Gravações patch emparelhado Grampo da Motor-neurônio e músculo alvo ósseas em Zebrafish

O objetivo geral deste procedimento é obter gravações eletrofisiológicas simultâneas do potencial de ação de um neurônio motor e da resposta sináptica associada no músculo-alvo. Isso é realizado primeiramente removendo a pele do lado dorsal do peixe. O segundo passo do procedimento consiste em expor a medula espinhal removendo todas as células musculares dorsais sobrejacentes.

O terceiro passo do procedimento consiste em expor o músculo rápido-alvo removendo a camada superior do músculo lento. O passo final do procedimento é realizar o clamp de corrente no neurônio primário coddle ou na célula cap ou no neurônio motor e o clamp de voltagem no músculo esquelético alvo. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram as respostas sinápticas no músculo associadas ao disparo de potenciais de ação do neurônio motor por meio do clamp de corrente simultâneo no neurônio motor e do clamp de voltagem no músculo alvo.

O LaVar Super Fish oferecia uma combinação de vantagens, facilitando a gravação de pares de neurônios motores e músculos esqueléticos, permitindo o pequeno tamanho do músculo, um clamp de tensão eficaz, e as características estereotipadas do neurônio motor cap tornam fácil a identificação e o acesso vi. Agora, descreverei passo a passo os procedimentos necessários para estabelecer o patch clamp tanto do neurônio quanto do músculo. Antes de iniciar o procedimento, prepare cinco soluções principais, que incluem: solução de banho, solução de banho com Trica, solução de banho com IDE, solução interna para neurônio e solução interna para músculo.

Em seguida, colete um único peixe-zebra larval com idade entre 72 e 96 horas e coloque na solução de banho com trica. Dentro de um minuto após a exposição ao anestésico, o peixe não apresentará resposta ao toque. Coloque o peixe sobre uma placa de plástico e, utilizando um microscópio estereoscópico, seccione a cabeça com uma lâmina de barbear de dupla face.

Transfira o peixe para uma câmara de gravação de vidro revestida com sard e preenchida com solução bass. Crie uma aba de pele próxima à extremidade rostral do peixe com um pino, o que proporcionará uma aderência adequada para um par de pinças finas. Remova a pele sobrejacente segurando-a próximo ao pino rostral com um par de pinças finas.

Descasque lentamente na direção coddle para remover a pele. Trate o peixe com três mililitros de solução de banho com forma IDE por três a cinco minutos para bloquear contrações musculares que possam interferir nas gravações. Lave cinco vezes com solução de banho normal.

Remova parte da camada superficial do músculo em cinco a seis segmentos, raspando suavemente com o lado de um pino de tungstênio. Transfira o peixe para um microscópio em posição vertical localizado dentro de uma gaiola de Faraday para proteger contra ruídos elétricos. O microscópio está equipado com uma platina fixa, objetiva de longa distância de trabalho, 40 x, e zoom de 0,5 a 4 x.

O microscópio está montado em uma platina de translação motorizada XY. Para mover a preparação entre o nervo e o músculo com aumento elevado, o uso de óptica de contraste de interferência diferencial auxilia na visualização dos neurônios com zoom de 0,5 x. Utilize uma pipeta de orifício largo de 15 mícrons para remover o músculo sobrejacente e expor a medula espinhal.

Aplica-se pressão negativa por meio de uma seringa descartável de três cm³ e as células musculares são removidas uma a uma. Esse procedimento é repetido em cinco a seis segmentos dorsais de músculo esquelético. O mesmo pipeto largo é utilizado também para remover as duas camadas superiores do músculo ventral, a fim de obter o músculo esquelético rápido-alvo.

Isso conclui a preparação para gravações pareadas e o zoom do microscópio é aumentado para aproximadamente 1,6 x. Os segmentos limpos são escaneados para localizar os neurônios do capuz. Cada segmento HEMI da medula espinhal contém um grande neurônio motor do capuz com diâmetro de 10 mícrons.

Esse soma em forma de gota está localizado superficialmente sob a medula espinhal Jira, próximo à extremidade mais distal do limite segmentar. Um neurônio cap é escolhido para gravação e o segmento coddle associado, bem como o campo muscular ventral alvo, são escaneados para verificar a integridade. Dois eletrodos de patch são posicionados para gravação, um para o neurônio e um segundo para o músculo.

O eletrodo superior possui uma ponta cônica suave para penetração da dura-espinhal resistente e uma abertura na ponta de aproximadamente dois micrômetros. O eletrodo inferior tem uma ponta cônica mais acentuada para gravação com clamp de tensão de baixa resistência no músculo esquelético. Posicione o eletrodo neuronal em um ângulo de aproximadamente 30 graus para penetrar a dura-espinhal.

Aproximadamente meia metade do segmento rostral ao neurônio com capa selecionado, avance o eletrodo utilizando um manipulador de avanço axial enquanto aplica uma pressão positiva contínua e suave de cerca de 60 milímetros de mercúrio. À medida que o eletrodo atravessa a dura-máter, o neurônio com capa pode ser deslocado pela perfusão proveniente do eletrodo, exigindo um reajuste do foco. Quando o eletrodo toca o SOMA do neurônio com capa, a pressão positiva é liberada e geralmente resulta na formação imediata de um selo giga.

No entanto, em alguns casos em que não se forma um selo, torna-se necessário aplicar uma pressão negativa suave. Após a formação do selo, o potencial do eletrodo é ajustado para menos 80 milivolts e a aplicação de pressão negativa rompe a membrana celular. O neurônio do tipo cap é caracterizado por uma resistência de entrada de 140 a 180 megaohms e um potencial de ação que ultrapassa mais 40 milivolts.

Isso é testado injetando passos despolarizantes progressivamente crescentes sob fixação de corrente até que o potencial de ação seja elicitedo. Em seguida, o microscópio é reposicionado para o músculo ventral utilizando o tradutor motorizado XY. Em alta potência, uma célula muscular rápida é escolhida a partir do campo-alvo.

O eletrodo muscular é avançado em direção à célula muscular-alvo sob pressão positiva, que ao ser liberada forma um selo giga, sendo o potencial do eletrodo ajustado para menos 50 milivolts para inativar os canais de sódio. E sob sucção suave, a membrana celular é rompida. Uma queda na resistência para 100 a 200 megaohms e o aparecimento súbito de grandes transientes capacitivos indicam a entrada no teste para par.

Registra-se o neurônio motor enquanto é despolarizado por injeções progressivamente maiores de corrente até que um potencial de ação seja gerado. Nesse momento, uma corrente da junção neuromuscular deve ser evocada no músculo. A estimulação contínua do neurônio motor a um hertz resulta em correntes da junção neuromuscular sem falhas. Quando a frequência do estímulo é aumentada para 100 hertz, as correntes da junção neuromuscular flutuam em amplitude e sofrem esgotamento funcional dentro de 10 segundos de estimulação.

Normalmente, a gravação do neurônio é estável por até uma hora, mas as células musculares se deterioram, o que se reflete em um aumento da resistência em série. Quando isso ocorre, o experimento é encerrado ou outra célula muscular é submetida à técnica de patch clamp. Todas as gravações devem ser concluídas dentro de uma hora.

Uma vez dominado um par, a gravação pode ser concluída em uma a uma hora e meia. Também é possível obter um ou dois pares adicionais nos segmentos vizinhos. Um dia típico de gravação produzirá dois a três pares.

As gravações pareadas de neurônios motores e músculo esquelético oferecem uma oportunidade única para explorar os mecanismos fundamentais da transmissão neuromuscular. Quando utilizadas em conjunto com linhagens de peixes mutantes de motilidade, podem identificar a origem da disfunção neuromuscular e fornecer novas perspectivas sobre os mecanismos subjacentes a doenças humanas, como a síndrome metastática.