Name: In vivo e in vitro de Estudos Adaptor-clathrin Interação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T23:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 14 s
Description: Aprenda a analisar interações entre clatrina e proteínas adaptadoras em leveduras usando microscopia confocal e ensaios de pull-down. Este método permite estudar a dinâmica da endocitose mediada por clatrina em células vivas.

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DF é apoiado por uma Bridges NSF à comunhão Doutorado. O microscópio utilizado neste trabalho é apoiado em parte pela Microscope Imaging Network infra-estrutura básica bolsa da Colorado State University. Trabalho em adaptadores de clatrina no laboratório do autor é apoiado pela CSU start-up de fundos e de atribuição da American Heart Association 09SDG2280525 para SD

1. Incorporação de uma tag GFP e marcador selecionável no gene SLA1 Aplicar o método Longtine 17, a fim de fundir um tag GFP diretamente na extremidade 3 'do gene SLA1 quadro de leitura aberto (Sla1p C-terminal) e, simultaneamente, marcar o gene com a E. coli kan gene r que permite a seleção G418. <ol><li> Gerar um fragmento de DNA por PCR usando como modelo o plasmídeo pFA6a-GFP (S65T) kanMX6-18 e os seguintes primers: para a frente, 5'-CA AGG AAC AAC GCC ATA AAT GCT TTC ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG ATT ATT AA-3 ', e reverter, 5'-AGC TTG CA TAT TTT TAG TTA TTA TCC TAT AAA ATC TTA AAA TAC ATT AAT GAA GAG CTC TTC GTT TAA AC-3'. A seqüência sublinhada corresponde ao segmento de gene específico SLA1 imediatamente anterior (forward primer) e seguindo o códon de parada (primer reverso). Isolar o produto de PCR por eletroforese em gel de agarose, seguida de purificação do DNA. </li><li> Prepare a 50 ml cultura S. cerevisiae cepa SEY6210 (MAΤα ura3-52, leu2-3, 112 his3-Δ200, trp1-Δ901, lys2-801, suc2 Δ9-GAL-MEL) 19 em YPD, crescendo a fase logarítmica precoce (OD 600 = 0,2-0,6). Giram em temperatura ambiente por 3 min a 2.000 xg, lave duas vezes com água estéril. </li><li> Transformar o fragmento de PCR obtido na etapa 1 para dentro das células usando o procedimento de acetato de lítio 20. Lavar as células com 1 ml de água estéril, adicionar 1 ml YPD e incubar por 4 h, a 30 ° C em um agitador. </li><li> Espalhe a células em YPD-G418 placas selecionar para G418-resistente transformantes, incubar a 30 ° C por 2-3 dias. Escolha colônias e raia-los em YPD-G418 placas. </li><li> Utilizando-colônia PCR, identificar transformantes em que o módulo GFP-kan foi devidamente integrado com o SLA1 seqüências de genes por recombinação homóloga. Use uma cartilha para a frente que anneals dentro do quadro de leitura SLA1 aberto e um primer reverso que anneals no interior do módulo GFP-kan. Identificar colônias que produtos de PCR tem o tamanho esperado e verificar por seqüenciamento. </li><li> Tela de colônias por microscopia de fluorescência para confirmar que eles têm de fluorescência da GFP. </li></ol> 2. Mutação da caixa variante clatrina (VCB) no gene SLA1 <ol><li> Introduzir um LLDLQ para AAALQ mutação no gene SLA1 (nucleotídeos 2407-2415) após uma abordagem em duas fases 15. </li><li> Em primeiro lugar, ampliar SLA1 nucleotídeos 1207-1410 e 2427-2589 pelo PCR e clonar os fragmentos em NotI / BamHI e EcoRI / SalI locais de pBluescriptKS, respectivamente. </li><li> Subclone para os sites BamHI / EcoRI um fragmento de PCR contendo URA3. </li><li> Cleave o plasmídeo resultante com NotI / SalI, isolar o fragmento URA3 de purificação gel, e introduzi-la por transformação de lítio de acetato para a cepa Sla1-GFP gerado na parte 1, ou em TVY614 (MATA ura3-52-3112 leu2 his3-Δ200 trp1 -Δ901 lys2-801-suc2 Δ9 pep4:: LEU2 prb1:: HISG prc1:: HIS3) 21. </li><li> Espalhe a células em placas SD complementada falta uracil. Confirme colônia-PCR e seqüenciamento que o Ura + colônias conter URA3 devidamente integradas substituindo o fragmento VCB. </li><li> Em uma segunda etapa, subclone SLA1 nucleotídeos 1207-2589 em NotI / SalI locais de pBluescriptKS. Usando o QuickChange-XL-site dirigido mutagênese kit (Stratagene), os resíduos transformam VCB LLDLQ para AAALQ. Verifique por seqüenciamento. </li><li> Cleave a construção resultante com BSGI / AgeI, e isolar o VCB mutante contendo fragmento de purificação gel. Cotransform o fragmento BSGI / AgeI com pRS313 (HIS3) 22 na tensão obtido na parte 2.3. </li><li> Espalhe as células na complementada placas SD sem histidina. Réplica da placa-Seu colônias + em meio de agar contendo ácido 5-fluorotic para identificar as células em que as seqüências mutantes substituído URA3, assim, regenerar o gene que contém a sla1 LLDLQ para AAALQ mutação (sla1 AAA). Confirme colônia-PCR e seqüenciamento. </li></ol> 3. Microscopia de fluorescência <ol><li> Crescem as cepas de levedura Sla1-GFP e sla1 AAA-GFP gerado nas partes 1 e 2 em 4 ml de suplementada SD media a 30 ° C em um rotador no escuro até chegar a um OD 600 = 0,1-0,4. Spin-1 ml de cultura em microcentrífuga a 4.000 xg por 1 min em temperatura ambiente. Descartar ~ 950 mL do sobrenadante. Ressuspender as células do líquido restante (~ mL 50). </li><li> Depósito mL 3 da suspensão de células sobre uma lâmina de microscopia e cobrir com uma lamela de vidro. Proteger a amostra da luz. </li><li> Montagem de slides em uma objetiva de imersão em óleo 100x de um microscópio confocal girando-disco. </li><li> Localize plano focal correta de células usando brightfield iluminação ou a laser 488 nm com filtros adequados para excitar e detectar fluorescência de GFP. </li><li> Captura de lapso de tempo imagens de Sla1-GFP e sla1 AAA-GFP em células com tempo de exposição de 500 ms (ou o valor apropriado) em umn intervalo de uma imagem por segundo para 150 segundos. Resultado esperado: punctae GFP rotulados irá aparecer na superfície interna de limitar membrana da célula, persistir por vários segundos, e se mover em direção ao centro da célula como o sinal desaparece rapidamente (indicando casaco desmontagem). </li><li> Selecione uma parte de uma imagem em que pontos são vistos como aparecem, permanecem por vários segundos, e desaparecem. Safra deste seção da imagem para cada quadro das imagens de lapso de tempo. </li><li> Gerar um quimógrafo representando esta seção da imagem em cada quadro dos 150 imagem lapso de tempo segundo, alinhando os quadros ao longo de um eixo de correspondente ao tempo decorrido. </li><li> Calcular a duração de cada local com base em quantos segundos (time-lapse frames) os pontos está presente no quimógrafo. Note-se que cada ponto deve "curva" em direção ao interior da célula, uma vez que está desaparecendo, refletindo endocitose e desmontagem da pelagem. </li><li> Compare tipo selvagem Sla1-GFP com sla1 AAA-GFP. Repita o procedimento para determinar se os resultados são estatisticamente significativos. Resultado esperado: sla1 AAA-GFP manchas persistem significativamente maior (~ 80 seg) do que do tipo selvagem (~ 30 seg), indicando um defeito na formação da camada 15. </li></ol> 4. Preparação de extrato de levedura e extracto citosólico total de células <ol><li> Inocular 3 litros de YPD com uma cepa de levedura apropriadas, como TVY614 21, e crescer a 30 ° C em uma incubadora shaker até atingir uma OD 600 = 1-2. </li><li> Centrifugar a cultura de levedura em temperatura ambiente por 20 min a 3.700 x g. Desprezar o sobrenadante, adicionar 3-5 ml de água estéril, e pipeta para cima e para baixo até que o chumbinho é completamente ressuspenso. </li><li> Despeje ~ 150 ml de nitrogênio líquido em um copo plástico de 250 ml. Flash-congelar o fermento, adicionando gotas no nitrogênio líquido em um padrão circular para evitar a aglutinação das pelotas congelados. Não deixe que o degelo pellets, adicione mais nitrogênio líquido, se necessário. </li><li> Frio um recipiente de aço inox liquidificador, vertendo o nitrogênio líquido. Permitir que o nitrogênio líquido para evaporar quase completamente. Adicione o fermento pellets congelados para o recipiente liquidificador frio. Feche o recipiente liquidificador com uma rolha de borracha frio e moer os pellets de levedura por 10 segundos. Inverter o recipiente 3-4 vezes para misturar o conteúdo e repita a etapa de moagem duas vezes. A levedura solo congelado terá uma aparência como um pó. </li><li> Frio um funil e um tubo de 50 ml com nitrogênio líquido. Utilizando o funil frio, transfira o fermento solo para o tubo. A levedura solo congelado pode ser armazenar a -80 ° C ou usado imediatamente. </li><li> Para obter o extrato de citosólica para o ensaio de afinidade GST-proteína de fusão (Parte 5), 3 g de peso do solo congelado TVY614 fermento em um tubo de 15 ml cônico e ressuspender em 3 ml de tampão A temperatura ambiente (10 mM HEPES, pH 7.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) contendo coquetel de inibidores da protease (Sigma). </li><li> Tampa e inverter o tubo várias vezes até que esteja completamente descongelado e depois colocar no gelo. </li><li> Ultracentrífuga o extrato a 4 ° C por 20 min a 300.000 x g. Transferir cuidadosamente o (extracto citosólico) sobrenadante para um tubo cônico com uma pipeta sem perturbar o sedimento. Manter o extrato citosólica no gelo. </li><li> Adicionar 100 l de um 50% (v / v) O chorume glutationa-Sepharose em tampão A. É conveniente cortar a extremidade da ponta, a fim de facilitar a pipetagem as contas. Gire a 4 ° C por 15 min, spin-down as contas por centrifugação a 4 ° C por 2 min a 1.000 xg, e transferir o (extracto citosólico) sobrenadante para um novo tubo. Reserve mL 50 de extrato para controle de entrada. </li><li> Para obter extratos de células total para co-imunoprecipitação experimentos (parte 6), use tensão TVY614 (WT SLA1), a cepa sla1 AAA carregando um LLDLQ para AAALQ mutação gerada em Part 2 em TVY614 fundo, e uma cepa sla1 carregando uma supressão do SLA1 gene, tais como GPY3130 23. G peso 2 da levedura terreno correspondente congelados em tubos cônicos e ressuspender-los em 2 ml de tampão A temperatura ambiente, contendo coquetel de inibidores da protease (Sigma) e 2% Triton X-100. </li><li> Tampa e inverter o tubo várias vezes até que esteja completamente descongelado e depois incubar no gelo durante 10 min, periodicamente, misturando por inversão. </li><li> Transferir o material para tubos de microcentrífuga e girar a 4 ° C por 15 min a 16.000 xg (velocidade máxima em microcentrífuga). Transferir cuidadosamente o sobrenadante (extrato celular total) para um tubo cônico no gelo utilizando uma pipeta sem perturbar o sedimento. </li><li> Adicionar 100 ul de uma proteína de 50% (v / v) A-Sepharose suspensão em tampão A. Gire a 4 ° C por 15 min, spin-down as contas por centrifugação a 4 ° C por 2 min a 1.000 xg, e transferência o sobrenadante (extrato total) para um novo tubo. Reserve mL 50 de extrato para controle de entrada. </li></ol> 5. GST-fusion ensaio de afinidade de proteínas <ol><li> Amplificar por PCR um fragmento containing a variante Sla1p caixa-clatrina (VCB) (resíduos 803-807), cloná-lo em pGEX-5X para obter pGEX-5X-VCB. Verifique por seqüenciamento. </li><li> Usando pGEX-5X-VCB como um modelo e os QuickChange-XL-site dirigido mutagênese kit (Stratagene), mutação da VCB resíduos LLDLQ AAALQ para obter pGEX-5X-vCBmut. Verifique por seqüenciamento. </li><li> Expressar GST e proteínas de fusão GST-VCB e GST-vCBmut em E. coli (BL21 DE3), purificar usando glutationa-Sepharose, saem da contas com glutationa reduzida, diálise contra PBS, e determinar a concentração de proteína. </li><li> Tubos de microcentrífuga etiqueta 3: GST, GST-VCB e GST-vCBmut, e adicionar 1 ml de PBS, 30 mL de um 50% (v / v) O chorume glutationa-Sepharose em tampão A, e 50 mcg de dialized GST, GST -VCB, ou proteínas GST-vCBmut fusão. </li><li> Girar em temperatura ambiente por 30 min para permitir a ligação. </li><li> Lave as contas duas vezes com PBS e uma vez com tampão A. Adicionar 1 ml de extrato de levedura citosólica - preparado como descrito na Parte 4 - a cada tubo. </li><li> Girar os tubos de 1 h, a 4 ° C, rotação de 10 segundos a 5.000 xg para agregar as contas, descartar o sobrenadante e, rapidamente, lave as contas 3 vezes com tampão A contendo 0,1% de tempo Triton X-100, e 1 com tampão A. </li><li> Spin para baixo as contas mais uma vez e usando uma ponta de carga gel remover o líquido que for possível. Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C para continuar em um momento posterior. </li><li> Adicionar 15 mL de tampão de amostra Laemmli 2x a cada tubo, incubar a 96 ° C por 5 min e 10 seg girar em 5.000 x g. </li><li> Analisar as amostras por immunoblotting usando um anticorpo para a cadeia clathrin pesado. Resultados esperados: clathrin liga-se a GST-VCB, mas não para GST ou GST-vCBmut. Também analisar as amostras por SDS-PAGE para confirmar o carregamento semelhante das proteínas de fusão GST. </li></ol> 6. Co-imunoprecipitação ensaio <ol><li> Tubos de microcentrífuga etiqueta 3: WT (wild type SLA1), sla1 AAA, e sla1Δ, e adicionar 1 ml de PBS, 30 mL de uma proteína de 50% (v / v) A-Sepharose suspensão em tampão A, e 2 mg de um coelho de anticorpos anti-Sla1p. </li><li> Girar em temperatura ambiente por 30 min. </li><li> Lave as contas duas vezes com PBS e uma vez com tampão A contendo 1% de Triton X-100. </li><li> Adicionar 1 ml do correspondente total de extratos de levedura preparada na Parte 4: SLA1, sla1 AAA, e sla1Δ. Girar 1 h, a 4 ° C. </li><li> Rotação de 10 segundos a 5.000 xg para agregar as contas, descartar o sobrenadante e, rapidamente, lave as contas 3 vezes com tampão A contendo 0,1% Triton X-100, e uma vez com tampão A. </li><li> Spin para baixo as contas mais uma vez e usando uma ponta de carga gel remover o líquido que for possível. Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C para continuar em um momento posterior. </li><li> Adicionar 15 mL de tampão de amostra Laemmli 2x a cada tubo, incubar a 96 ° C por 5 min e 10 seg girar em 5.000 x g. </li><li> Analisar as amostras por immunoblotting usando um anticorpo para a cadeia clathrin pesado. Resultados esperados: clathrin co-imunoprecipitados com Sla1p tipo selvagem, mas não com sla1 AAA, ou na amostra sla1Δ. </li></ol> 7. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Análise de Sla1p adaptador de clatrina em locais endocítica de células vivas por microscopia de fluorescência. Um quadro (esquerda) de um vídeo e kymographs correspondente (direita) de células de levedura expressar Sla1-GFP ou sla1 AAA-GFP carregando um LLDLQ à mutação AAALQ. Tanto do tipo selvagem e mutante Sla1-GFP foram expressas a partir do locus SLA1 endógena. Endocítica locais são observadas como pontos brilhantes distribuídos na periferia da célula (imagens à esquerda). A área entre as linhas brancas corresponde à região de onde kymographs foram gerados. Filmes foram tiradas a uma taxa de quadros de 1 frame / sec. Observe a vida útil mais longa da Sla1-GFP na LLDLQ para AAALQ mutante (sla1 AAA) em relação ao tipo selvagem (SLA1). <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Interação física entre clatrina ea caixa Sla1p variante-clatrina. GST fundido a Sla1p fragmento aa798-813 contendo a seqüência LLDLQ (GST-VCB), o correspondente AAALQ mutante (GST-vCBmut), ou GST sozinho (GST) eram obrigados a glutationa-Sepharose contas e incubadas com um extrato de wild-citosólica levedura células tipo. As proteínas associadas foram eluídos e analisadas por immunoblotting (IB) para cadeia pesada clatrina.

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<li>Piao, H. L., Machado, I. M., Payne, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPFXD-mediated+endocytosis+is+required+for+polarity+and+function+of+a+yeast+cell+wall+stress+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor.</a> Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Vesículas revestidas por clatrina (CCV) participar de endocitose e transporte do trans Golgi rede e endossomos, vias conservadas que são fundamentais para a biologia célula eucariótica. As abordagens descritas neste trabalho métodos são úteis para estudar os mecanismos moleculares responsáveis ​​pela formação CCV, em especial as interações entre proteínas e adaptador de clatrina. GST-fusion afinidade proteínas e co-imunoprecipitação ensaios permitir o teste de associação física entre um adaptador (candidatos) e...

<table border="1"><th> Material </th><th> Companhia </th><tbody><tr><td> QuickChange-XL-site dirigido mutagênese kit </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> protease cocktail inibidor </td><td> Sigma </td></tr></tbody></table>

in vivo e in vitro de estudos adaptor-clathrin interação

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

A principal via endocítica inicia com a formação de vesículas revestidas por clatrina (CCVS) que transportam cargas da superfície da célula para endossomos 1-6. CCVS distinguem-se por uma estrutura poliédrica de clatrina que reveste a vesícula de membrana e serve como um andaime mecânico. Clatrina casacos são montados durante a formação das vesículas de indivíduo triskelia clathrin, a forma solúvel de clatrina composto por três subunidades de pesos leves e três de cadeia 7,8. Porque o triskelion não tem a capacidade de se ligar à membrana diretamente, clathrin adaptadores de ligação são críticos para ligar a malha formando clatrina para a membrana através da associação com lipídios e / ou proteínas da membrana 9. Adaptadores também pacote de carga proteína transmembrana, como receptores, e podem interagir entre si e com outros componentes da formação CCV máquinas 9. Mais de vinte adaptadores clathrin têm sido descritos, diversos estão envolvidos na endocitose mediada clathrin localizar e outros para o Golgi trans rede ou endossomos 9. Com a exceção de HIP1R (levedura Sla2p), todos os adaptadores conhecidos clathrin ligar para o domínio N-terminal da hélice da cadeia clathrin pesados ​​9. Adaptadores são proteínas clatrina modular composta de domínios cruzados conectados por não estruturados linkers flexível. Dentro destas regiões linker, curto motivos de ligação mediar interações com o domínio N-terminal clatrina ou outros componentes da formação de vesículas máquinas 9. Dois distintos clatrina-binding motivos foram definidos: a caixa de clatrina e do W-box 9. O consenso seqüência clatrina-box foi inicialmente definido como L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10, mas variantes foram descobertas posteriormente 11. O W-box está em conformidade com o PWxxW seqüência (onde x é qualquer resíduo). Sla1p (Lethal sintético com ligação às proteínas actina-1) foi originalmente identificado como uma proteína de actina associados e é necessário para a estrutura normal de actina do citoesqueleto e dinâmicas em locais endocítica em células de levedura 12. Sla1p também se liga o sinal de triagem NPFxD endocítica e é fundamental para endocitose de carga que transportavam o sinal NPFxD 13,14. Mais recentemente, foi demonstrado Sla1p para ligar clatrina através de um motivo semelhante à caixa de clatrina, LLDLQ, denominado uma variante caixa-clatrina (VCB), e funcionar como um adaptador endocítica clathrin 15. Além disso, Sla1p tornou-se um marcador muito utilizado para o revestimento endocítica em células vivas estudos de microscopia de fluorescência 16. Aqui usamos Sla1p como um modelo para descrever abordagens para estudos adaptador clathrin interação. Nós nos concentramos em microscopia de fluorescência de células vivas, GST-pull down, e co-imunoprecipitação métodos.

Clatrina-endocitose mediada depende de proteínas adaptadoras que coordenam a seleção de carga e montagem casaco de clatrina. Aqui nós descrevemos os procedimentos para estudar adaptador clathrin interação física e imagens de células vivas abordagens utilizando como modelo a levedura Sla1p proteína endocítica adaptador.

In vivo e in vitro de Estudos Adaptor-clathrin Interação

Uma importante via endocítica inicia-se com a formação de vesículas revestidas por clatrina (CCVs) que transportam a carga da superfície celular para os endossomos1-6. As CCVs...

Durante a endocitose mediada por clatrina, uma rede poliédrica de clatrina é ligada a proteínas ou lipídios da membrana por meio de proteínas adaptadoras ligadoras de clatrina, como a SLA1; a SLA1 liga-se à clatrina por meio de sua caixa de clatrina variante ou VCB. Neste vídeo, três métodos são utilizados para análise das interações entre clatrina e SLA1. Primeiro, células de levedura expressando SLA1 nativa e mutante VCB marcada com GFP são visualizadas utilizando microscopia confocal de disco giratório.Os filmes com lapso de tempo são então analisados para determinar o efeito da mutação na cinética da endocitose. Em segundo lugar, extratos citosólicos de levedura são preparados a partir de células selvagens como fonte de clatrina, e ensaios de precipitação por proteína de fusão G-S-T-V-C-B são realizados para examinar a interação entre clatrina e VCB in vitro. Em terceiro lugar, extratos totais são preparados a partir de células de levedura que expressam formas nativas e mutantes de VCB.As precipitações de SLA um e coimunoprecipitações são realizadas para examinar a mutação efetiva na afinidade da ligação do SLA um com a clatrina in vivo. Em última análise, os dados obtidos most

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A célula permeável reticulador DSP [dithiobis (succinimidyl propionato)] estabiliza interações transitória e...

Isolamento de proteínas lábeis Multi-Complexos por In vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Imuno-magnética cromatografia de afinidade

Este vídeo mostra experimentos com posterior análise de interações proteína-proteína através da utilização de micro-padrão superfícies. A abordagem oferece a possibilidade de detectar as interações de proteínas em células vivas e combina alta capacidade de processamento com a possibilidade de extrair informações quantitativas.

In vivo Detecção de interações proteína-proteína em Micro-padrão Superfícies

A localização subcelular de proteínas é importante para determinar a regulação espaço-temporal de sinalização celular. Aqui, descrevemos complementação bimolecular de fluorescência (BiFC) como um método simples para monitorar as interações espaciais de proteínas na célula.

Complementação de fluorescência bimolecular

A fibrose cística regulador da condutância transmembranar (CFTR), um canal de cloreto epitelial, tem sido relatado para interagir com várias proteínas e regulam importantes processos celulares, entre eles os CFTR PDZ motivo mediadas-interacções têm sido bem documentados. Este protocolo descreve métodos desenvolvidos para montar um macromolecular CFTR PDZ-dependente sinalização...

Análise in vitro de PDZ-dependentes Complexos Macromoleculares CFTR Sinalização

Um método de rastreio de alto conteúdo para a identificação de novos receptores de sinalização transmembrana competentes é descrito. Este método é passível de automatização em larga escala e permite previsões...

Um fluxo de trabalho de imagem de alta de conteúdo para estudar Grb2 Complexos de Sinalização por clonagem de expressão

endocitose mediada por clatrina, um processo rápido e altamente dinâmico internaliza muitas proteínas, incluindo receptores de sinalização. O protocolo descrito aqui visualiza diretamente a cinética de eventos endocíticos individuais. Isso é essencial para entender como os membros centrais da maquinaria endocítica se coordenam entre si e como a carga de proteínas influencia esse processo.

Visualizando Endocitose clatrina mediada por receptores acoplados à proteína a resolução de evento único através de microscopia TIRF

A oligomerização do receptor de rianodina, um canal iônico homotetramérico que medeia a liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares, é crítica para a contração do músculo esquelético e cardíaco. Aqui, apresentamos métodos complementares in vivo e in vitro para detectar a autoassociação de proteínas e determinar a estequiometria de homo-oligômero.

Abordagens genéticas e bioquímicas para<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; Avaliação de oligomerização da proteína: A Case Study rianodina Receptor

Aqui, descrevemos um procedimento para visualizar e quantificar com alta sensibilidade as interações endógenos entre o retículo endoplasmático e mitocôndrias nas células fixas. O protocolo apresenta um otimizado no ensaio de ligação de proximidade situ visando o inositol 1,4,5-trifosfato de receptor / proteína regulada por glucose 75 / complexo D canal de ânions / ciclofilina dependente da tensão na interface membrana associada à mitocôndria.

Estudo do retículo endoplasmático e mitocôndrias Interações por<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidade Ligadura Ensaio em células fixas

Funções de endossomo precoce dependem de polimerização de F-Actina. Aqui, descrevemos um ensaio baseado em microscopia em vitro que reconstitui a nucleação e polimerização de F-Actina nas membranas de CDDP precoce em tubos de ensaio, tornando assim esta complexa série de reações passíveis de bioquímicos e genéticos manipulações.

In Vitro Polimerização de F-Actina no início endossomos

Apresentado aqui é um protocolo para a determinação do estado oligomerico de proteínas de membrana que utiliza um sistema de nanopartículas de membrana celular nativa em conjunto com microscopia eletrônica.

Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análise de interação proteína-proteína de membrana

O protocolo apresenta um método para ligação covalente in vivo de biotina a proteínas com base em sua proximidade a uma biotina ligase fundida a uma proteína de interesse. Essa modificação permite um enriquecimento seletivo das proteínas usando grânulos de estreptavidina, conforme necessário em estudos de interação proteica.

In vivo Biotinilação de proximidade para estudos de interação proteica em Paramecium tetraurelia

Aprenda a analisar interações entre clatrina e proteínas adaptadoras em leveduras usando microscopia confocal e ensaios de pull-down. Este método permite estudar a dinâmica da endocitose mediada por clatrina em células vivas.

In vivo e in vitro de Estudos Adaptor-clathrin Interação

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