Name: Peptídeos de Phage Biblioteca Mostrar modular a expressão de genes em células mesenquimais e potenciar a osteogênese em defeitos ósseos unicorticais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprenda a identificar peptídeos de biblioteca de fagos que modulam a expressão gênica em células mesenquimais e potenciam a osteogênese em defeitos ósseos unicorticais.

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National Institutes of Health, AR53579, Osteogenesis: Potenciação com Peptídeos Tropic óssea National Institutes of Health, AR056422, efeito anabólico de Peptídeos Osteogênica National Institutes of Health, T32 AR050960, Reparo de Tecidos musculosqueléticas e Regeneração DOD, PC051219 Nucleolin: A Novel Mediador do câncer de próstata e de Medula Óssea de Adesão Celular Endotelial Departamento de Defesa, PC061508, Prostate Cancer Metástase Célula-Bone Marrow adesão Mediadores

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</ol>

A produção deste vídeo foi patrocinado pela New England Biolabs, Inc, que produz alguns dos reagentes utilizados neste artigo.

<table><tbody><tr><td>Kit de Biblioteca de Peptídeos com Exibição por Fago - Ph.D-12</td><td>New England Biolabs</td><td>E8110S</td><td></td></tr></tbody></table>

peptídeos de phage biblioteca mostrar modular a expressão de genes em células mesenquimais e potenciar a osteogênese em defeitos ósseos unicorticais

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Dois novos peptídeos sintéticos acelerar a formação óssea e podem ser entregues utilizando uma matriz de colágeno. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos sobre a reparação óssea em um modelo de defeito unicorticais. Tratamento de células mesenquimais produziu um aumento na atividade da fosfatase alcalina, mostrou formação de nódulos pelas células, e aumentou a expressão de genes para Runx2, osterix, sialoproteína óssea e osteocalcina. A esponja de colágeno embebida com a reparação promovida peptídeo de defeitos ósseos, enquanto o controle foi menos eficaz. Os resultados deste estudo demonstraram que as células mesenquimais tratados com peptídeo in vitro para diferenciar a osteogênese, e, que os peptídeos entregues in vivo utilizando uma esponja de colágeno promover a reparação de defeitos unicorticais.

Uma biblioteca de mostrar fago foi utilizado para identificar seqüências de peptídeos que o osso alvo. O objetivo foi investigar o efeito destes peptídeos sobre a diferenciação de células mesenquimais e determinar seus efeitos sobre a regeneração óssea.

Peptídeos de Phage Biblioteca Mostrar modular a expressão de genes em células mesenquimais e potenciar a osteogênese em defeitos ósseos unicorticais

Dois novos peptídeos sintéticos aceleram a formação óssea e podem ser administrados utilizando uma matriz de colágeno. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos...

O objetivo geral deste experimento é identificar sequências que potencializem a diferenciação de células mesenquimais e promovam a reparação óssea. O primeiro passo é isolar, por biopanning, o fago que se liga ao osso. Em seguida, identificar as sequências de peptídeos que se ligam às células mesenquimais e determinar também as alterações subsequentes na expressão gênica.Realize experimentos para determinar como as sequências de peptídeos podem ser entregues ao osso com finalidades regenerativas. Como etapa final, examine histologicamente a reparação óssea; considerados em conjunto, os resultados podem oferecer insights importantes sobre os mecanismos de diferenciação celular in vitro e reparação óssea in vivo. As vantagens do uso da técnica de panning biológico com uma biblioteca de exibição em fago são que conseguimos identificar peptídeos que direcionam ao osso e podem ser utilizados para estimular a diferenciação de células mesenquimais e potencializar a reparação óssea.Essencialmente, essas sequências peptídicas podem ser úteis em modalidades terapêuticas para reparação óssea e para o tratamento da perda óssea, como na osteopenia e na osteoporose. Com base em um estudo em que ULA e Pascal demonstraram que o biopanning pode ser usado para isolar sequências peptídicas que visam vasos sanguíneos, optamos por adaptar esse método para investigar mecanismos no osso. Para o procedimento de biopanning in vivo, foi realizada a perfusão de 10 vezes 10 à décima unidade formadora de placas da biblioteca de exibição de peptídeos fágicos N-E-B-P-H-D 12 através do coração de um camundongo C57BL/6 de 10 semanas de idade.Após aproximadamente cinco minutos, eutanizar o camundongo, expor e dissecar os fêmures, cortar as extremidades e remover a medula óssea. Enxaguar o fêmur esquerdo tanto por dentro quanto por fora com PBS 10 vezes. Em seguida, adicionar o osso às bactérias ER 2 5 3 7.Para remover o fago não ligado, utilize 2% de leite desnatado seco em uma seringa com agulha de 21 calibres para lavar o canal intermédio do fêmur direito 10 vezes. Agora, elua o fago ligado do canal intermédio com tampão de glicina ácida clorídrica, pH 2,2, neutralizado com uma molar de triss.Para amplificar o fago, adicione EIT às bactérias ER 2 5 3 7 e cultive por 4,5 horas. Transfira cuidadosamente os sobrenadantes para tubos novos e precipite o fago três vezes pela adição de polietileno glicol. Solução de cloreto de sódio, incube os tubos durante a noite a quatro graus Celsius.Por fim, ressuspenda o pellet em TBS com 0,02% de azida de sódio. Plaque o fago em placas para determinar as unidades formadoras de placa dos EITs amplificados. Repita o procedimento de bioseleção in vivo para os fagos eluídos e não eluídos quatro vezes.Amplifique o fago em culturas bacterianas. Purifique e quantifique a sequência de DNA, o DNA final do fago, utilizando o iniciador 98 fornecido com o kit de exibição de fago. Importante: calcule a frequência de representação da sequência de DNA do fago.Agora, sintetize peptídeos incorporando uma sequência semente de glicina glicina glicina lisina e amplifique células D um. Uma linhagem celular estromal da medula óssea multipotente de camundongo clonada que foi desenvolvida em nosso laboratório em 90% de confluência. Tripsinize as células e centrifugue para obter o pellet e conte-as para plaquear células para coloração peptídica em lâminas com câmara revestidas com gelatina e cultive por 24 horas.Lave as células com PBS e fixe com paraformaldeído 4% por 30 minutos. Em seguida, realize incubações de bloqueio com glicina, seguidas por Aden BSA e BBSA. Soluções de bloqueio de biotina.Adicione 100 micromolar dos peptídeos biotinilados L sete e R um. Prossiga com a lavagem das células três vezes com PBS durante cinco minutos cada. Adicione uma diluição de um para 1000 do LOR strippin, cubra com papel alumínio e incube em uma gaveta escura por 30 minutos.Lave as células e monte as lamínulas com meio de montagem Vector Shield. Em seguida, analise as lâminas em microscópio fluorescente 24 horas antes da cirurgia. Sature os cilindros de espuma gelatinosa.Transfira os cilindros de espuma de gel com o peptídeo a 20 micromolar, seja L sete ou R um, ou tampão PBS sem peptídeo, para placas de cultura estéreis de 12 poços e refrigere durante a noite a quatro graus Celsius no momento da cirurgia. Coloque o compósito de espuma de gel sobre gelo até o uso.Usando uma broca pneumática com irrigação salina, crie um grande defeito unicotical oblongo de três milímetros de largura por oito milímetros de comprimento. Trate o defeito ósseo com espumas-gel preparadas, inserindo todas as matrizes implantadas com leves batidas. Eutanazie os ratos e colete os tibias nos pontos de tempo definidos, verificando cuidadosamente o defeito ósseo e fixando os tibias colhidos em formalina tamponada neutra a 10% para inclusão em parafina.Finalmente, corar todos os cortes de tecido com hematoxilina e eosina para marcar a matriz óssea. O Aden marcado com isotiocianato de fluoresceína permite a detecção microscópica da ligação de peptídeos em células cultivadas in vitro. Aqui, os peptídeos se ligam a células mesenquimais em cultura para determinar o efeito osteogênico dos peptídeos sobre as células.Células mesenquimais cultivadas in vitro podem ser tratadas com peptídeos-teste para determinar alterações na morfologia celular. Por exemplo, no quarto dia, as células começam a se agregar e os agregados aumentam com o tempo, formando nódulos. Curiosamente, seções ósseas coradas com h e e exibem autofluorescência sob luz ultravioleta.Esse maior contraste entre tecidos ósseos e não ósseos facilita análises que quantificam a presença de osso nas seções para determinar a reparação óssea nos defeitos tratados com gelfoam mais peptídeo. Em comparação com o gelfoam isolado aqui, defeitos que foram preenchidos com peptídeo apresentaram a maior quantidade de reparação cortical ao longo do tempo durante a tentativa deste procedimento. É importante ser extremamente metódico na inserção de dados devido ao grande número de espécimes que inevitavelmente se acumulará ao longo do tempo até que você tenha selecionado o grupo final de peptídeos.O desenvolvimento da triagem biológica in vivo como uma técnica para identificar peptídeos que visam o osso significa que agora dispomos de fármacos potenciais que poderiam ser utilizados como terapia para reparação óssea e para a perda óssea. Um dos mecanismos que subjaz à reparação óssea também está envolvido na perda óssea. Compreender esses mecanismos com maior detalhe e dispor de ferramentas que possam ser usadas para o tratamento de distúrbios como fraturas tardias e osteoporose ajudará a melhorar as terapias que podem ser desenvolvidas para a saúde.

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Biologia

A diferenciação de células precursoras em osteoclastos é regulada por citocinas e fatores de crescimento. Aqui, uma nova técnica de transferência de genes para diferenciação de osteoclastos in vivo e protocolos de cultura de células para diferenciar células precursoras em osteoclastos in vitro como um método para estudar os efeitos das citocinas na osteoclastogênese são descritos.

A Novel In vivo Técnica Gene Transferência e In vitro Ensaios baseados em células para o Estudo da perda óssea em Distúrbios Osteomusculares

Aqui, apresentamos um protocolo para visualizar vasos sanguíneos formação em vivo e em tempo real em 3D andaimes por microscopia do multiphoton. Angiogênese em andaimes geneticamente modificados foi estudado em modelo murino raspagem de osso crítico defeito. Mais novos vasos sanguíneos foram detectados no grupo de tratamento do que em controles.

Visualizando a angiogênese por Multiphoton microscopia In Vivo no andaime de 3D-PLGA/nhập geneticamente modificado para raspagem crítico reparo de defeito ósseo

Biomateriais dopados com 2 de Proteína morfogenética óssea (BMP2) utilizaram-se como uma nova estratégia terapêutica para curar fraturas não-união óssea. Para superar os efeitos secundários resultantes de uma incontrolável liberação do fator, propomos uma nova estratégia para o site-imobilizar diretamente o fator, criando assim materiais com capacidade osteogênica melhorada.

Imobilização local-dirigido da Proteína morfogenética óssea 2 para superfícies sólidas pela química do clique

Apresentamos um protocolo para investigar os biomarcadores de expressão do mRNA de células periósteo-derivado (PDCs) induzidas pela vitamina C (vitamina C) e 1,25-dihidroxi vitamina D [1,25-(OH)2D3]. Além disso, avaliamos a capacidade dos PDCs para diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteócitos.

Isolamento de células-tronco mesenquimais do periósteo Alveolar humano e efeitos da vitamina D na atividade osteogênica do periósteo-derivado de células

Apresentamos um protocolo para comparar o estado de minerais em vesículas lançadas por duas linhas de células de osso humano: hFOB 1.19 e Saos-2. Seus perfis de mineralização foram analisados por alizarina Red-S (AR-S) coloração, visualização de luz ultravioleta (UV), imagem de microscopia eletrônica (TEM) de transmissão e microanálise de raios-x energia dispersiva (EDX).

Análise de minerais produzidos por hFOB 1.19 e Saos-2 células usando microscopia eletrônica de transmissão com energia dispersiva microanálise de raios-x

Nisto, nós apresentamos um protocolo detalhado para a seleção de peptídeos pequenos que se ligam a FGFR2 usando uma biblioteca de peptídeo de exibição de fago. Nós analisamos mais a afinidade dos peptídeos selecionados em direção a FGFR2 in vitro e sua capacidade de suprimir a proliferação celular.

Triagem e identificação de pequenos peptídeos visando o fator de crescimento de fibroblastos Receptor2 usando uma biblioteca de peptídeos de Phage display

Este protocolo descreve um método canônico para entender os genes críticos que controlam a atividade osteoclasta in vivo. Este método utiliza um modelo de camundongo transgênico e algumas técnicas canônicas para analisar o fenótipo esquelético.

Análise do fenótipo esquelético de um modelo de rato de exclusão stat3 condicional

A ubiquização é uma modificação pós-translacional de proteínas críticas, que tem sido implicada em inúmeras doenças humanas. Este protocolo detalha como o display phage pode ser utilizado para isolar novas variantes de ubiquitina que podem ligar e modular a atividade de ligaduras E3 que controlam a especificidade, eficiência e padrões de ubiquização.

Usando o Phage Display para desenvolver moduladores variantes de Ubiquitin para Ligases E3

O protocolo apresenta um método para isolar os lises de proteínas celulares inteiras de processos faciais de embriões de camundongos dissecados ou células de mesenquime palatina embrionárias cultivadas e realizar posteriormente manchas ocidentais para avaliar os níveis de proteína fosfoilada.

Isolamento de Lysatos de Proteína Celular Inteira de Processos Faciais de Camundongos e Células de Mesenchyme Palatal cultivadas para análise de fosfoproteína

Aqui, apresentamos uma abordagem de terapia gênica que fornece quitosana revestida com ABE diretamente na medula óssea por injeção intraóssea.

Entrega e expressão gênica aprimoradas usando injeção intraóssea de nanopartículas de quitosana encapsuladas em plasmídeos editores de base de adenina

Aprenda a identificar peptídeos de biblioteca de fagos que modulam a expressão gênica em células mesenquimais e potenciam a osteogênese em defeitos ósseos unicorticais.

Peptídeos de Phage Biblioteca Mostrar modular a expressão de genes em células mesenquimais e potenciar a osteogênese em defeitos ósseos unicorticais (Vídeo) | JoVE Journal

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