Name: Transfecção e Mutagênese de genes alvo em células de mosquito por Locked de ácido nucléico modificados Oligonucleotídeos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprenda mutagênese dirigida em células de mosquito Anopheles usando oligonucleotídeos de ácido nucleico bloqueado. Este método permite substituição precisa de nucleotídeos para estudos de função gênica.

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Gostaríamos de agradecer a Abbie Spinner no Centro de Pesquisa California National Primate por sua assistência com citometria de fluxo. Este estudo foi suportado por financiamento do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID) dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) AI073745, AI080799 e AI078183.

<ol><li> Antes de iniciar o protocolo, é importante determinar que as células de mosquitos utilizados no experimento são saudáveis ​​e na confluência ~ 80% se aderente (Figura 1). Abandonada células ou insalubre resultará em eficiência de transfecção baixo e dará resultados inconsistentes. </li><li> Aquecer toda a mídia antes do uso em um banho de água 28 ° C por 30 minutos. <ol class="lalpha"><li> A. stephensi MSQ43 células requerem E5 médio: MEM, w Earle / glutamina, 5% de calor FCS inativada, 0,2% D-glucose, 1% de antibiótico penicilina-estreptomicina, e 1% não-aminoácidos essenciais. </li><li> Células A. gambiae SUA5B exigem médias S2: Drosophila Schneider média, 5% de calor FCS inativada, e 1% de penicilina-estreptomicina antibiótico </li></ol></li><li> Descongelar e armazenar todos os materiais reagentes de transfecção, plasmídeos, e oligonucleotides no gelo. </li><li> Todos os procedimentos devem ser realizados em uma capa de cultura de tecido usando a técnica estéril. </li><li> Para células aderentes (A. gambiae SUA5B, A. stephensi MSQ43) aspirado de fora a velha mídia, sem perturbar as células, adicionar um volume equivalente de mídia fresco que foi aquecido a 28 ° C, e em seguida enxaguar as células da parte inferior do frasco utilizando uma pipeta. </li><li> A concentração de células deve ser determinada e ajustada para uma concentração final de 1x10 6 células / mL. As células podem ser mantidas à temperatura ambiente durante a preparação de materiais reagentes de transfecção. </li><li> Adicionar 1 mL de células de mosquito (1x10 6 células / mL) a cada poço de uma placa de seis poços. Configurar uma placa para cada condição experimental (ver abaixo). Tabela I é um esquema de pipetagem para uma transfecção geral. Tabela II apresenta cinco condições para testar a mutagênese bem-sucedida de um único nucleotídeo usando BFP específicos LNA-ons. Os dois primeiros, e pGFP pBFP, são controles positivos e negativos, respectivamente. Os restantes são condições experimentais de pBFPs com concentrações crescentes de BFP específicos LNA-ons. Em etapas de 8 a 12, adicionar volumes de reagente apropriados de acordo para cada condição. </li><li> Transferência de DNA plasmidial a um tubo de microcentrífuga estéril 1,5 mL e adicionar o volume adequado de tampão de CE. <ol class="lalpha"><li> Para 1 mL de DNA plasmídeo (1 mg / mL), adicionar 99 mL de tampão CE. </li><li> Para 1 mL pGFP (1μg / mL), adicionar 99 mL de tampão CE. </li><li> Para 1 mL pBFP (1μg / mL), adicionar 99 mL de tampão CE. </li><li> Para 1 mL pBFP (1μg / mL) e 1 mL ON (mcg / mL), adicionar 98 mL de tampão CE. </li><li> Para 1 mL pBFP (1μg / mL) e 5 mL ON (1μg / mL), adicionar 94 mL de tampão CE. </li><li> Para 1 mL pBFP (1μg / mL) e 10 mL ON (1μg / mL), adicionar 89 mL de tampão CE. </li></ol></li><li> Em seguida, adicionar lentamente Enhancer por 1 mg de DNA usado. <ol class="lalpha"><li> Para 1 mL de DNA plasmídeo, adicionar 8 mL Enhancer. </li><li> Para 1 pGFP mL, adicionar 8 mL Enhancer. </li><li> Para 1 pBFP mL, adicionar 8 mL Enhancer. </li><li> Para 1 pBFP mL e 1 mL ON, adicionar 16 mL Enhancer. </li><li> Para 1 pBFP mL e 5 mL ON, adicionar 48 mL Enhancer. </li><li> Para 1 pBFP mL e 10 mL ON, adicionar 88 mL Enhancer. </li></ol></li><li> Vortex DNA / buffer / Enhancer mistura por 1 segundo e certifique-se toda a solução está no fundo do tubo. Incubar à temperatura ambiente por 5 min. </li><li> Adicionar reagente Effectene por 1 mg de DNA plasmídeo e vortex por 10 seg. Confirmar que toda a solução está no fundo do tubo e incubar à temperatura ambiente por 10 min. <ol class="lalpha"><li> Para 1 mL de DNA plasmídeo, adicionar 10 mL Effectene (Tabela I). </li><li> Para 1 pGFP mL, adicionar 10 mL Effectene (Tabela II). </li><li> Para 1 pBFP mL, adicionar 10 mL Effectene (Tabela II). </li><li> Para 1 pBFP mL e 1 mL ON, adicionar 20 mL Effectene (Tabela II). </li><li> Para 1 pBFP mL e 5 mL ON, adicionar 60 mL Effectene (Tabela II). </li><li> Para 1 pBFP mL e 10 mL ON, adicionar 110 mL Effectene (Tabela II). </li></ol></li><li> Trazer cada tubo para um volume final de 1000 mL, adicionando media aquecido gota a gota à mistura de DNA / buffer / Enhancer / Effectene. DNA pode precipitar neste momento se a mídia for adicionada muito rapidamente. Misture suavemente pipetando cima e para baixo 3-4 vezes. <ol class="lalpha"><li> Para 1 mL de DNA plasmídeo, adicione 882 mL de mídia (Tabela I). </li><li> Para 1 pGFP mL, adicionar mídia mL 882 (Tabela II). </li><li> Para 1 pBFP mL, adicionar mídia mL 882 (Tabela II). </li><li> Para 1 pBFP mL e 1 mL ON, adicionar 864 mL de mídia (Tabela II). </li><li> Para 1 pBFP mL e 5 mL ON, adicionar 792 mL de mídia (Tabela II). </li><li> Para 1 pBFP mL e 10 mL ON, adicionar media 702 mL (Tabela II). </li></ol></li><li> Em seguida adicione lentamente 1 mL da mistura de DNA / Enhancer / Effectene apropriada a cada poço uma gota de cada vez. </li><li> Agite ligeiramente a placa para garantir a distribuição uniforme das células e mistura de transfecção. Incubatcélulas e em condições de crescimento normal. </li><li> Um dia após a transfecção, aspirar cuidadosamente para fora da mídia e, lentamente, substitua-o por um volume equivalente de mídia recém-aquecido. É importante para não perturbar as camadas de células no fundo dos poços ao fazer isto. </li><li> Dois dias após transfecção examinar células transfectadas com controle positivo pGFP sob microscópio de fluorescência para determinar a eficiência de transfecção (Figura 2). </li><li> SUA5B células crescem muito rapidamente e se tornará overgrown. Quatro dias após transfecção destas células finas por aspiração a velha mídia e adicionando lentamente um volume equivalente a mídia recém-aquecido. </li><li> Após a adição de novas mídias para os poços, retire todas as células do fundo de cada poço por pipetagem cima e para baixo, descarte de metade do volume (1 mL) da mistura de células e adicionar 1 mL de mídia fresco aquecido para trazer o volume final de 2 mL. </li><li> Verifique células diariamente para se certificar que estão saudáveis ​​e não cobertas, fino, se necessário. </li><li> Permitir que as células a crescer sob condições normais de 5-7 dias após transfecção antes de recolher-los para análise. </li><li> Em 5-7 dias após a transfecção, coletar as células por aspiração ao largo da velha mídia em todos os poços e adicionar 1 mL de PBS estéril à temperatura ambiente a cada poço. </li><li> Separar as células de fundo do poço por pipetagem cima e para baixo e transferir a mistura de células para tubos de 5 mL tampa de pressão e analisar imediatamente as células através de citometria de fluxo. </li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Untransfected A. saudável stephensi MSQ43 (A) e A. gambiae SUA5B (B) células em cerca de 80% confluência. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. A. stephensi MSQ43 (A) e A. gambiae SUA5B (B) células transfectadas com GFP controle positivo expressando plasmídeo. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Citometria de fluxo de dados confirmando a conversão de BFP GFP via mutagênese transfecção de um único nucleotídeo seguinte com BFP específicos bloqueado ácidos nucleicos modificado oligonucleotides (LNA-ONs). SUA5B células foram transfectadas com um plasmídeo expressando GFP (pGFP) como controle positivo, com um plasmídeo expressando BFP (pBFP) como controle negativo, ou com pBFP e concentrações crescentes de BFP específicos LNA-ons. (A) estratégia Gating de dados de citometria de fluxo mostrando da esquerda para a direita: dispersão frontal versus lado de células vivas, iodeto de propídio (PI) células negativas, e as células GFP positivas cinco dias após a transfecção. (B) Gráfico de porcentagem de células GFP positivas mostrado em (A) transfecção seguinte com pBFP e concentrações crescentes de LNA-ons. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355table1.jpg" alt="Tabela 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabela 1"> Transfecção tabela I. condições. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355table2.jpg" alt="Tabela 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabela 2"> Tabela II. Condições Transfection usado na Figura 1.

<ol><li>Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+controlling+malaria+transmission+in+the+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi.</a> PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Braasch, D. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid+%28LNA%29%3A+fine-tuning+the+recognition+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA.</a> Chem Biol. 8, 1-7 (2001).</li>
<li>Andrieu-Soler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transmission+of+targeted+gene+modification+using+single-stranded+oligonucleotides+with+flanking+LNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).</li>
<li>Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nucleotide+exchange+in+Saccharomyces+cerevisiae+directed+by+short+oligonucleotides+containing+locked+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids.</a> Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).</li>
<li>Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+accessibility+and+signal+specificity+in+live-cell+detection+of+BMP-4+mRNA+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).</li>
<li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+SNPs+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotyping SNPs with molecular beacons.</a> Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).</li>
<li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).</li>
<li>Blandin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+genetic+basis+of+resistance+to+malaria+parasites+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae.</a> Science. 326, 147-150 (2009).</li>
<li>Niare, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+loci+affecting+resistance+to+human+malaria+parasites+in+a+West+African+mosquito+vector+population%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population.</a> Science. 298, 213-216 (2002).</li>
<li>Riehle, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+malaria+infection+in+Anopheles+gambiae+is+regulated+by+a+single+genomic+control+region%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region.</a> Science. 312, 577-579 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Aqui apresentamos um método in vitro e evidências para a conversão alvo de um único nucleotídeo em um gene alvo epissomal seguintes transfecção de LNA-ONs em A. stephensi e A. células gambiae. LNA-ON-mediada conversão gene requer indução de um site-specific resposta de reparo do DNA; nossos dados indicam que as células de mosquito pode suportar este mecanismo de site-specific mutagênese. Enquanto o método aqui apresentado é baseado na conversão de um alvo epissomal, nossos da...

<table><tbody><tr><td>Reagente de transfeção Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo controle GFP (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)</td><td>Invitrogen</td><td>K4935-00</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo BFP (pcDNA5/FRT/TO)</td><td></td><td></td><td>Doação do Dr. Concordet&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>ONs com LNA</td><td></td><td></td><td>Doação do Dr. Concordet&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>MEM, Earle&amp;rsquo;s com glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>11095</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Meio &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; de Schneider&amp;rsquo;s</td><td>Invitrogen</td><td>11730</td><td></td></tr><tr><td>Ácidos aminoácidos não essenciais</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose a 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de 6 poços</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr></tbody></table>

transfecção e mutagênese de genes alvo em células de mosquito por locked de ácido nucléico modificados oligonucleotídeos

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Parasitas Plasmodium, o agente causador da malária, é transmitida através da picada de mosquitos do gênero Anopheles infectados, resultando em mais de 250 milhões de novas infecções a cada ano. Apesar de décadas de pesquisa, ainda não há vacina contra a malária, destacando a necessidade de estratégias de controle romance. Uma abordagem inovadora é a utilização de mosquitos geneticamente modificados para controlar eficazmente a transmissão do parasita da malária. Alterações deliberadas de vias de sinalização celular no mosquito, através de mutagênese alvo, foram encontradas para regular o desenvolvimento do parasita 1. A partir desses estudos, podemos começar a identificar genes alvos potenciais para a transformação. Mutagênese alvo tradicionalmente tem invocado a recombinação homóloga entre um gene alvo e uma molécula de DNA de grande porte. No entanto, a construção e utilização de tais moléculas de DNA complexas para geração de linhagens celulares estavelmente transformada é o tempo, consumindo caros e muitas vezes ineficiente. Portanto, uma estratégia usando bloqueado ácidos nucleicos modificado oligonucleotides (LNA-ONs) fornece uma alternativa útil para a introdução artificial único substituições de nucleotídeos em metas epissomal DNA cromossômico e gene (revisto em 2). LNA-ON-mediada mutagênese alvo tem sido usado para introduzir mutações pontuais em genes de interesse em cultura de células de levedura e ratos 3,4. Mostramos aqui que LNA-ONs pode ser usada para introduzir uma mudança de nucleotídeo único em um alvo transfectadas epissomal que resulta em um interruptor de azul proteína fluorescente expressão (BFP) para expressão de proteína verde fluorescente (GFP) em ambos os Anopheles gambiae e Anopheles stephensi células . Esta conversão demonstra pela primeira vez que mutagênese eficaz de genes alvo em células de mosquito pode ser mediada por LNA-ONs e sugere que esta técnica pode ser aplicável a mutagênese de alvos cromossômicas in vitro e in vivo.

Oligonucleotídeos podem ser usados ​​para o site substitua especificamente um único nucleotídeo de genes-alvo transfectadas em ambos os<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; E<em&gt; Anopheles stephensi</em&gt; Células.

Transfecção e Mutagênese de genes alvo em células de mosquito por Locked de ácido nucléico modificados Oligonucleotídeos

Os parasitas Plasmodium, os agentes causadores da malária, são transmitidos através de picadas de mosquitos Anopheles infectados, resultando em mais de 250 milhões de novos...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar uma nova estratégia para mutagênese direcionada a sítios em células de mosquito com anomalias. Isso é realizado primeiramente preparando células cultivadas saudáveis para transfeção. Em seguida, as células são transfectadas com os DNAs controle e teste apropriados pela adição de reagentes de transfeção.O próximo passo do procedimento é monitorar as células controle quanto à fluorescência e reduzir a densidade das células experimentais. Por fim, as frequências de conversão gênica podem ser determinadas nas células experimentais utilizando citometria de fluxo entre cinco e sete dias após a transfeção. Em última análise, podem-se obter resultados que demonstram mutagênese direcionada a um local específico em um gene alvo episomal por meio da reparação do DNA induzida por oligonucleotídeos de ácido nucleico bloqueado.Olá, sou a Dra. Nazy Pacor do laboratório da Dra. Shirley Lockhart do Departamento de Microbiologia Médica e Imunologia da Universidade da Califórnia em Davis. Hoje vamos mostrar um procedimento inovador para a mutagênese direcionada a sítios em células de mosquitos *Anopheles*. Utilizamos este procedimento para estudar a função dos genes da resposta imune inata de mosquitos por meio de mutagênese direcionada a sítios.Então vamos começar. Antes de iniciar o protocolo, obtenha células de mosquito saudáveis e com cerca de 80% de confluência. Se as células forem aderentes, supercrescidas ou não saudáveis, isso resultará em baixa eficiência de transfeção e fornecerá resultados inconsistentes.Este protocolo é demonstrado com células B ananais Gambier SUA cinco. No entanto, células ananais ensi MS Q4 três também podem ser utilizadas. Inicie o preparo da transfeção aquecendo o meio S dois em banho-maria a 28 graus Celsius por 30 minutos.Todos os materiais do reagente de transfeção, plasmídeo e oligonucleotídeos devem ser mantidos no gelo. Utilizando técnica estéril em uma cabine de cultura de tecidos, aspire o meio antigo sem perturbar as células e substitua por um volume equivalente de meio fresco aquecido, depois enxágue as células do fundo do frasco. Usando uma pipeta, a concentração de células deve então ser determinada e ajustada para uma concentração final de um vezes 10 elevado às seis células por mililitro.Uma vez que a concentração final tenha sido ajustada, adicione um mililitro de células de mosquito a cada poço de uma placa de seis poços. Embora as placas com células possam ser mantidas à temperatura ambiente durante o preparo dos reagentes para transfeção, transfira o DNA plasmidial para tubos estéreis de microcentrífuga. Neste caso, um plasmídeo que expressa proteína verde fluorescente é utilizado como controle positivo e um plasmídeo que expressa proteína azul fluorescente é utilizado como controle negativo.O DNA de teste também inclui o plasmídeo que expressa BFP, mas com concentrações crescentes de ácido nucleico bloqueado específico para BFP, oligonucleotídeos modificados ou LNA os. Após o DNA ter sido aliquotado, adicione 99 microlitros de kage e tampão EC para cada micrograma de DNA plasmidial e L-N-A-O-N. Em seguida, adicione lentamente oito microlitros de realçador por um micrograma de DNA utilizado, vortexe a mistura de DNA, tampão e realçador.Por um segundo, centrifugue brevemente a solução e incube as amostras à temperatura ambiente. Após cinco minutos, adicione 10 microlitros do reagente efetor por um micrograma de DNA plasmidial e vortex por 10 segundos. Centrifugue brevemente a solução para o fundo dos tubos e, em seguida, incube à temperatura ambiente por 10 minutos. Após a incubação, ajuste o volume final de cada tubo para 1000 microlitros adicionando lentamente meio aquecido fresco à mistura de reforço do tampão de DNA. O DNA pode precipitar neste ponto se o meio for adicionado muito rapidamente; nesse caso, misture suavemente pipetando para cima e para baixo três ou quatro vezes.Por fim, adicione lentamente um mililitro da mistura apropriada de potencializador de DNA a cada poço de células. Uma gota de cada vez. Agite suavemente a placa para garantir a distribuição uniforme das células e da mistura de transfeção.Incube as células em condições normais de crescimento um dia após a transfeção, aspire suavemente o meio das células e substitua lentamente por um volume equivalente de meio aquecido e fresco. Tenha cuidado para não perturbar as camadas celulares no fundo das placas. Dois dias após a transfeção, examine as células do controle positivo, transfectadas com plasmídeo que expressa GFP, em um microscópio fluorescente para determinar a eficiência de transfeção.Quatro dias após a transfeção s uua, cinco células B devem ser repicadas, pois crescem muito rapidamente e podem ficar sobrecarregadas. Para isso, aspire o meio antigo das células e adicione lentamente um volume equivalente de meio aquecido fresco. Após adicionar o novo meio aos poços, desprenda todas as células do fundo de cada poço pipetando para cima e para baixo, descarte metade do volume da mistura celular e adicione um mililitro de meio aquecido fresco para elevar o volume final a dois mililitros.Verifique as células diariamente para garantir que estejam saudáveis e não estejam superconfluentes. Reduza a densidade conforme necessário. Incube as células em condições normais por cinco a sete dias após a transfeção antes de coletá-las para análise.Cinco a sete dias após a transfeção, colete as células aspirando o meio antigo das células e adicionando um mililitro de PBS estéril à temperatura ambiente a cada poço. Desprenda as células do fundo de cada poço pipetando para cima e para baixo. Por fim, transfira a mistura celular para tubos de tampa de encaixe de cinco mililitros e analise imediatamente as células por citometria de fluxo.Um olho de defesa. Células MS Q4 três e um gambier UA cinco B foram transfectadas com um plasmídeo positivo controle que expressa GFP. As células são mostradas em microscopia de luz e fluorescência e como imagem emergente, dados de citometria de fluxo confirmam a conversão de BFP para GFP por meio de mutagênese de um único nucleotídeo após transfeção com LNAO Ns específico para BFP. Células UA cinco B foram transfectadas com o plasmídeo que expressa GFP como controle positivo, com um plasmídeo que expressa BFP como controle negativo ou com o plasmídeo que expressa BFP e concentrações crescentes de LNAO Ns específico para BFP.A estratégia de seleção para os dados de citometria de fluxo mostra a dispersão para frente versus dispersão lateral de células viáveis, células negativas para iodeto de propídio e células positivas para GFP cinco dias após a transfeção; a porcentagem de células positivas para GFP após transfeção com plasmídeo expressando BFP e concentrações crescentes de LNAO NS pode ser observada aqui na forma gráfica, confirmando a conversão de BFP em GFP por L aos. Acabamos de mostrar um novo procedimento para a mutagênese direcionada a sítios em células de mosquito anomalias. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de garantir que suas células estejam saudáveis e na densidade adequada antes da transfeção.Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui, descrevemos um processo para a inibição da função do gene em vectores mosquitos doença através do uso de quitosano / interferindo nanopartículas de RNA que são ingeridos pelas larvas.

A quitosana / RNA de interferência Nanoparticle Mediated silenciamento gênico na Doença Vector Mosquito Larvas

A interferência de RNA (RNAi) é uma ferramenta extremamente valiosa para descobrir a função do gene. No entanto, a capacidade de direcionar genes usando RNAi durante os estágios pré-adultos é limitada no principal vetor da malária humana, Anopheles gambiae. Descrevemos um protocolo de RNAi para reduzir a função do gene por meio de injeção direta durante o desenvolvimento da pupa.

RNAi gatilho para o interior<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; As pupas

Nós relatamos usando uma artificial intrônicas pequeno RNA expressão estratégia para desenvolver um recombinante com defeito não Aedes aegypti densovirus (AaeDV) na vivo sistema de entrega. Um procedimento detalhado para a construção, embalagens e análise quantitativa dos vetores rAaeDV tão bem quanto a infecção larval é descrito.

Uso de um Mosquito recombinante Densovirus como um vetor de entrega do Gene para a análise funcional de Genes em larvas do Mosquito

Este protocolo descreve procedimentos de microinjeção para embriões culex quinquefasciatus que são otimizados para trabalhar com ferramentas de edição de genes CRISPR/Cas9. Esta técnica pode gerar eficientemente mutações de germes específicas, hereditárias e germinais que podem ser usadas para a construção de tecnologias genéticas neste vetor de doença subestudado.

Técnicas de microinjeção de embriões para mutagênese específica do local eficiente em Culex quinquefasciatus

O CRISPR/Cas9 é cada vez mais usado para caracterizar a função genética em organismos não-modelo. Este protocolo descreve como gerar linhas de knock-out de Culex pipiens, desde o preparo de misturas de injeção, até a obtenção e injeção de embriões de mosquitos, bem como como criar, atravessar e tela injetar mosquitos e sua prole para mutações desejadas.

Preparando e injetando embriões de mosquitos Culex para gerar mutações nulas usando CRISPR/Cas9

O sistema bipartite GAL4-UAS é uma ferramenta versátil para modificação da expressão genética de forma espástica controlada que permite a análise genética funcional em Anopheles gambiae. Os procedimentos descritos para o uso deste sistema são uma estratégia de clonagem semi-padronizada, sexagem e triagem de pupas para marcadores de proteína fluorescente e fixação de embriões.

Usando o sistema GAL4-UAS para genética funcional em Anopheles gambiae

O protocolo descreve como alcançar modificações direcionadas ao local no genoma dos mosquitos anofelinos da malária usando o sistema φC31 . As modificações descritas incluem tanto a integração quanto a troca de fitas transgênicas no genoma das linhas de acoplamento de rolamento attP.

Integração mediada pelo site φC31 e troca de em vetores anofelinos da malária

Os protocolos aqui relatados ilustram três maneiras alternativas de avaliar o desempenho de mosquitos geneticamente modificados destinados ao controle de vetores em pequenos ensaios de gaiolas em laboratório. Cada protocolo é adaptado à modificação específica que a cepa de mosquito carrega (unidade genética ou unidade não genética) e os tipos de parâmetros medidos.

Ensaios laboratoriais de pequenas gaiolas de mosquitos anofelina geneticamente modificados

Este artigo detalha um protocolo para identificação rápida de indels induzidos pelo CRISPR/Cas9 e seleção de linhas mutantes no mosquito Aedes aegypti utilizando análise de derretimento de alta resolução.

Detecção indel seguindo CRISPR/Cas9 Mutagenesis usando análise de derretimento de alta resolução no mosquito Aedes aegypti

A administração oral do dsRNA produzido por bactérias, um método de entrega para interferência de RNA (RNAi) que é rotineiramente utilizado em caenorhabditis elegans, foi aplicada com sucesso aqui em mosquitos adultos. Nosso método permite estudos robustos de genética reversa e estudos de vetores de bloqueio de transmissão sem o uso de injeção.

Administração eficaz de interferência oral de RNA (RNAi) para mosquitos anofeeles gâmbias adultos

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para edição do genoma por meio de microinjeção embrionária no mosquito A. aegypti usando a tecnologia CRISPR-Cas9.

Edição do genoma no mosquito da febre amarela Aedes aegypti usando CRISPR-Cas9

Aprenda mutagênese dirigida em células de mosquito Anopheles usando oligonucleotídeos de ácido nucleico bloqueado. Este método permite substituição precisa de nucleotídeos para estudos de função gênica.

Transfecção e Mutagênese de genes alvo em células de mosquito por Locked de ácido nucléico modificados Oligonucleotídeos

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