificação mostrada aqui e listada no texto acompanhante. Após a puxada, as pontas dos micropipetos são revestidas com o revestimento protetor semicondutor PEC R 61 0 1 e polidas com chama. Armazene-as em um local protegido contra poeira, como um suporte para micropipetos.Abra o software que controla o amplificador de patch clamp aqui. Um amplificador de patch clamp EPC 10 é controlado pelo software Pulse. Configure e salve a configuração nas macros de célula e célula inteira utilizadas para a formação do selo giga e o estabelecimento da configuração de célula inteira.A seguir, no software de aquisição, configure e salve aqui o protocolo de estimulação para registrar as correntes de ruptura. O protocolo de aquisição na janela de geração de pulsos é definido como uma rampa de tensão de menos 120 a mais 100 milivolts com duração de 50 milissegundos.Crie dois protocolos de estimulação com frequências de estímulo de voltagem em rampa de 0,5 hertz e cinco hertz, e salve-os na janela de geração de pulsos com os nomes rampa um e rampa dois, respectivamente. Para preparar as células, plaque 500 microlitros da suspensão celular contendo de 0,2 a 0,5 milhão de células em uma câmara de gravação composta por um lamínula revestido com polilisina e um anel de silicone acoplado. Incube por 20 minutos a 37 graus Celsius.Após a incubação, fixe a câmara de gravação em um suporte para câmara. Aqui, utiliza-se um suporte personalizado no qual a parte inferior sustenta a lamínula na base da câmara e a parte superior pressiona contra a face superior da lamínula. Coloque o suporte para câmara na platina do microscópio invertido utilizando uma objetiva de imersão em óleo de 40 x e iluminação em campo claro.Encontre um campo de células e foque. Coloque o eletrodo de referência de cloreto de prata na cuba. Em seguida, alinhe um sistema de perfusão multibocal por gravidade posicionando a ponta do tubo de entrada a 45 graus em relação à lamínula, próximo ao campo de visão; o tubo de sucção é inserido na parte superior do suporte da câmara.Gire a parte superior do suporte da câmara até que o tubo de sucção fique oposto ao tubo de entrada para realizar o canal correto. Os registros de corrente começam com a abertura da válvula do sistema de perfusão para perfundir a câmara de gravação com solução livre de cálcio. A solução bat número um, contendo 3 milimolares de magnésio, suplementada com 0,5 a 1 micromolar de AP argon, é aplicada por oito a 10 minutos para bloquear a bomba circa.Esta etapa esgota o reservatório de cálcio. Em seguida, utilize um microcarregador einor com uma pipeta de deslocamento de ar P 20. Para encher a pipeta com a solução de pipeta, insira a pipeta no suporte na plataforma do amplificador aqui.Um dispositivo personalizado de pressão e sucção é conectado às linhas de ar pressurizado e de vácuo. Para criar pressão positiva ou negativa em uma pipeta de patch, aplique uma pequena pressão positiva de cerca de três polegadas de água dentro da pipeta conectando a pipeta à saída do dispositivo de pressão e sucção por meio do tubo conectivo. Clique na tecla de controle de configuração na janela do clamp de patch EPC 10 na tela do computador.Para executar a macro de configuração, localize uma célula redonda de tamanho médio com uma superfície externa lisa que esteja firmemente aderida à lamínula. Em seguida, abaixe o eletrodo de patch na câmara sob controle visual por meio do microscópio na janela do osciloscópio.A corrente que flui através da pipeta pode ser observada após imergir a pipeta na solução de banho. Uma alteração em forma de degrau na amplitude da corrente é provocada pelo pulso de tensão de teste de cinco milivolts aplicado à pipeta pelo macro de configuração. O software do pulso calcula automaticamente a resistência da pipeta e a exibe na janela de resistência da membrana.Na tela do computador, a resistência da pipeta geralmente é de cinco a seis mega ohms. Clique na tecla de controle automático na janela do amplificador na tela do computador para corrigir o potencial de offset gerado entre a pipeta e o eletrodo de referência. A corrente de linha de base será deslocada para um nível de corrente zero.Use o micro manipulador para trazer a ponta da pipeta até tocar a membrana celular. Após o contato, haverá uma diminuição na amplitude da corrente provocada pelo pulso de teste. Aplique pressão negativa de 20 a 40 polegadas de água à pipeta de patch.Monitore a formação do selo giga no visor do osciloscópio. A amplitude da corrente evocada pelo pulso de teste deve diminuir gradualmente à medida que o valor da resistência da pipeta aumenta para mais de cinco giga ohm. Normalmente, o contato com selo giga se forma rapidamente, mas pode levar de um a dois minutos para se obter um selo giga estável.Uma vez alcançado o selo giga, desconecte o suporte da pipeta do dispositivo de sucção por pressão removendo o tubo conectivo da saída. Clique na tecla de controle onsell na tela do computador para executar a macro onsell, que foi configurada anteriormente ao experimento. De acordo com o manual do EPC 10, compense a capacitância da pipeta clicando na tecla de controle automático na janela cfat.Na janela do osciloscópio, o transiente de corrente desaparecerá e o valor da capacitância da pipeta aparecerá na janela cfat para romper a membrana celular. No interior da pipeta, conecte a pipeta a uma seringa de 20 centímetros cúbicos por meio do tubo conectivo e puxe o êmbolo para aplicar pressão negativa adicional à pipeta. Quando a membrana celular no interior da pipeta se romper, dois transientes de corrente carregando a membrana celular até um novo nível de tensão aparecerão. Clique na tecla de controle de célula inteira na tela do computador para executar a macro pré-definida de célula inteira.Em seguida, para definir o potencial de retenção, digite mais 30 milivolts na janela V membrana; um potencial de retenção positivo ajuda a prevenir a ativação do canal de vazamento dependente de cálcio. Depois, clique na tecla de controle automático na janela C lenta. Para compensar a capacitância celular na janela do osciloscópio, o transiente de corrente desaparecerá.Os valores para capacitância celular e resistência em série aparecerão nas janelas C lenta e R série, respectivamente. A resistência em série é tipicamente dentro da faixa de sete a 20 mega. Os valores de C lenta, que correspondem aos valores de capacitância celular, são tipicamente na faixa de 1,5 a 2,5 pico farad.Em linfócitos T humanos em repouso, clique na tecla de controle rampa um na janela do osciloscópio para aplicar uma série de rampas de voltagem com frequência de 0,5 hertz. Isso executará o protocolo de estimulação gerado e salvo anteriormente na janela do osciloscópio. As correntes evocadas pelas rampas de voltagem são mostradas. Registre.Esses traços de corrente na solução número um livre de cálcio contendo três milimolares de magnésio. Nessa solução, a corrente de crack é muito pequena devido à baixa permeabilidade dos canais de crack para o magnésio Saban. Utilize esses traços na análise futura como correntes de vazamento.A amplitude absoluta do vazamento em menos 100 milivolts deve ser igual ou menor que cinco picoamperes. Se a célula estiver com vazamento, interrompa o experimento e recomece com uma nova pipeta de patch e uma nova célula.A seguir, para registrar a corrente de cálcio por meio de canais TRP, troque as válvulas de perfusão para substituir a solução de banho número um pela solução de banho número dois contendo 20 milimolares de cálcio. Isso permite que íons de cálcio fluam através dos canais TRP e produzam uma corrente entrante na janela do osciloscópio. Uma corrente de cálcio retificadora para dentro por meio de canais TRP desenvolve amplitude de corrente em voltagens negativas e continua aumentando por cerca de um minuto devido à potenciação dependente de cálcio da corrente TRP.Clique na tecla de controle rampa dois na janela do osciloscópio para executar um protocolo de estimulação predefinido, que altera a frequência de estimulação com rampas de voltagem, aumentando a frequência de estimulação em cinco hertz, o que ajuda a registrar a corrente máxima de sódio por meio de canais CRAC, que é transitória por natureza. Em seguida, comute novamente as válvulas de perfusão para substituir a solução banho número dois pela solução número três, contendo sódio e livre de cátions divalentes, na janela do osciloscópio. Desenvolve-se uma corrente de sódio retificadora para dentro, com amplitude transitória maior, por meio de canais CRAC.Após o término do experimento, feche o arquivo; ele salva os traços de corrente registrados para análise posterior. Para analisar os dados, recupere os registros de corrente salvos no software de análise. Aqui, utiliza-se o software Pulse para análise, empregando pares de cursores na janela do osciloscópio do programa Pulse. Meça as amplitudes de corrente no início e no final das rampas de tensão aqui.As amplitudes de corrente são medidas em menos 100 milivolts e em mais 100 milivolts. Exporte os valores das amplitudes de corrente para um programa gráfico, como o software Origin de análise e representação científica. Para análise adicional e apresentação gráfica, correntes de fuga foram medidas em células T CD3 positivas em repouso provenientes de um indivíduo humano saudável utilizando o método descrito aqui; esta figura mostra um curso temporal das correntes de fuga registradas em configuração de grampo de tensão em célula inteira em menos 100 milivolts, indicado pelos círculos preenchidos, e em mais 100 milivolts, indicado pelos círculos vazados.Antes da formação do selo giga, a célula foi pré-incubada por aproximadamente 10 minutos em solução de banho número um sem cálcio e contendo três milimolares de magnésio com 0,5 micromolar de ortogon após a ruptura. As soluções foram aplicadas sequencialmente da seguinte forma: solução de banho número um sem cálcio e contendo três milimolares de magnésio, seguida da solução de banho número dois contendo 20 milimolares de cálcio, seguida da solução de banho número três livre de cátions divalentes, seguida novamente pela solução de banho número dois contendo 20 milimolares de cálcio. A célula foi estimulada com uma série de rampas de voltagem de menos 120 milivolts a mais 100 milivolts, conforme mostrado aqui.Aplicaram-se rampas de voltagem a cada 200 milissegundos ou com uma frequência de cinco hertz na solução de rã número três livre de cátions divalentes e a cada dois segundos ou com uma frequência de 0,5 hertz em todas as outras soluções. Observe o desenvolvimento lento da corrente de cálcio através dos canais de ruptura após a aplicação da solução de rã número dois contendo 20 milimolares de cálcio e o desenvolvimento rápido e transitório da corrente de sódio através dos canais de ruptura na solução de rã número três livre de cátions divalentes. Esta figura mostra traços representativos de corrente registrados durante rampas de voltagem na ausência de cálcio.Solução de banho número um contendo 3 mM de magnésio, solução de banho número dois contendo 20 mM de cálcio e solução de banho livre de cátions divalentes número três. Os traços das correntes de cálcio e sódio durante as rampas de voltagem individuais podem ser obtidos subtraindo-se as correntes registradas na solução de banho número um, livre de cálcio e contendo 3 mM de magnésio, das correntes registradas na solução de banho número dois contendo 20 mM de cálcio e na solução de banho livre de cátions divalentes número três. Os traços de corrente resultantes, exibindo relações corrente-voltagem típicas para correntes de cálcio e sódio por meio de canais CRAC, são mostrados aqui.Uma vez dominada esta técnica e realizados corretamente todos os estágios do procedimento, é possível registrar correntes de canais de fissura de cinco a dez células por dia. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como registrar correntes de repouso em linfócitos T humanos. Após seguir este procedimento, você também deverá ser capaz de registrar correntes corretas em outras células do sistema imunológico, como linfócitos T humanos ativados, monócitos, macrófagos e também linhagens celulares. Eletrofisiológico.A gravação das correntes iônicas em canais de fissura nas células do sistema imunológico pode permitir que pesquisadores estabeleçam seu papel na homeostase de cálcio em células imunes.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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