Name: Gravações patch emparelhado Grampo da Motor-neurônio e músculo alvo ósseas em Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Aprenda a realizar gravações de patch clamp simultâneas em neurônios motores e músculos esqueléticos de larvas de zebrafish. Este método permite analisar a transmissão sináptica neuromuscular em vertebrados vivos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiado pelo NIH (NS-18205).

1. Preparação de peixes para Recordings emparelhados <ol><li> Antes de iniciar o procedimento, preparar cinco soluções-chave, que incluem: Solução de Bath, Bath Solution com tricaina (MS222), Solução Banheira com Formamida, Solução Neuron Interno e Solução Muscle Interna. </li><li> Em seguida, recolher uma única zebrafish larval entre as idades de 72 a 96 horas e coloque em banho com solução tricaina. Dentro de um minuto de exposição ao anestésico, os peixes não irá responder ao toque. </li><li> Coloque o peixe em cima de um prato de plástico e, em um estereomicroscópio para decapitar com uma lâmina de duplo fio de navalha. </li><li> Transfira o peixe para uma câmara de gravação de vidro revestidas com Sylgard e preenchido com solução de Bath. Aperte em cada extremidade, inserindo os pinos de tungstênio eletroliticamente afiada através da notocorda. </li><li> Criar um retalho de pele perto da extremidade rostral dos peixes com um pino que irá proporcionar uma aderência adequada para um par de fórceps bem. Retire a pele sobrejacente segurando-o perto do pino rostral com um par de fórceps bem. Descasque lentamente na direção caudal para remover a pele. </li><li> Tratar os peixes com 3 ml de solução Banheira com Formamida por 3-5 minutos para bloquear as contrações musculares que possam interferir com as gravações. Lavar 5 vezes com Solução de Bath normal. Remover parte da camada superficial do músculo mais de 5-6 segmentos suavemente a demolição com o lado de um pino de tungstênio. </li><li> Transfira o peixe para um microscópio vertical localizado em uma gaiola de Faraday para proteger ruído elétrico. O microscópio é equipado com um palco fixo, longa distância de trabalho objetiva de 40x e zoom de 4x para 0,5. O microscópio é montado em um palco motorizado tradução XY, a fim de mover a preparação entre nervo e músculo sob alta potência. O uso de contraste de interferência diferencial óptica ajuda a visualizar os neurônios. </li><li> Abaixo de 0,5 x de zoom, use um furo de largura de 15 micron pipeta para remover muscular sobrejacente e expor a medula espinhal. Pressão negativa é aplicada através de uma seringa descartável e cc 3 células musculares são removidos um a um. Este procedimento é repetido para 5-6 segmentos dorsal do músculo esquelético. O mesmo largo furo pipeta é usado também para remover a parte superior duas camadas de músculo ventral para obter músculo alvo rápida do esqueleto. </li><li> Isso completa a preparação para as gravações emparelhado eo zoom microscópio é aumentada para cerca de 1.6x. </li></ol> 2. Gravações pareadas de CaP Motor-neurônio e células musculares Alvo <ol><li> Os segmentos de limpeza são digitalizados para localizar os neurônios CaP. Cada hemi-segmento da medula espinhal contém uma grande diâmetro micron 10, CaP motor-neurônio. Esta soma teardrop forma está localizado superficialmente sob a dura-máter espinhal perto do final mais caudal do limite segmentar. Um neurônio CaP é escolhido para a gravação e do músculo alvo ventral no segmento adjacente caudal é verificado para verificar a integridade. </li><li> Dois eletrodos patch são posicionados para a gravação, um para o neurônio e um segundo para o músculo. O eletrodo superior tem uma vela rasa para a penetração da dura espinhal dura e abertura de ponta de cerca de 2 microns. Quanto menor eletrodo tem uma íngreme taper de baixa resistência de gravação braçadeira de tensão do músculo esquelético </li><li> Posição do eletrodo de neurônio em um ângulo de aproximadamente 30 graus para penetrar na dura espinhal, cerca da metade do segmento rostral à neurônio CaP selecionado. Avançar o eletrodo usando um manipulador disco axial ao aplicar uma pressão contínua suave positivo de aproximadamente 60 milímetros de mercúrio. Como eletrodo rompe a dura-máter, a PAC neurônio pode ser deslocada pela perfusão do eletrodo, exigindo um reajuste de foco. </li><li> Quando o eletrodo toca o CaP neurônio pressão soma positiva é liberado e, geralmente, resulta na formação imediata de um selo gigaohm. Porém, em alguns casos em que um selo não se forma, torna-se necessário aplicar uma leve pressão negativa. Após a formação selo, o potencial de eletrodo é ajustada para 80mV-e aplicação de pressão negativa rupturas da membrana celular. O neurônio CaP é caracterizada por uma resistência de entrada de 140-180 Mega-ohms e um potencial de ação que ultrapassa 40 milivolts. Este é testada injetando gradativamente aumentando passos despolarizantes em pinça de corrente até que o potencial de ação é eliciada. </li><li> Em seguida, o microscópio é transferida para o músculo ventral usando o tradutor XY motorizada, sob alta potência. A célula muscular rápido é escolhido a partir do campo de destino. </li><li> O eletrodo é avançado na direção do músculo na célula muscular alvo sob pressão positiva, que quando liberado, forma um selo gigaohm. O potencial de eletrodo é ajustado a -50 milivolts para inativar os canais de sódio e sob sugar suave a membrana da célula é rompido. A queda na resistência à 100-200 Mega-ohms eo súbito aparecimento dos transientes de entrada capacitiva grandes sinais. </li><li> Para testarpara a gravação emparelhado, o motor-neurônio é despolarizada por injeções de forma incremental maior de corrente até um potencial de ação é eliciada. Neste ponto, uma placa terminal atual deve ser atingida em músculo. Estimulação continuada do motorneuron a 1 Hertz resultados em correntes de placa terminal sem falhas. Como a frequência de estímulo é aumentada para 100 Hertz as correntes placa terminal flutuar em amplitude e passar pelo esgotamento funcional dentro de 10 segundos de estimulação. </li></ol> 3. Resultados representante Normalmente, o neurônio é a gravação estável por até uma hora, mas as células musculares se deteriorar conforme refletido como um aumento na resistência série. Quando isso ocorre o experimento é terminado ou outra célula muscular é remendo preso. Todas as gravações devem ser concluídas dentro de uma hora. <img src="/files/ftp_upload/2351/2351fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Recordings do potencial de ação motorneuron (AP, em cima) e placa terminal muscular associada atual (EPC, baixo). O potencial de ação de um neurônio PAC deve ultrapassar 40 mV eo EPC deve subir a 300 ms e decadência ao longo de um curso de tempo exponencial com uma constante de tempo inferior a 1 ms. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Receita </td></tr><tr><td> Solução de banho (em mM) </td><td> 134 NaCl, 2,9 KCl, CaCl 2 2,1, 1,2 MgCl 2, 10 Glucose, 10 Na-HEPES, pH 7.8 </td></tr><tr><td> Solução de banho com tricaina </td><td> Solução banho contendo tricaina 0,02% </td></tr><tr><td> Solução de banho com Formamida </td><td> Solução banho contendo formamida 2M </td></tr><tr><td> Neurônio solução interna (em mM) </td><td> 115 K-gluconato, 15 de KCl, MgCl 2 2, 10 K-HEPES, 5 K-EGTA, 4 Mg-ATP, pH 7,2 </td></tr><tr><td> Solução muscular interna (em mM) </td><td> 120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, pH 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Solutions.

<ol><li>Fetcho, J. R., O'Malley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+networks+in+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal networks in behaving animals.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7, 832-838 (1997).</li>
<li>Fetcho, J. R., S, H. igashijima <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+and+genetic+approaches+toward+understanding+neuronal+circuits+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical and genetic approaches toward understanding neuronal circuits in zebrafish.</a> Integr Comp Biol. 44, 57-70 (2004).</li>
<li>Ibañez-Tallon, I., Wen, H., Miwa, J., Xing, J., Aslantas-Tekinay, A., Ono, F., Brehm, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethering+naturally+occurring+peptide+toxins+for+cell+autonomous+modulation+of+ion+channels+and+receptors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Tethering naturally occurring peptide toxins for cell autonomous modulation of ion channels and receptors in vivo.</a> Neuron. 43, 305-311 (2004).</li>
<li>Li, W., Ono, F., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurements+of+presynaptic+release+in+mutant+zebrafish+lacking+postsynaptic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optical measurements of presynaptic release in mutant zebrafish lacking postsynaptic receptors.</a> J. Neuroscience. , 23-10467 (2003).</li>
<li>Ono, F., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+receptors+direct+rapsyn+clusters+to+the+neuromuscular+synapse+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine receptors direct rapsyn clusters to the neuromuscular synapse in zebrafish.</a> J. Neuroscience. 24, 475-5481 (2004).</li>
<li>Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Fetcho, J., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralytic+zebrafish+lacking+ACh+receptors+fail+to+localize+rapsyn+clusters+to+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Paralytic zebrafish lacking ACh receptors fail to localize rapsyn clusters to the synapse.</a> J. Neuroscience. 21, 5439-5448 (2001).</li>
<li>Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+motility+mutant+twitch+once+reveals+new+roles+for+rapsyn+in+synaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The zebrafish motility mutant twitch once reveals new roles for rapsyn in synaptic function.</a> J. Neuroscience. 22, 6491-6498 (2002).</li>
<li>Wang, M., Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+neuromuscular+synapses+in+the+zebrafish+choline-acetyltransferase+mutant+bajan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Function of neuromuscular synapses in the zebrafish choline-acetyltransferase mutant bajan.</a> J Neurophysiol. , 100-104 (2008).</li>
<li>Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+motor-neuron+muscle+recordings+in+zebrafish+test+the+receptor+blockade+model+for+shaping+synaptic+current%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Paired motor-neuron muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current.</a> J. Neuroscience. 25, 8104-8111 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Temos vindo a utilizar zebrafish gravações emparelhados (Wen e Brehm, 2005), principalmente para estudar os processos de liberação de vesículas e reciclagem durante a estimulação de alta freqüência. Este processo é interrompido em mutantes motilidade em que a transmissão sináptica normal é comprometida devido a mutações pontuais nos principais componentes sináptica. Por exemplo, mutações que perturbam agregados receptor pós-sináptico (Ono et al., 2001, 2002, 2004) e de síntese do transmissor pré-sináptico (Wang et al., 2008) resultar em não-coordenada de natação. Gravações emparelhado fornecer as informações que possam identificar a origem do defeito funcional, que liga comportamento, genética e fisiologia. Agora deve ser possível dissecar ainda mais os processos subjacentes a transmissão sináptica por meio da expressão transitória do CaP motor neurônios utilizando promotores criteriosa. Desta forma dominante genes mutados negativa ou pode ser especificamente expressas nestes neurônios e suas conseqüências comportamentais e eletrofisiológicos determinado. A vantagem adicional oferecida pela configuração da célula permite que toda a diálise da soma CaP com agentes que podem potencialmente alterar a reciclagem das vesículas, como toxinas clostridial e buffers de cálcio. Devido à curta distância entre o soma eo músculo, a difusão deve ocorrer bem dentro do prazo de gravações. O potencial desta preparação só começou a ser aproveitado. A transparência dos peixes neste local idade e superficial de sinapses também facilita a utilização de instrumentos ópticos (Fetcho e O&#39;Malley, 1997; Fetcho e Higashijima, 2004). Temos sido muito bem sucedida na medição de endo e exocitose nos peixes que vivem usando corantes FM e indicadores genéticos, tais como Synaptophluorin (Li et al., 2003). Além disso, as toxinas conjugado fluorescente pode ser usado para rotular proteínas sinápticas para geração de imagens de peixes vivos (Ibanez-Tallon et al., 2004). Dada a simplicidade desta preparação, é uma grande promessa para futuros estudos.

<table><tbody><tr><td>Testador de transdutor pneumático</td><td>Fluke Biomedical</td><td>DPM1B</td><td></td></tr><tr><td>Haste de tungstênio 0,002 x 3 polegadas</td><td>A-M Systems</td><td>715000</td><td></td></tr><tr><td>Elástomero Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>A espessura da aplicação afetará a óptica de DIC</td></tr></tbody></table>

gravações patch emparelhado grampo da motor-neurônio e músculo alvo ósseas em zebrafish

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish representar o sistema primeiro modelo vertebrados para permitir a gravação simultânea patch clamp um músculo do neurônio motor e alvo da coluna vertebral. Esta é uma conseqüência direta da acessibilidade para os dois tipos de células ea capacidade de distinguir visualmente o CaP única segmentar motor-neurônio com base na morfologia e localização. Este vídeo demonstra os métodos microscópicos utilizados para identificar uma CaP motor-neurônio e células musculares alvo, bem como as metodologias para a gravação de cada tipo de célula. A identificação do tipo CaP motor-neurônio é confirmado por um ou outro recheio corante ou pelas características biofísicas, como forma de onda do potencial de ação e resistência de entrada da célula. Motor-neurônio gravações rotineiramente durar uma hora permitindo gravações a longo prazo a partir de várias células musculares diferentes alvo. Controle sobre o padrão de disparo dos neurônios motor permite medições da freqüência de dependência da transmissão sináptica na junção neuromuscular. Devido a um tamanho grande quântica eo baixo nível de ruído fornecida pelo clamp toda célula de tensão, todos os eventos unitária podem ser resolvidos no músculo. Este recurso permite estudo de propriedades básicas sináptica, como propriedades de liberação, a reciclagem de vesícula, bem como a depressão sináptica e facilitação. As vantagens oferecidas por este in vivo preparação eclipse anterior modelo de sistemas neuromuscular onde estudou os neurônios motores são geralmente estimuladas por eletrodos extracelulares e os músculos são grandes demais para grampo toda célula patch. A preparação do peixe-zebra é passível de análise eletrofisiológica combinando com uma grande variedade de abordagens, incluindo linhagens transgênicas, knockdown morfolino, intervenção farmacológica e in vivo de imagens. Estas abordagens, juntamente com o crescente número de modelos de doenças neuromusculares fornecidos por linhas mutantes de peixe-zebra, abrir a porta para uma nova compreensão do ser humano doenças neuromusculares.

Larval zebrafish representar o sistema primeiro modelo vertebrados para permitir a gravação simultânea patch clamp um músculo do neurônio motor e alvo espinhal esquelético. Este vídeo demonstra os métodos microscópicos utilizados para identificar uma CaP segmentar do neurônio motor e células do músculo-alvo, bem como as metodologias para a gravação de cada tipo de célula.

Gravações patch emparelhado Grampo da Motor-neurônio e músculo alvo ósseas em Zebrafish

As larvas de zebrafish representam o primeiro sistema de modelo vertebrado que permite o registro simultâneo por patch clamp de um neurônio motor espinal e do músculo alvo.

O objetivo geral deste procedimento é obter gravações eletrofisiológicas simultâneas do potencial de ação de um neurônio motor e da resposta sináptica associada no músculo-alvo. Isso é realizado primeiramente removendo a pele do lado dorsal do peixe. O segundo passo do procedimento consiste em expor a medula espinhal removendo todas as células musculares dorsais sobrejacentes.O terceiro passo do procedimento consiste em expor o músculo rápido-alvo removendo a camada superior do músculo lento. O passo final do procedimento é realizar o clamp de corrente no neurônio primário coddle ou na célula cap ou no neurônio motor e o clamp de voltagem no músculo esquelético alvo. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram as respostas sinápticas no músculo associadas ao disparo de potenciais de ação do neurônio motor por meio do clamp de corrente simultâneo no neurônio motor e do clamp de voltagem no músculo alvo.O LaVar Super Fish oferecia uma combinação de vantagens, facilitando a gravação de pares de neurônios motores e músculos esqueléticos, permitindo o pequeno tamanho do músculo, um clamp de tensão eficaz, e as características estereotipadas do neurônio motor cap tornam fácil a identificação e o acesso vi. Agora, descreverei passo a passo os procedimentos necessários para estabelecer o patch clamp tanto do neurônio quanto do músculo. Antes de iniciar o procedimento, prepare cinco soluções principais, que incluem: solução de banho, solução de banho com Trica, solução de banho com IDE, solução interna para neurônio e solução interna para músculo.Em seguida, colete um único peixe-zebra larval com idade entre 72 e 96 horas e coloque na solução de banho com trica. Dentro de um minuto após a exposição ao anestésico, o peixe não apresentará resposta ao toque. Coloque o peixe sobre uma placa de plástico e, utilizando um microscópio estereoscópico, seccione a cabeça com uma lâmina de barbear de dupla face.Transfira o peixe para uma câmara de gravação de vidro revestida com sard e preenchida com solução bass. Crie uma aba de pele próxima à extremidade rostral do peixe com um pino, o que proporcionará uma aderência adequada para um par de pinças finas. Remova a pele sobrejacente segurando-a próximo ao pino rostral com um par de pinças finas.Descasque lentamente na direção coddle para remover a pele. Trate o peixe com três mililitros de solução de banho com forma IDE por três a cinco minutos para bloquear contrações musculares que possam interferir nas gravações. Lave cinco vezes com solução de banho normal.Remova parte da camada superficial do músculo em cinco a seis segmentos, raspando suavemente com o lado de um pino de tungstênio. Transfira o peixe para um microscópio em posição vertical localizado dentro de uma gaiola de Faraday para proteger contra ruídos elétricos. O microscópio está equipado com uma platina fixa, objetiva de longa distância de trabalho, 40 x, e zoom de 0,5 a 4 x.O microscópio está montado em uma platina de translação motorizada XY. Para mover a preparação entre o nervo e o músculo com aumento elevado, o uso de óptica de contraste de interferência diferencial auxilia na visualização dos neurônios com zoom de 0,5 x. Utilize uma pipeta de orifício largo de 15 mícrons para remover o músculo sobrejacente e expor a medula espinhal.Aplica-se pressão negativa por meio de uma seringa descartável de três cm³ e as células musculares são removidas uma a uma. Esse procedimento é repetido em cinco a seis segmentos dorsais de músculo esquelético. O mesmo pipeto largo é utilizado também para remover as duas camadas superiores do músculo ventral, a fim de obter o músculo esquelético rápido-alvo.Isso conclui a preparação para gravações pareadas e o zoom do microscópio é aumentado para aproximadamente 1,6 x. Os segmentos limpos são escaneados para localizar os neurônios do capuz. Cada segmento HEMI da medula espinhal contém um grande neurônio motor do capuz com diâmetro de 10 mícrons.Esse soma em forma de gota está localizado superficialmente sob a medula espinhal Jira, próximo à extremidade mais distal do limite segmentar. Um neurônio cap é escolhido para gravação e o segmento coddle associado, bem como o campo muscular ventral alvo, são escaneados para verificar a integridade. Dois eletrodos de patch são posicionados para gravação, um para o neurônio e um segundo para o músculo.O eletrodo superior possui uma ponta cônica suave para penetração da dura-espinhal resistente e uma abertura na ponta de aproximadamente dois micrômetros. O eletrodo inferior tem uma ponta cônica mais acentuada para gravação com clamp de tensão de baixa resistência no músculo esquelético. Posicione o eletrodo neuronal em um ângulo de aproximadamente 30 graus para penetrar a dura-espinhal.Aproximadamente meia metade do segmento rostral ao neurônio com capa selecionado, avance o eletrodo utilizando um manipulador de avanço axial enquanto aplica uma pressão positiva contínua e suave de cerca de 60 milímetros de mercúrio. À medida que o eletrodo atravessa a dura-máter, o neurônio com capa pode ser deslocado pela perfusão proveniente do eletrodo, exigindo um reajuste do foco. Quando o eletrodo toca o SOMA do neurônio com capa, a pressão positiva é liberada e geralmente resulta na formação imediata de um selo giga.No entanto, em alguns casos em que não se forma um selo, torna-se necessário aplicar uma pressão negativa suave. Após a formação do selo, o potencial do eletrodo é ajustado para menos 80 milivolts e a aplicação de pressão negativa rompe a membrana celular. O neurônio do tipo cap é caracterizado por uma resistência de entrada de 140 a 180 megaohms e um potencial de ação que ultrapassa mais 40 milivolts.Isso é testado injetando passos despolarizantes progressivamente crescentes sob fixação de corrente até que o potencial de ação seja elicitedo. Em seguida, o microscópio é reposicionado para o músculo ventral utilizando o tradutor motorizado XY. Em alta potência, uma célula muscular rápida é escolhida a partir do campo-alvo.O eletrodo muscular é avançado em direção à célula muscular-alvo sob pressão positiva, que ao ser liberada forma um selo giga, sendo o potencial do eletrodo ajustado para menos 50 milivolts para inativar os canais de sódio. E sob sucção suave, a membrana celular é rompida. Uma queda na resistência para 100 a 200 megaohms e o aparecimento súbito de grandes transientes capacitivos indicam a entrada no teste para par. Registra-se o neurônio motor enquanto é despolarizado por injeções progressivamente maiores de corrente até que um potencial de ação seja gerado. Nesse momento, uma corrente da junção neuromuscular deve ser evocada no músculo. A estimulação contínua do neurônio motor a um hertz resulta em correntes da junção neuromuscular sem falhas. Quando a frequência do estímulo é aumentada para 100 hertz, as correntes da junção neuromuscular flutuam em amplitude e sofrem esgotamento funcional dentro de 10 segundos de estimulação.Normalmente, a gravação do neurônio é estável por até uma hora, mas as células musculares se deterioram, o que se reflete em um aumento da resistência em série. Quando isso ocorre, o experimento é encerrado ou outra célula muscular é submetida à técnica de patch clamp. Todas as gravações devem ser concluídas dentro de uma hora.Uma vez dominado um par, a gravação pode ser concluída em uma a uma hora e meia. Também é possível obter um ou dois pares adicionais nos segmentos vizinhos. Um dia típico de gravação produzirá dois a três pares.As gravações pareadas de neurônios motores e músculo esquelético oferecem uma oportunidade única para explorar os mecanismos fundamentais da transmissão neuromuscular. Quando utilizadas em conjunto com linhagens de peixes mutantes de motilidade, podem identificar a origem da disfunção neuromuscular e fornecer novas perspectivas sobre os mecanismos subjacentes a doenças humanas, como a síndrome metastática.

paired-patch-clamp-recordings-from-motor-neuron-target-skeletal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O objectivo deste vídeo é demonstrar os procedimentos para a obtenção de células ciliadas saudáveis, intactas a partir dos órgãos do ouvido interno de peixes-zebra adultos e, em seguida, utilizando-os para os estudos de patch clamp para caracterização das propriedades biofísicas dos seus canais dependentes da voltagem.

Gravações patch clamp em células ciliadas da orelha interna Isolado de Zebrafish

Este protocolo descreve uma técnica chamada eletrofisiologia de patch clamp de célula inteira, que é um método para estudar propriedades elétricas de neurônios de Mauthner e outras células reticuloespinhais em embriões de peixe-zebra.

Eletrofisiologia de grampo de remendo de células inteiras: um método para estudar as propriedades elétricas dos neurônios

Este vídeo demonstra um ensaio não invasivo para estudar a eletrofisiologia dos neurônios motores em embriões de peixe-zebra. Ao medir o enrolamento da cauda nos embriões como resultado da despolarização espontânea dos neurônios motores da medula espinhal, um bloqueador dos canais de sódio é aplicado para reduzir a frequência de enrolamento Em seguida, os embriões são imobilizados em agarose e colocados sob um microscópio de fluorescência. Os neurônios motores geneticamente modificados...

Uma abordagem não invasiva para estudar a eletrofisiologia dos neurônios motores em embriões de peixe-zebra

Este vídeo demonstra a gravação de sinais elétricos dos neurônios aferentes em uma larva de peixe-zebra paralisada, posicionando uma micropipeta perto do gânglio da linha lateral e formando uma vedação solta para captura de sinal. A solução extracelular mantém a viabilidade neuronal durante esse processo.

Monitorando sinais elétricos dos neurônios aferentes em uma larva de peixe-zebra imobilizada

Peixe-zebra são um sistema emergente para modelar doenças humanas do músculo esquelético. Nós descrevemos um método rápido e eficiente para isolar fibras musculares do músculo esquelético de peixe-zebra embrionário e larval. Este método conduz a uma preparação de alta densidade de células musculares adequado para o estudo da morfologia da fibra muscular esquelética única, a localização subcelular de proteínas, e da fisiologia do músculo.

Análise de Desenvolvimento Embrionário e larval Zebrafish esqueléticos miofibras de Preparações dissociadas

Nós desenvolvemos uma preparação cordão intacto cérebro espinhal para gravar e monitorar a atividade elétrica através de patches gravação braçadeira dos neurônios e outras células Mauthner reticulospinais em embriões de peixe-zebra. Assim, somos capazes de gravar correntes sinápticas excitatórias e inibitórias, a atividade do canal voltagem-dependentes e potenciais de ação dos neurônios-chave em um embrião em desenvolvimento.

Grampo patch Gravações de Embryonic Cells Zebrafish Mauthner

Este manuscrito descreve métodos para registos electrofisiolicos de neurónios espinais de embriões de peixe-zebra e larvas. A preparação mantém neurónios in situ e muitas vezes envolve a dissecção mínima. Estes métodos permitem o estudo electrofisiológico de uma variedade de neurónios espinais, a partir da aquisição inicial excitabilidade eléctrica através dos primeiros estádios larvares.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

Descrevemos um protocolo para monitorar mudanças na atividade de neurônios diferentes durante comandos motores em um sistema de células ciliadas vertebrados modelo.

Atividade da Linha Lateral Posterior Neurônios Diferentes durante a Natação em Zebrafish

O presente protocolo descreve o isolamento agudo de células musculares lisas cardíacas e vasculares viáveis de zebrafish adulto, juvenil, larval e embrionário (Danio rerio), adequados para estudos eletrofisiológicos.

Isolamento de células musculares lisas cardíacas e vasculares de zebrafish adulto, juvenil, larval e embrionário para estudos eletrofisiológicos

A clareza óptica é uma grande vantagem para o trabalho biológico e fisiológico celular no peixe-zebra. Métodos robustos para a medição do crescimento celular em animais individuais são descritos que permitem novos insights sobre como o crescimento do músculo esquelético e dos tecidos vizinhos são integrados com o crescimento de todo o corpo.

Medição em tempo real e repetida do crescimento muscular esquelético em peixes-zebra vivos individuais submetidos a atividade elétrica alterada

A junção neuromuscular larval do peixe-zebra é um modelo atraente para o estudo da fisiologia sináptica. É passível de muitas técnicas experimentais, incluindo eletrofisiologia e imagens ópticas. Aqui, descrevemos um protocolo para transmissão sináptica de imagem usando uma sonda baseada em pHluorina sob um microscópio de epifluorescência vertical.

Imagens ao vivo da reciclagem de vesículas sinápticas na junção neuromuscular de larvas dissecadas de peixe-zebra

Aprenda a realizar gravações de patch clamp simultâneas em neurônios motores e músculos esqueléticos de larvas de zebrafish. Este método permite analisar a transmissão sináptica neuromuscular em vertebrados vivos.

Gravações patch emparelhado Grampo da Motor-neurônio e músculo alvo ósseas em Zebrafish

Explorar mais vídeos