Isolamento do Cérebro e da Medula Espinhal Células Mononucleares Usando Percoll Gradients

Células imunes infiltram o sistema nervoso central durante infecção, trauma, autoimunidade ou neurodegeneração. Embora abordagens histoquímicas possam ser usadas para determinar a localização das células infiltrantes e analisar a patologia associada, essas técnicas são limitadas pelo número de anticorpos que podem ser utilizados simultaneamente. Aqui é apresentado um método para o isolamento rápido de células mononucleares a partir de tecidos cerebrais e medulares no qual o tecido dissecado é primeiramente homogeneizado.

Em seguida, é montado um gradiente de perol e, após a centrifugação, as células mononucleares são coletadas a partir da interface. Por fim, as células são lavadas e marcadas com anticorpos. Por meio da análise de citometria de fluxo, células hematogênicas e micróglia de vigilância são diferenciadas e suas proporções relativas durante estados patológicos podem ser determinadas. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o gradiente de Aris ou a histoquímica, é que ela é menos demorada.

Isso permite que você processe mais tecidos ao mesmo tempo. Demonstrará a configuração do gradiente Palino A, uma técnica do meu laboratório. Prepare os reagentes necessários para este protocolo. Comece com quatro mililitros de perol isotônico estoque, referido como SIP, por cérebro.

Para fazer isso, combine nove partes de perol com uma parte de HBSS 10 vezes sem cálcio e magnésio, misturando por inversão. Em seguida, prepare 70% de per cel misturando o SIP preparado com HBSS 1 vez sem cálcio e magnésio. Então, distribua dois mililitros do 70% de per cole em um tubo cônico de polipropileno de 15 mililitros para coletar o tecido.

Para este procedimento, coloque os cérebros e medulas espinhais dissecados de todos os camundongos do estudo em béqueres contendo 10 mililitros de RPMI sobre gelo. Em seguida, transfira o tecido para um homogeneizador de 7 ou 15 mililitros contendo três mililitros de HBSS 1 vez com um pistilo de encaixe solto. Gentilmente, faça uma suspensão celular com o pistilo, depois mude para um pistilo tipo B de encaixe firme e dissocie ainda mais os tecidos.

Uma vez que o tecido seja homogeneizado, adicione RPMI ou HBSS uma vez à concentração final de sete mililitros e prossiga para a montagem do gradiente para preparar o gradiente de PERCOCO. Comece adicionando três mililitros de SIP à suspensão celular para obter uma concentração final de PERCOCO de 30%. Tenha em mente que o perol deve ser usado à temperatura ambiente. Se for usado frio, as células tendem a se aglomerar e a separação celular é menos eficiente.

Em seguida, utilizando o auxílio da pipeta no modo de gravidade, sobreponha lentamente a suspensão celular de 10 mililitros sobre o SIP a 70%. Evite misturar as soluções a 70% e a 30%. Este é o passo mais crítico do procedimento.

Uma linha plana muito nítida deve ser visível na junção entre 70 e 30%. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque as soluções de terceiro e 70% se misturarão durante a sobreposição. Próximo passo, comprometendo a interface: centrifugar por 30 minutos a 500 Gs a 18 graus Celsius.

Certifique-se de que a centrífuga pare com freio mínimo ou nenhum freio, para que a interface não seja perturbada. Após a centrifugação dos gradientes, uma camada espessa e viscosa de detritos deve se acumular no topo do tubo. A próxima camada é a camada amarelada de 30% de peróxido de core, que às vezes contém detritos.

A seguir está a interface 70 a 30, que deve apresentar um halo branco definido e contém as células mononucleares. Por fim, na parte inferior do tubo, encontra-se a camada clara de perol 70%. Se nenhuma interface for observada, o rendimento de células provavelmente será muito baixo, tornando a análise subsequente extremamente difícil.

Portanto, nesse ponto, podem ser necessárias suspensões celulares frescas para reduzir a contaminação. Remova cuidadosamente a camada de detritos na parte superior do tubo e descarte-a. Em seguida, utilizando uma pipeta de plástico, atravesse os 30% superiores da camada do núcleo e colete dois a três mililitros da fase intermédia 70-30, transferindo-a para um tubo cônico limpo contendo oito mililitros de HBSS uma vez.

Misture as interfaces diluídas algumas vezes por inversão, depois centrifugue por sete minutos a 500 ×g a 18 graus Celsius. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet. Em um mililitro de tampão de marcação celular, transfira a suspensão celular para um tubo de 1,5 mililitro e lave mais uma vez.

Utilizando uma microcentrífuga a 10.000 ×g por um minuto a quatro graus Celsius antes de prosseguir com a coloração por anticorpos para realizar a coloração por anticorpos, ressuspenda os pellets em 50 microlitros de anti-US CD 16, CD 32 purificado, diluído de 1:200 em tampão de coloração celular para bloquear os sítios de ligação FC. Como em qualquer procedimento de coloração, é imperativo que todos os anticorpos sejam adequadamente titulados, incube no gelo por 10 minutos. Durante a incubação, remova de dois a cinco microlitros de células e conte-as utilizando um hemocitômetro.

Os tecidos combinados de cérebro e medula espinhal ingênuos devem render cerca de três a cinco vezes 10 elevado a cinco células por camundongo. Os cérebros inflamados terão números variáveis de células inflamatórias, dependendo do ponto temporal em que são coletados e do modelo de doença. Após a incubação com CD 16 e CD 32, adicione 50 microlitros da mistura de coquetel de anticorpos específicos para células imunes. A mistura utilizada neste exemplo contém anticorpos contra CD 45, CD 4 e CD 19; incube no gelo por 30 minutos.

É importante que cada anticorpo seja primeiramente titulado. Para avaliar a diluição ideal, utilize combinações apropriadas de fluorocromos escolhidas de acordo com as capacidades dos lasers e configurações de filtros do seu citômetro de fluxo. Após marcar as células, lave-as em tampão de marcação celular adicionando um mililitro de tampão de marcação celular e centrifugando-as por um minuto.

A 10.000 ×g após a centrifugação, descarte o sobrenadante, depois re-suspenda os pellets em 100 a 200 microlitros de tampão de marcação celular para análise citométrica de fluxo imediata ou posterior. Re-suspenda as células em paraformaldeído 2% preparado em PBS e armazene durante a noite a quatro graus Celsius. São mostradas aqui células mononucleares obtidas e incubadas com bloqueador de FC, seguidas pelos anticorpos anti-CD45, CD4 e CD19.

De acordo com o protocolo demonstrado por citometria de fluxo, a marcação para CD45 separa nitidamente as células hematogênicas CD45 alta das micróglias de vigilância CD45 fraco (DIM). Esta figura compara as células isoladas de um cérebro ingênuo e de um cérebro inflamado de um camundongo induzido a desenvolver encefalomielite autoimune experimental. A intensidade do APC anti-CD45 é mostrada no eixo Y, onde três populações distintas são visualizadas no cérebro ingênuo.

É detectado um número muito pequeno de células CD45 altas. Geralmente menos de 2% da população isolada total. Em comparação, cérebros de camundongos afetados por EAE mostram uma afluência maciça de células sanguíneas recrutadas para o cérebro.

A adição de outros marcadores de superfície celular, como CD11b, CD4, CD8, entre outros, permite uma caracterização mais detalhada da população CD45 alta. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três a quatro horas, se for executada corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que abordagens histológicas em conjunto com a fenotipagem imune por citometria de fluxo são fundamentais para caracterizar completamente a composição dos infiltrados inflamatórios do SNC.