Protocolo para produção de uma Cruz genética do parasita da malária de roedores

O objetivo geral deste procedimento é realizar um cruzamento genético do parasita da malária em roedores Plasmodium yoelii, a fim de gerar descendentes recombinantes. Isso é conseguido primeiramente pela injeção de um grupo de camundongos com um inóculo misto contendo os dois clones parentais dos parasitas a serem cruzados. Os camundongos infectados são então usados para alimentar mosquitos, nos quais os gametas de cada linhagem parental se fundirão formando um zigoto diploide; a divisão meiótica nesta fase pode levar à recombinação genética, produzindo assim descendentes recombinantes.

Os esporozoítos resultantes são então coletados das glândulas salivares dos mosquitos e reinjetados em camundongos receptores ingênuos, a fim de obter parasitas da fase sanguínea, entre os quais estão clones recombinantes individuais que podem ser isolados por diluição limitada. Em um experimento bem-sucedido, cinco a 10% das linhagens clonadas serão recombinantes, os quais podem ser caracterizados por genotipagem com marcadores genéticos apropriados. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área de pesquisa da malária, como quais são os determinantes genéticos da resistência a fármacos e da transmissibilidade na malária?

Parasitas À temperatura ambiente, dois frascos contendo o estágio sanguíneo congelado de parasitas da malária a serem cruzados. Neste exemplo, as duas linhagens de parasitas da malária de roedores utilizadas são Plasmodium yoelii e Plasmodium yoelii nigeriensis. Adapte uma seringa com uma agulha de 22 a 30 gauge e aspire 400 microlitros de PBS pH 7,4 utilizando a mesma seringa.

Aspire 100 microlitros do sangue infectado com Thor, inverta a seringa para cima e para baixo até que o conteúdo esteja homogeneamente misturado. Durante esta demonstração, animais anestesiados serão utilizados para minimizar dor e estresse. A anestesia é realizada pela injeção de 50 microlitros de uma mistura anestésica contendo 82,5 miligramas por quilograma de quetamina e 7,5 miligramas por quilograma de xilazina no peritônio de um camundongo.

Monitore os camundongos quanto à profundidade da anestesia e para prevenir mortalidade. Com este procedimento, os camundongos permanecerão anestesiados por 20 a 30 minutos. Antes da recuperação, injete 200 microlitros de solução contendo parasitas diretamente no peritônio de um camundongo.

Quando terminar, descarte a seringa em um recipiente para objetos perfurocortantes. Usando este método, infecte dois camundongos com cada um dos dois parasitas que serão cruzados, três a cinco dias após as injeções. Os parasitas em estágio sanguíneo se desenvolverão nos camundongos infectados.

Corte a ponta da cauda do camundongo doador infectado com as diferentes cepas do parasita usando tesoura estéril. Colete uma gota de sangue da cauda do camundongo em uma lâmina de microscopia e realize esfregaços finos. Estance o esfregaço sanguíneo fino com a coloração de guillem.

O corante Guillem SA não cora os glóbulos vermelhos não infectados devido às células não infectadas. A ausência de um núcleo em SAI cora o núcleo do parasita nos glóbulos vermelhos infectados; os parasitas, glóbulos vermelhos, aparecem sob a forma de estágios em anel, trofozoítos ski ons e maites rompidos. Uma vez que a parasitemia atinja de 1 a 5% em ambos os camundongos, os parasitas da fase sanguínea podem ser colhidos para infecção com clones mistos.

Corte a ponta da cauda do camundongo dos camundongos doadores infectados com os diferentes parasitas. Esterilize a tesoura conforme descrito anteriormente. Colete um microlitro de sangue da cauda do camundongo utilizando um capilar de vidro em um mililitro de PBS estéril; use 20 microlitros da suspensão sanguínea para analisar a densidade de hemácias com o cell ome.

Usando a densidade das hemácias e as medições de para, dilua as amostras de sangue em uma solução salina citratada fisiológica para obter uma concentração de hemácias infectadas de 1 milhão por 100 microlitros. Combine uma amostra de sangue infectado dos dois doadores em uma proporção um para um para obter um inóculo de clones mistos. Em seguida, injete 100 microlitros da amostra mista no peritônio de cada camundongo a ser infectado.

Utilize dois camundongos para infecções por clone único, permitindo a confirmação da transmissão bem-sucedida de cada linhagem parental. Os estágios sexuais do parasita, chamados gametócitos masculinos e femininos, devem começar a aparecer no sangue dos camundongos cerca de quatro dias após a infecção. Inicie o monitoramento diário dos camundongos quanto ao aparecimento de gametócitos, coletando sangue da cauda conforme descrito anteriormente e preparando esfregaços finos de sangue da cauda mantidos.

Os cítios machos e fêmeas são reconhecíveis devido à presença de grânulos grandes ou pigmentos. O citoplasma dos cítios gato machos é rosa, enquanto o citoplasma dos cítios TER fêmeas é azul. Apenas os cítios gato maduros apresentam uma grande vacúolo.

Uma vez detectados os esquistossomos maduros de ambos os sexos, os camundongos podem ser utilizados para alimentar os mosquitos. Injete 50 microlitros de solução anestésica de cetamina e xilazina no peritônio de cada camundongo infectado. Após os camundongos estarem anestesiados, posicione um deles com o ventre voltado para baixo sobre a parte superior de uma gaiola contendo de 50 a 100 fêmeas de mosquitos Anis defense enzyme que foram privadas de fonte de açúcar por 24 horas e permita que os mosquitos se alimentem por 30 minutos sem interrupção.

Eutanasiar humanamente os camundongos imediatamente após o período de alimentação. Se a transmissão for bem-sucedida, nove dias após a alimentação, os gametócitos ingeridos pelos mosquitos terão se fundido em zigotos diplóides que amadurecem em oocistos, os quais podem ser observados no intestino médio dos insetos. Quanto mais oocistos forem detectados, maiores serão as chances de que os parasitas recombinantes tenham sido gerados.

Use um aspirador para coletar de cinco a 10 mosquitos infectados da gaiola e transfira os mosquitos para um recipiente pequeno. Anestesie os mosquitos usando gás carbônico e transfira-os para uma placa de Petri de vidro sobre gelo. Os mosquitos machos cujas antenas são visivelmente mais espessas do que as das fêmeas devem ser descartados.

Encha duas seringas com PBS e acople agulhas de calibre 26 com meia polegada. Deposite cerca de 100 microlitros de PBS de uma seringa sobre uma lâmina de vidro. Transfira cinco a dez fêmeas de mosquitos anestesiados para a gota de PBS e coloque a lâmina sobre um microscópio estereoscópico utilizando as agulhas.

Remova as asas e as pernas de cada mosquito e, em seguida, segure o inseto pelo tórax e pelo abdômen posterior. Puxe o corpo até que o intestino médio, uma estrutura semelhante a uma bolsa branca, seja liberado. Separe o intestino médio e descarte o restante do corpo durante as dissecações.

Certifique-se de manter os intestinos médios úmidos utilizando o PBS das agulhas de dissecação. Coloque uma lamínula sobre os intestinos médios assim que a dissecação for concluída. Examine os intestinos médios ao microscópio óptico com aumento de 100 vezes.

OOS será reconhecível como estruturas circulares de parede espessa que se localizam na superfície externa dos intestinos médios. Conte o número de OOS em cada intestino médio. Dezessete dias após a alimentação, esporozoítas liberados do sys deverão ter migrado para as glândulas salivares dos mosquitos, esporozoítas de parasitas da malária.

Células delgadas em forma de fuso para colher esporozoítos. Primeiro, prepare um tubo de coleta usando uma tesoura limpa. Corte a tampa de um pequeno tubo einor de 500 microlitros.

Aqueça a ponta de uma agulha estéril de calibre 19 e fure a base do tubo. Encha um terço do tubo com parede de vidro para criar um filtro. Insira o tubo com filtro dentro de um tubo einor maior de 1,5 mililitro.

Uma vez que o aparelho de filtração esteja pronto, colete e anestesie os mosquitos conforme descrito anteriormente. Monte os insetos no ar para dissecação como antes e remova os mosquitos, cabeças, asas, patas e abdômenes, restando apenas o tórax, que contém as glândulas salivares infectadas.

Usando pinças de ponta fina, transfira o tórax para um homogeneizador de 1,5 mililitro contendo 500 microlitros de PBS. Homogeneíze o tórax em gelo para liberar os esporozoítos das glândulas salivares e, usando uma pipeta de vidro, transfira os homogeneizados para o aparato de filtração. Centrifugue o tubo do filtro por 10 a 20 segundos a 1000 rotações por minuto.

Após a centrifugação dos homogenatos, colete o fluxo passante utilizando uma seringa acoplada a uma agulha de 22 a 30 gauge. Injete de 100 a 500 microlitros da suspensão de esporozoítas no peritônio de um camundongo. Inicie o monitoramento da parasitemia e da densidade de hemácias três dias após a infecção.

Escolha um camundongo exibindo 0,1 a 1% de parasitemia e cujas hemácias infectadas contenham principalmente parasitas únicos como doador para o procedimento de clonagem. Retire uma quantidade apropriada de sangue em PBS, diluindo o sangue da cauda do camundongo em uma solução fria, na proporção um para um, de soro de bezerro e solução de Ringer para mamíferos, de modo a obter uma concentração de 0,6 a um hemácias infectada por 100 microlitros, e armazene a inóculo no gelo. Limpe o local de injeção na cauda com etanol por via intravenosa.

Injete 100 microlitros de sangue infectado diluído em cada um dos 100 camundongos. Dessa forma, cada camundongo individual deve receber um ou zero parasitas. Em um experimento bem-sucedido, de 20 a 50% dos camundongos apresentarão um parasitemia de 0,1 a 0,5% no oitavo dia.

Cinco a sete dias depois, examine os camundongos quanto à presença de parasitas no estágio sanguíneo mediante a análise de esfregaços sanguíneos finos fixados em gem. Os parasitas descendentes do cruzamento podem então ser genotipados por PCR de DNA, extraído de amostras de sangue da cauda, utilizando marcadores genéticos em diferentes cromossomos, como microssatélites e polimorfismos de nucleotídeo único. Parasitas cujos loci genéticos independentes são derivados dos dois clones parentais são clones recombinantes.

O sangue dos animais infectados com parasitas recombinantes pode ser criopreservado para uso futuro. Em um experimento bem-sucedido, de cinco a 10% do total de camundongos terão prole recombinante independente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir processos genéticos na malária.

Parasita mais meio yoi. Este método pode ser igualmente aplicável a outras espécies de parasitas.