Peptídeos de Phage Biblioteca Mostrar modular a expressão de genes em células mesenquimais e potenciar a osteogênese em defeitos ósseos unicorticais

O objetivo geral deste experimento é identificar sequências que potencializem a diferenciação de células mesenquimais e promovam a reparação óssea. O primeiro passo é isolar, por biopanning, o fago que se liga ao osso. Em seguida, identificar as sequências de peptídeos que se ligam às células mesenquimais e determinar também as alterações subsequentes na expressão gênica.

Realize experimentos para determinar como as sequências de peptídeos podem ser entregues ao osso com finalidades regenerativas. Como etapa final, examine histologicamente a reparação óssea; considerados em conjunto, os resultados podem oferecer insights importantes sobre os mecanismos de diferenciação celular in vitro e reparação óssea in vivo. As vantagens do uso da técnica de panning biológico com uma biblioteca de exibição em fago são que conseguimos identificar peptídeos que direcionam ao osso e podem ser utilizados para estimular a diferenciação de células mesenquimais e potencializar a reparação óssea.

Essencialmente, essas sequências peptídicas podem ser úteis em modalidades terapêuticas para reparação óssea e para o tratamento da perda óssea, como na osteopenia e na osteoporose. Com base em um estudo em que ULA e Pascal demonstraram que o biopanning pode ser usado para isolar sequências peptídicas que visam vasos sanguíneos, optamos por adaptar esse método para investigar mecanismos no osso. Para o procedimento de biopanning in vivo, foi realizada a perfusão de 10 vezes 10 à décima unidade formadora de placas da biblioteca de exibição de peptídeos fágicos N-E-B-P-H-D 12 através do coração de um camundongo C57BL/6 de 10 semanas de idade.

Após aproximadamente cinco minutos, eutanizar o camundongo, expor e dissecar os fêmures, cortar as extremidades e remover a medula óssea. Enxaguar o fêmur esquerdo tanto por dentro quanto por fora com PBS 10 vezes. Em seguida, adicionar o osso às bactérias ER 2 5 3 7.

Para remover o fago não ligado, utilize 2% de leite desnatado seco em uma seringa com agulha de 21 calibres para lavar o canal intermédio do fêmur direito 10 vezes. Agora, elua o fago ligado do canal intermédio com tampão de glicina ácida clorídrica, pH 2,2, neutralizado com uma molar de triss.

Para amplificar o fago, adicione EIT às bactérias ER 2 5 3 7 e cultive por 4,5 horas. Transfira cuidadosamente os sobrenadantes para tubos novos e precipite o fago três vezes pela adição de polietileno glicol. Solução de cloreto de sódio, incube os tubos durante a noite a quatro graus Celsius.

Por fim, ressuspenda o pellet em TBS com 0,02% de azida de sódio. Plaque o fago em placas para determinar as unidades formadoras de placa dos EITs amplificados. Repita o procedimento de bioseleção in vivo para os fagos eluídos e não eluídos quatro vezes.

Amplifique o fago em culturas bacterianas. Purifique e quantifique a sequência de DNA, o DNA final do fago, utilizando o iniciador 98 fornecido com o kit de exibição de fago. Importante: calcule a frequência de representação da sequência de DNA do fago.

Agora, sintetize peptídeos incorporando uma sequência semente de glicina glicina glicina lisina e amplifique células D um. Uma linhagem celular estromal da medula óssea multipotente de camundongo clonada que foi desenvolvida em nosso laboratório em 90% de confluência. Tripsinize as células e centrifugue para obter o pellet e conte-as para plaquear células para coloração peptídica em lâminas com câmara revestidas com gelatina e cultive por 24 horas.

Lave as células com PBS e fixe com paraformaldeído 4% por 30 minutos. Em seguida, realize incubações de bloqueio com glicina, seguidas por Aden BSA e BBSA. Soluções de bloqueio de biotina.

Adicione 100 micromolar dos peptídeos biotinilados L sete e R um. Prossiga com a lavagem das células três vezes com PBS durante cinco minutos cada. Adicione uma diluição de um para 1000 do LOR strippin, cubra com papel alumínio e incube em uma gaveta escura por 30 minutos.

Lave as células e monte as lamínulas com meio de montagem Vector Shield. Em seguida, analise as lâminas em microscópio fluorescente 24 horas antes da cirurgia. Sature os cilindros de espuma gelatinosa.

Transfira os cilindros de espuma de gel com o peptídeo a 20 micromolar, seja L sete ou R um, ou tampão PBS sem peptídeo, para placas de cultura estéreis de 12 poços e refrigere durante a noite a quatro graus Celsius no momento da cirurgia. Coloque o compósito de espuma de gel sobre gelo até o uso.

Usando uma broca pneumática com irrigação salina, crie um grande defeito unicotical oblongo de três milímetros de largura por oito milímetros de comprimento. Trate o defeito ósseo com espumas-gel preparadas, inserindo todas as matrizes implantadas com leves batidas. Eutanazie os ratos e colete os tibias nos pontos de tempo definidos, verificando cuidadosamente o defeito ósseo e fixando os tibias colhidos em formalina tamponada neutra a 10% para inclusão em parafina.

Finalmente, corar todos os cortes de tecido com hematoxilina e eosina para marcar a matriz óssea. O Aden marcado com isotiocianato de fluoresceína permite a detecção microscópica da ligação de peptídeos em células cultivadas in vitro. Aqui, os peptídeos se ligam a células mesenquimais em cultura para determinar o efeito osteogênico dos peptídeos sobre as células.

Células mesenquimais cultivadas in vitro podem ser tratadas com peptídeos-teste para determinar alterações na morfologia celular. Por exemplo, no quarto dia, as células começam a se agregar e os agregados aumentam com o tempo, formando nódulos. Curiosamente, seções ósseas coradas com h e e exibem autofluorescência sob luz ultravioleta.

Esse maior contraste entre tecidos ósseos e não ósseos facilita análises que quantificam a presença de osso nas seções para determinar a reparação óssea nos defeitos tratados com gelfoam mais peptídeo. Em comparação com o gelfoam isolado aqui, defeitos que foram preenchidos com peptídeo apresentaram a maior quantidade de reparação cortical ao longo do tempo durante a tentativa deste procedimento. É importante ser extremamente metódico na inserção de dados devido ao grande número de espécimes que inevitavelmente se acumulará ao longo do tempo até que você tenha selecionado o grupo final de peptídeos.

O desenvolvimento da triagem biológica in vivo como uma técnica para identificar peptídeos que visam o osso significa que agora dispomos de fármacos potenciais que poderiam ser utilizados como terapia para reparação óssea e para a perda óssea. Um dos mecanismos que subjaz à reparação óssea também está envolvido na perda óssea. Compreender esses mecanismos com maior detalhe e dispor de ferramentas que possam ser usadas para o tratamento de distúrbios como fraturas tardias e osteoporose ajudará a melhorar as terapias que podem ser desenvolvidas para a saúde.