Monitoramento células imunes Tráfico Rods Horas Prion fluorescente após a infecção intraperitoneal

O objetivo principal deste procedimento é monitorar a captação e o tráfego de príons por células imunes nas primeiras horas após a infecção. Primeiramente, purifique e marque com fluorocromo os bastonetes de príons agregados provenientes de cérebro infectado, em seguida inocule esses bastonetes de príons na cavidade peritoneal de camundongos. Após duas horas, recolha células do peritônio, baço e também dos linfonodos mediastinais e mesentéricos. Por fim, marque as células recuperadas com marcadores fenotípicos imunes e analise-as quanto à retenção de príons.

Por exemplo, os resultados da citometria de fluxo podem ser usados para demonstrar que os bastonetes priônicos são retidos e transportados principalmente por macrófagos e células dendríticas, secundariamente por monócitos e terciariamente por linfócitos B. Este sistema experimental foi projetado para esclarecer reservatórios priônicos e possíveis alvos terapêuticos, respondendo perguntas fundamentais, como quais células captam o PreOn imediatamente após a infecção, para onde as células os levam e com que velocidade chegam lá.

Para demonstrar este procedimento, estarão presentes Crystal, Mt. And Brady Michael, estudantes de pós-graduação do meu laboratório, a fim de coletar as proteínas PreOn. Homogeneíze 100 miligramas de tecido cerebral infectado com PreOn em 900 mililitros de tampão de homogeneização gelado por um minuto em velocidade máxima em um liquidificador comercial e, imediatamente, coloque no gelo por dois minutos. Repita este processo três vezes para aumentar o rendimento proteico.

Centrifugue o homogenato por 10 minutos a 3000 Gs e quatro graus Celsius. Remova e guarde o sobrenadante em gelo. Resuspenda o pellet em um litro de hp e repita as etapas de homogeneização e centrifugação.

Agora, reúna o sobrenadante e centrifugue por 60 minutos a 100.000 ×g e zero graus Celsius. Descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 100 mililitros de TBST.

Estime a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford e ajuste o volume para cinco miligramas por mililitro de proteína em TBST. Resfrie em gelo por 30 minutos. Novamente, centrifugue por 30 minutos a 100.000 ×g e zero graus Celsius.

Descarte o SNA e lave o precipitado primeiro com 50 mililitros de TBST. Em seguida, ressuspenda o precipitado resultante em 100 mililitros de TBS 1X contendo 1% de sarcosil e coquetel de inibidores de protease, e agite durante 120 minutos a 37 graus Celsius. Para realizar um gradiente de sacarose, sobreponha a amostra em 900 mililitros de sacarose 320 milimolar e centrifugue por 60 minutos.

A 100.000 ×g e 10 graus Celsius. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de cloreto de sódio 2,3 molar, 5% Sarco seal. Em seguida, sonique a amostra cinco vezes por 40 segundos a 70% da potência máxima, com intervalos de um minuto.

Eluir um mililitro da amostra em tubos Eppendorf e centrifugar por 15 minutos a 13.000 ×g a 4 °C. Lavar os pellets duas vezes com TBS e armazenar os estoques a -70 °C. Conjugue um tubo de bastonetes PreOn purificados usando um frasco de corante DITE 649 de acordo com o protocolo do fabricante.

Por fim, substitua o tampão de marcação com dite por PBS por meio de centrifugação através de colunas de filtro. Armazene em alíquotas de 20 microlitros a menos 70 graus Celsius, protegido da luz, até o momento do uso. Esta seção abrange a inoculação intraperitoneal, priônica, e a recuperação de células do peritônio, linfonodos mediastinais e mesentéricos e baço imediatamente antes do uso do laço D fluorescente priônico.

Segure o camundongo pelo pelo da nuca com o polegar e o indicador, segurando de um a 50 bastões em PBS. Vire suavemente o camundongo para que ele fique voltado para você e restrinja a cauda com o dedo mindinho. Posicione o camundongo em pronação, elevando o tronco posterior acima da cabeça e segurando-o levemente de cabeça para baixo.

Usando uma seringa de insulina com agulha de 30 graus, injete 100 microlitros de bastonetes fluorescentes de píon, um centímetro lateral à linha média e um a dois centímetros anterior à articulação ilíaca escrocítica. Insira a agulha um centímetro através da pele, direcionada a 45 graus medialmente; para camundongos controle, utilize uma diluição de um para 50 de microesferas fluorescentes ou PBS sozinho. De acordo com o delineamento experimental, incube os camundongos pelo tempo determinado para iniciar as análises.

Eutanizar os camundongos de acordo com os protocolos aprovados pelos comitês de cuidado e uso de animais. Injetar 10 mililitros de PBS na cavidade peritoneal utilizando uma seringa de 12 mililitros e agulha de 25 graus. Balançar suavemente o camundongo longitudinalmente por um minuto para prosseguir com a dissecação do camundongo.

Umedeça completamente o lado ventral do pelo do camundongo com etanol 70%. Com uma pinça, levante a pele na linha média logo abaixo da caixa torácica e faça uma pequena incisão na pele com uma tesoura. Faça uma incisão de três a cinco centímetros de comprimento na pele em ambas as direções, em direção à cabeça e à cauda, respectivamente.

Incisões de dois centímetros a partir da linha média lateralmente em cada extremidade; puxe e fixe a pele para expor as cavidades peritoneal e torácica. Recolha a suspensão celular do peritônio utilizando a mesma seringa e uma agulha de calibre 16. Coloque o exsudato em um tubo cônico de 15 mililitros e mantenha em gelo.

Corte cuidadosamente a fina membrana translúcida que envolve o peritônio e reflete o tórax para expor o mediastino. Agora localize e remova dois a quatro linfonodos mediastinais, ligeiramente dorsais e adjacentes lateralmente ao timo, medialmente adjacentes à artéria braquiocefálica, próximos ao lado ventral da traqueia. Em seguida, localize e remova até seis linfonodos mesentéricos embutidos no tecido mesentérico branco e mole que fixa os intestinos à parede abdominal posterior.

Reserve os linfonodos em um mililitro de meio PMI 1640, mantido no gelo até a conclusão da dissecação. Por fim, localize e remova o baço. Um órgão longo, de cor vermelho-escura, localizado logo lateral à linha média e dorsal aos intestinos, no lado esquerdo do camundongo.

Usando o êmbolo de uma seringa de um mililitro, macere e pressione os linfonodos através de uma peneira de malha de 40 micrômetros em três mililitros de PBS em uma placa de Petri de plástico. Enxágue a peneira com mais dois mililitros de PBS e transfira a suspensão celular total de cinco mililitros para um tubo cônico de 15 mililitros. Além disso, enxágue a placa de Petri com mais cinco mililitros de PBS e transfira para o mesmo tubo.

Centrifugue a amostra por cinco minutos a 250 ×g. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular. Em um mililitro de buffer fax, transfira as células isoladas para um tubo EOR de 1,5 mililitro.

Normalmente, este protocolo de coloração pode ser usado para identificar subpopulações de células imunes, utilizando anticorpos fluorescentes contra marcadores de superfície celular imune bem caracterizados para lu todos os anticorpos no tampão fax. Imediatamente antes do uso. Conte as células e alíquota 10 elevado à sexta potência em tubos einor, pelote as células por centrifugação e lave o pellet duas vezes com um mililitro de tampão fax para bloquear receptores FC endógenos.

Incube as células em 100 microlitros de dois nanogramas por mililitro de rato anti-US CD 1632 por 20 minutos no pellet de gelo e lave as células com tampão fax. Em seguida, adicione 100 microlitros de um nanograma por mililitro do anticorpo fluorescente apropriado, ou anticorpos, a cada amostra e incube no gelo. Por uma hora, adicione 100 microlitros de tampão fax apenas às células controle, pelete e lave as células duas vezes com tampão fax.

Re-suspenda as células em um mililitro de tampão act, incube em gelo por um minuto. Para lisar o pellet de células sanguíneas vermelhas e lavar as células, adicione tampão fax e re-suspenda as células em um mililitro de tampão fax. Analise as amostras em um citômetro de fluxo, normalmente com lasers de excitação de 405, 488 e 633 nanômetros, e cinco a 10 detectores de emissão fluorescente.

O prião bruto, homogenato de cérebro infectado, é altamente enriquecido em priões. O processo de purificação envolve detergente, solubilização e ultracentrifugação do homogenato de cérebro de dois alces. O produto é uma protease.

A análise de fax resistente a K de populações celulares específicas demonstra que as células apresentadoras de antígenos migram para o peritônio em duas horas e retêm as microesferas fluorescentes e os bastonetes priônicos. Células de camundongos inoculados com microesferas e priônicos exibiram fluorescência significativa, especialmente em monócitos, células dendríticas e macrófagos.

Pré-on monócitos, células dendríticas e macrófagos também foram encontrados nos linfonodos mediastinais. Duas horas após a inoculação, não detectamos microesferas ou bastonetes Pré-on nos linfonodos mesentéricos. Neste experimento, o vídeo demonstrou vários protocolos para purificar bastonetes priônicos agregados a partir de cérebro infectado, realizar injeções intraperitoneais, identificar e isolar corretamente os linfonodos e, finalmente, isolar e corar células imunes.