Isolamento do Cérebro e da Medula Espinhal Células Mononucleares Usando Percoll Gradients

As células imunes se infiltram no sistema nervoso central durante infecção, trauma, autoimunidade ou neurodegeneração. Embora as abordagens histoquímicas possam ser usadas para determinar a localização das células infiltrantes e analisar a patologia associada, essas técnicas são limitadas pelo número de anticorpos que podem ser usados simultaneamente. Aqui é mostrado um método para isolamento rápido de células mononucleares dos tecidos do cérebro e da medula espinhal, no qual o tecido dissecado é primeiro homogeneizado.

Em seguida, um gradiente de perol é configurado e, após a centrifugação, as células mononucleares são coletadas da interface. Finalmente, as células são enxaguadas e coradas com anticorpos Por meio da análise de citometria de fluxo, as células hematogênicas e a microglia de vigilância são distinguidas e suas proporções relativas durante os estados de doença podem ser determinadas. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o gradiente de Aris ou em tal histoquímica, é que ela consome menos tempo.

Isso permite que você processe mais tecidos ao mesmo tempo. Demonstrando a configuração do gradiente estará palino Um técnico do meu laboratório Prepare os reagentes que serão necessários para este protocolo. Começando com quatro mililitros de perol isotônico de estoque, conhecido como SIP por cérebro.

Para fazer isso, combine nove partes de perol com uma parte 10 vezes HBSS sem cálcio e magnésio misturados por inversão. Em seguida, prepare 70% por chamada enquanto mistura o SIP preparado com um HBSS sem cálcio e magnésio. Em seguida, dispense dois mililitros de 70% por cola em um tubo cônico de polipropileno de 15 mililitros para coletar o tecido.

Para este procedimento, coloque os cérebros dissecados e a medula espinhal de todos os camundongos do estudo em béqueres contendo 10 mililitros de RPMI sobre o gelo. Em seguida, transfira o tecido para um homogeneizador de sete ou 15 mililitros contendo três mililitros de uma vez HBSS com um tamanho de encaixe solto. Um pilão faz suavemente uma suspensão celular, depois muda para um pilão tamanho B bem ajustado e dissocia ainda mais os tecidos.

Uma vez que o tecido esteja homogeneizado, adicione RPMI ou uma vez HBSS a um volume final de sete mililitros e prossiga para configurar o gradiente para configurar o gradiente percoco. Comece adicionando três mililitros de SIP à suspensão celular até uma concentração final de PERCOCO de 30%Lembre-se de que o perol deve ser usado em temperatura ambiente. Se for usado frio, as células tendem a se aglomerar e a separação celular é menos eficiente.

Em seguida, usando nosso modo de configuração de gravidade de auxiliar de pipeta, coloque lentamente a suspensão de célula de 10 mililitros em cima do 70% SIP. Evite misturar as soluções de 70% e 30%. Esta é a etapa mais crítica do procedimento.

Uma linha plana muito clara deve ser visível na junção de 70 a 30%. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a terceira e a 70% soluções se misturarão durante a estratificação. Próximo passo, comprometendo a interface Centrífuga 30 minutos de 500 Gs a 18 graus Celsius.

Certifique-se de que a centrífuga pare com o mínimo ou nenhuma interrupção para que a interface não seja perturbada. Depois de girar os gradientes, uma camada espessa e viscosa de detritos deve se acumular no topo do tubo. A próxima camada é a camada amarelada de 30% por núcleo, que às vezes contém detritos.

Em seguida está a interface 70 a 30, que deve ter um halo branco definido e contém as células mononucleares. Finalmente, na parte inferior do tubo está a camada transparente de 70% de perol. Se nenhuma interface for observada, o rendimento das células provavelmente será muito baixo, tornando extremamente difícil uma análise mais aprofundada.

Portanto, nesse ponto, suspensões de células frescas podem ser necessárias para diminuir a contaminação. Remova cuidadosamente a camada de detritos da parte superior do tubo e descarte-a. Em seguida, usando uma pipeta de plástico, passe pelos 30% superiores por camada central e colete dois a três mililitros da interfase 70 30 e transfira-o para um tubo cônico limpo contendo oito mililitros de uma vez HBSS.

Misture as interfaces diluídas algumas vezes por inversão e, em seguida, centrifugue por sete minutos a 500 GS a 18 graus Celsius. Após a centrifugação, retire a supena e ressuspenda o chumbinho. Em um mililitro de tampão de coloração celular, transfira a suspensão celular para um tubo de 1,5 mililitro e lave-o mais uma vez.

Usando uma microcentrífuga a 10.000 GS por um minuto a quatro graus Celsius antes de prosseguir com a coloração de anticorpos para realizar a coloração de anticorpos, ressuspenda os grânulos em 50 microlitros de anti-US CD 16, CD 32 purificado, diluído de um a 200 em tampão de coloração celular para bloquear os locais de ligação FC. Como em qualquer procedimento de coloração, é imperativo que todos os anticorpos sejam titulados adequadamente incubados em gelo por 10 minutos. Durante a incubação, remova de dois a cinco microlitros de células e conte-as usando um hemocitômetro.

Os tecidos cerebrais e da medula espinhal ingênuos combinados devem render cerca de três a cinco vezes 10 para as cinco células por camundongo. Cérebros inflamados terão números variados de células inflamatórias, dependendo do momento em que são coletadas e do modelo da doença Após a incubação com CD 16 e CD 32, adicione 50 microlitros de mistura de coquetel de anticorpos específicos para células imunes. A mistura usada neste exemplo contém anticorpos contra CD 45, CD quatro e CD 19 incubar no gelo por 30 minutos.

É importante ressaltar que cada anticorpo deve ser primeiro titulado. Para avaliar a diluição ideal, use combinações apropriadas de fluorocromo escolhidas de acordo com as capacidades das configurações de laser e filtro de seu fluxo específico. O citômetro, após a coloração das células, lave-as em tampão de coloração celular adicionando um mililitro de tampão de coloração celular e girando-as por um minuto.

A 10.000 Gs após a centrifugação, descarte o agente supino e, em seguida, ressuspenda os paletes em 100 a 200 microlitros de tampão de coloração celular para análise citometria de fluxo imediata para análise posterior. Reus suspende as células em 2% de par formaldeído preparado em PBS e armazena durante a noite a quatro graus Celsius. Aqui são mostradas células mononucleares obtidas e incubadas com bloqueio FC, seguidas por anticorpos anti CD 45, CD quatro e CD 19.

De acordo com o protocolo demonstrado por citometria de fluxo, a coloração CD 45 separa bem as células hematogênicas altas do CD 45 do CD 45, microglia de vigilância DIM. Esta figura compara as células isoladas de um cérebro ingênuo e um cérebro inflamado de um camundongo induzido a desenvolver encefalomielite autoimune experimental. CD 45 A intensidade de um PC é mostrada no eixo Y, onde três populações distintas são visualizadas no cérebro ingênuo.

Muito poucos números de células CD 45 altas são detectados. Geralmente menos de 2% do total da população isolada. Em comparação, os cérebros de camundongos afetados pela EAE mostram um influxo maciço de células sanguíneas recrutadas para o cérebro.

A adição de outros marcadores de superfície celular, como CD 11 b, CD quatro, CD oito, etc., permite uma caracterização mais aprofundada da alta população de CD 45 Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em três a quatro horas se for executada corretamente. Durante a realização deste procedimento, é importante lembrar que as abordagens histológicas em conjunto com a fenotipagem imunológica por citometria de fluxo são fundamentais para caracterizar completamente a composição dos infiltrados inflamatórios do SNC.