Peptídeos de Phage Biblioteca Mostrar modular a expressão de genes em células mesenquimais e potenciar a osteogênese em defeitos ósseos unicorticais

O objetivo geral deste experimento é identificar sequências que potencializem a diferenciação das células mesenquimais e promovam o reparo ósseo. O passo inicial é isolar por biop panning o fago que se liga ao osso. Prossiga para identificar as sequências de peptídeos que se ligam às células mesenquimais e também determine as mudanças subsequentes na expressão gênica.

Realize experimentos para determinar como as sequências de peptídeos podem ser entregues ao osso para fins regenerativos. Como etapa final, examine o reparo ósseo histologicamente em conjunto, os resultados podem oferecer informações importantes sobre os mecanismos de diferenciação celular in vitro e reparo ósseo in vivo. As vantagens de usar a técnica de panning biop com uma biblioteca de exibição de fagos são que fomos capazes de identificar peptídeos que têm como alvo o osso e podem ser usados para estimular a diferenciação de células mesenquimais e potencializar o reparo ósseo.

Em última análise, essas sequências peptídicas podem ser úteis em modalidades terapêuticas para reparo ósseo e para o tratamento de perdas ósseas, como osteopenia e osteoporose. Com base em um estudo em que ULA e Pascal mostraram que o panning biop pode ser usado para isolar sequências de peptídeos que têm como alvo os vasos sanguíneos, optamos por adaptar esse método aos mecanismos de consulta no osso. Para o procedimento de panorâmica de biop in vivo, perfundiu 10 vezes 10 até a 10ª placa executando unidades da biblioteca de peptídeos de exibição de fagos N-E-B-P-H-D 12 através do coração de um camundongo com válvula C de 10 semanas de idade.

Após aproximadamente cinco minutos, eutanasiar o camundongo, expor e dissecar os fêmures, cortar as pontas e remover a medula óssea. Enxágue o fêmur esquerdo por dentro e por fora com PBS 10 vezes. Em seguida, adicione o osso às bactérias ER 2 5 3 7.

Para remover o fago não ligado, use leite desnatado a 2% em uma seringa com uma agulha de calibre 21 para enxaguar o canal intermediário do fêmur direito 10 vezes. Agora elua o fago ligado do canal intermediário com tampão de glicina de ácido clorídrico. pH 2,2 neutralizado com um mo la triss.

Para amplificar o fago, adicione EIT às bactérias ER 2 5 3 7 e cultive por 4,5 horas. Transferir cuidadosamente os sobrenadantes para tubos novos e precipitar o fago três vezes por adição de polietilenoglicol. Solução de cloreto de sódio, incubar os tubos durante a noite a quatro graus Celsius.

Finalmente, ressuspenda o pellet em TBS com 0,02% de azida de sódio. Coloque o fago em placas para determinar as unidades formadoras de placas dos EITs amplificados. Repita o procedimento de panorâmica biológica in vivo para o fago iludido e não eluído quatro vezes.

Amplificar o fago agrupado em culturas bacterianas. Purifique e quantifique a sequência de DNA, o DNA final do fago usando o primer 98 fornecido com o kit de exibição de fagos. É importante calcular a frequência da representação da sequência de DNA do fago.

Agora sintetize peptídeos incorporando uma semente de sequência de glicina glicina seno lisina e amplifice células D um. Uma linha celular estromal multipotencial da medula óssea de camundongo clonada que foi desenvolvida em nosso laboratório a 90% de confluência. A tripsina é a célula e a centrífuga para granular e contar as células da placa de coloração de peptídeos na câmara revestida de gelatina, lâminas de poço e cultura por 24 horas.

Lave as células com PBS e fixe com 4% de paraldeído por 30 minutos. Agora execute incubações de bloqueio com glicina seguida por BSA Aden e BBSA. Soluções de bloqueio de biotina.

Adicionar 100 micromolares de peptídeos L sete biotinilados e R um. Prossiga para lavar as células três vezes com PBS por cinco minutos cada. Adicione uma diluição de um a 1000 de LOR strippin cover e papel alumínio e incube em uma gaveta escura por 30 minutos.

Lave as células e monte as lamínulas com a mídia de montagem de blindagem vetorial. Agora analise as lâminas em um microscópio fluorescente 24 horas antes da cirurgia. Mergulhe os cilindros de espuma de gel.

Transfira os cilindros de espuma de gel com peptídeo 20 micromolar L sete ou R um ou tampão PBS sem peptídeo para estéril 12. Bem cultive os pratos e leve à geladeira durante a noite a quatro graus Celsius no momento da cirurgia. Coloque o composto de gel para telefone no gelo até o uso.

Usando uma rebarba pneumática sob irrigação salina, crie um grande defeito unicortical oblongo de três milímetros de largura por oito milímetros de comprimento. Trate o defeito ósseo com espumas de gel preparadas, inserindo todos os andaimes implantados usando batidas suaves. Eutanasiar os ratos e coletar a tíbia em pontos de tempo definidos, verificar cuidadosamente o defeito ósseo e fixar a tíbia colhida em formalina tamponada a 10% neutra para seccionamento em parafina.

Por fim, core todas as seções de tecido com hematina eosina para rotular a matriz osteo. O isotiocianato de fluoresceína marcado com Aden permite a detecção microscópica da ligação de peptídeos em células cultivadas in vitro. Aqui, os peptídeos se ligam às células mesenquimais em cultura para determinar o efeito osteogênico dos peptídeos nas células.

As células mesenquimais in vitro em cultura podem ser tratadas com peptídeos de teste para determinar alterações na morfologia celular. Por exemplo, no quarto dia, as células começam a se agregar e os agregados aumentam com o tempo para formar nódulos. Curiosamente, corte ósseo corado com h e e autofluorescência sob luz UV.

Esse maior contraste entre os tecidos ósseos e não ósseos facilita a análise de quantificar a presença de osso nos cortes para determinar o reparo ósseo nos defeitos tratados com gelfoam mais peptídeo. Em comparação com o gelfoam sozinho aqui, os defeitos que foram preenchidos com mais peptídeo mostraram a maior quantidade de reparo cortical com o tempo ao tentar este procedimento. É importante ser extremamente metódico em sua entrada de dados devido ao grande número de espécimes que invariavelmente se acumularão ao longo do tempo até que você tenha selecionado o grupo final de peptídeos.

O desenvolvimento do biop panning in vivo como uma técnica para identificar peptídeos que têm como alvo o osso significa que agora temos drogas potenciais que podem ser usadas como terapia para reparo ósseo e perda óssea. Um dos mecanismos subjacentes ao reparo ósseo também está envolvido na perda óssea. Compreender esses mecanismos com mais detalhes e ter ferramentas que possam ser usadas para o tratamento de distúrbios como fraturas tardias e osteoporose ajudará a melhorar as terapias que podem ser desenvolvidas para a saúde.