Name: Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Aprenda a registrar respostas à luz em células ganglionares geneticamente marcadas em retina isolada de camundongo. Este método de eletrofisiologia permite analisar propriedades funcionais e morfologia celular em neurociência.

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Este trabalho foi financiado em parte por concessões do NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Agradecemos a Darwin Pendure a assistência técnica.

Declaração de Uso de Animais: Os animais foram tratados de acordo com orientações descritas no Manual sobre Cuidados e Uso de Animais de Laboratório, usando protocolos aprovados pela Universidade de Minnesota Animal Care Institucional e Comitê de uso. 1) Preparação das soluções <ol><li> Antes de realizar a gravação eletrofisiológico, soluções intracelular, extracelular e enzimas precisam estar preparados. </li><li> Solução extracelular: uma garrafa de mistura (8.8g) de meio de pó de Ames (Sigma) com 1 l de H 2 O e 1,9 g de bicarbonato de sódio (23 mM). Em todos os pontos da solução extracelular está saturado com 95% O 2 / 5% CO 2 da mistura de gases. Transferência de 200 mL para um copo para armazenamento de retina. Coloque a solução restante no recipiente de sistema de perfusão para a perfusão gravidade uma vez retina está montado. </li><li> Solução intracelular: solução intracelular deveria ter sido feito anteriormente e depois aliquotado em alíquotas 500-1000 mL e armazenadas a -20 ° C. Solução intracelular varia de acordo com a experiência necessária, para gravações de pinça de corrente mostrado aqui usamos (em mM): 125 K gluconato, 2 CaCl 2, MgCl 2 2, EGTA 10, 10 HEPES, 2-Na 2 ATP, 0,5 mM NaGTP pH para 7,2 com KOH 5. Um traçador fluorescente como 10 mM Alexafluor-594 hidrazida (Invitrogen) podem ser adicionados para visualizar dendrites durante o experimento, e neurobiotin (0,3%) também podem ser incluídos para a análise da anatomia das células após a gravação. Quando estiver pronto para gravar, descongelar solução intracelular. </li><li> Solução enzimática: Combine 10000 Unidades colagenase (Chemicals Worthington) com 83 mg Hialuronidase (Chemicals Worthington) em 4,150 mL de solução extracelular. Loja em 50 mL alíquotas a -20 ° C. Alíquotas pode ser usado por várias semanas. Quando estiver pronto para tratar a retina, diluir em 500 mL alíquota de bolhas solução extracelular. </li><li> De fosfato tamponada (PBS): Em 800 mL de H 2 O adicionar 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,4 g de Na 2 HPO 4 e 0,24 g de KH 2 PO 4. Trazer o pH para 7,4 com NaOH. Ajustar o volume para 1 L. </li><li> 0,2 M de tampão fosfato: Em 800 ml de H 2 O adicionar 21,8 g de Na 2 HPO 4 e 6,4 g de NaH 2 PO 4. Trazer volume de 1 L. </li><li> Solução de paraformaldeído 4%: Heat 50ml H 2 O a 60 ° C. Adicionar paraformaldeído 4g, mexa por alguns minutos. Adicione algumas gotas de NaOH 1M (cerca de 5 gotas), continue a mexer até que a solução é clara. Adicionar 50 ml de tampão fosfato 0,2 M em béquer. Verificar o pH com tiras de pH (~ 7,4). Filtro e cool. </li><li> Solução de bloqueio (soro de cabra 10%, 0,5% TritonX100): Em 1,8 ml de PBS adicionar 0,2 ml de soro de cabra e 10 mL Triton X-100. TritonX-100 serve para permeabilise o tecido. </li><li> Estreptavidina solução (soro de cabra 5%, 0,5% TritonX100, 1:500 Estreptavidina 594): Em 1,9 ml de PBS adicionar 0,1 ml de soro de cabra, 10 mL Triton X-100 e 4 mL de Estreptavidina 594. </li></ol> 2) Isolamento de retina de rato Ferramentas de dissecção necessários: 1 # 2 Pinça, 2 # 5 pinças, tesouras oftalmológica <ol><li> Euthanize do mouse de acordo com protocolos aprovados, neste caso, CO 2 asfixia e globo ocular enuclear suavemente inserir um ângulo # 2 pinças atrás do olho e levantando o globo ocular. </li><li> Lugar do globo ocular em uma placa de Petri 35 mm com solução extracelular. Cortar o nervo óptico e qualquer músculos extra-oculares associadas ou tecido conjuntivo com uma tesoura oftalmológica. Cortar a córnea com uma tesoura oftalmológica e retirar a lente usando # 5 fórceps. Rasgar a esclera usando um par de fórceps # 5 e use a pinça para cortar o nervo ótico, onde a retina ea esclera se encontram no disco óptico. Descascar delicadamente a retina de distância da ocular. Dica: Faça cada passo em ambas as retinas antes de passar para a próxima etapa para minimizar o tempo. </li><li> Use uma pinça para remover vítreo ligado à retina. Isto pode ser realizado por "agarrar" o vítreo transparente acima da retina com uma pinça. O vítreo, se removido com êxito, deve ser visível como uma substância clara e gelatinosa sobre o fórceps. Dica: Cortar pela metade retinas remoção do vítreo seguinte irá maximizar a quantidade de tecido utilizável e fazer a montagem na câmara mais fácil. </li><li> Manter o retinas em solução extracelular oxigenada à temperatura ambiente em um ambiente escuro com luz ambiente mínima até que estejam prontos para ser digerida. Retinas pode ser armazenado desta forma para a 6 horas. </li></ol> 3) O tratamento da retina com a mistura de enzima e de montagem na câmara de gravação <ol><li> Diluir uma alíquota de colagenase / hialuronidase em 500 mL de solução extracelular, a solução de colocar em um prato de Petri 35 mm e transferir a retina. </li><li> Manter a retina contêming placa de Petri, coberta e na escuridão, em 95% O2 / 5% CO 2 ambiente por 15 min com agitação suave. Este passo ajuda na digestão de qualquer vítreo restantes e permite fácil acesso à camada de células ganglionares. Dica: para retinas de animais mais jovens com menos vítreo ou se os efeitos adversos são observados, o tempo pode ser reduzido para aproximadamente 5 minutos. </li><li> Remover retina de enzimas contendo meio e lave bastante em solução extracelular </li><li> Transferir a retina na gravação da câmara 6 com a camada de fotorreceptores virada para baixo. Wick longe líquido restante com um pipeta ou tecido e um roll out lados da retina para achatar tecido que está sendo cuidado para tocar somente nas bordas da retina, principalmente evitando o contato com a camada de células ganglionares. Coloque um anel de platina com malha de nylon mais de retina para ancorar o tecido e imediatamente preencher a câmara com solução extracelular. </li><li> Monte a câmara de gravação para o palco microscópio, anexar tubo para perfusão gravidade e sucção a vácuo e anexar fio terra. </li></ol> 4) A localização das células ganglionares EGFP expressar e estimulação luminosa <ol><li> Perfundir a retina por gravidade com solução extracelular em uma taxa mL / min ou mais rápido. Dica: Se a taxa de perfusão é muito lento, o tecido não serão suficientemente oxigenado e sinalização sináptica pode ser interrompido. </li><li> Preencha uma pipeta de gravação com a solução intracelular e inseri-lo no suporte da pipeta. Dica: Pipetas com resistências na faixa de 3 a 5MΩ dar os melhores resultados. </li><li> Visualizar a retina sob infravermelho contraste de interferência diferencial (DIC) óptica com pequeno aumento (objetiva de 10X, NA 0,3) para localizar a pipeta de gravação. A luz infravermelha é usada para minimizar a exposição da retina à luz visível e minimizar adaptação luz. Mover-se para maior ampliação (objetiva de 40X, NA 0,8) e trazê-eletrodo à vista logo acima do tecido. </li><li> Em grande aumento (objetiva de 40X), iluminam a retina com epifluorescência (480 nm para EGFP) e selecione um gânglio fluorescentes e marca no monitor do computador com fita (Figura 1A). </li><li> Sob iluminação DIC e infravermelho, a posição do eletrodo de registro junto à células ganglionares específicas (Figura 1A). Limpe a área imediatamente cobrindo celular através da aplicação de pressão positiva suave para eletrodo de registro por meio de uma seringa de plástico 12cc conectados ao titular da pipeta com tubulação de polietileno. No amplificador, zero qualquer offsets de tensão. Eletrodo lugar em células ganglionares selecionado até que uma ondulação aparece na superfície da célula. </li><li> Com o amplificador no modo braçadeira de tensão, aplicar um pulso de teste e monitorar a passagem de corrente através da pipeta. Aplicar pressão negativa para criar vedação entre eletrodo e da célula. Liberação de pressão negativa quando a célula começa a vedação e espere até que corrente de retenção é indicativo de um selo GÊ elétrica entre a membrana da célula e pipeta. Aplicar suaves impulsos de pressão negativa até transientes capacitivo aparecer e, em seguida, liberar qualquer aplicação de pressão. Dica: se a resistência de acesso (série) é alta (&gt; 30MΩ), muitas vezes isso pode ser amenizada por outras, muito suave, os pulsos de pressão negativa. </li><li> Uma vez que um selo estável foi atingida aplicar um pulso de pressão negativa. Após o modo de toda a célula é obtido, permitem célula para se adaptar escuro por 5 minutos. Registro, no atual modo de fixação de resposta, para full-campo estímulo de luz branca (Figura 1B). </li><li> Após a gravação, Alexafluor-594 terá difundido para os dendritos. O marcador pode ser visualizado sob epifluorescência, em 594 nm e usado para determinar se um gânglio é On, Off, ou Bi-estratificada por alternar entre epifluorescência e DIC óptica infravermelha 5. </li><li> Se neurobiotin está incluído na pipeta e retina vai ser processadas para imunohistoquímica, em seguida, pipeta deve ser cuidadosamente recolhido para proporcionar o mínimo de interrupção da membrana. </li></ol> 5) A análise da anatomia das células ganglionares gravado Enchimento com neurobiotin permite uma análise mais detalhada morfológicas de células ganglionares da gravação. Dica: Se correlações específicas entre um gânglio gravado e morfologia detalhada é desejada, pode ser melhor para gravar e preencher apenas um RGC por preparação. <ol><li> Se neurobiotin foi incluído na solução intracelular, em seguida, colocar a retina em solução paraformaldeído e corrigir durante a noite a 4 ° C. </li><li> Enxágüe em PBS, pelo menos duas horas, pelo menos 6 mudanças. Transferir a retina de um prato contendo solução de bloqueio. Deixe em solução de bloqueio por 2 horas, temperatura ambiente em agitador. </li><li> Substituir a solução de bloqueio com a solução de estreptavidina. Incubar por 2 dias a 4 ° C em shaker. Lavar a retina em PBS, 6 lavagens, 20 min cada. </li><li> Monte a retina com Vectashield em uma lâmina de vidro.A retina deve ser colocado com as células ganglionares para cima. Realizar microscopia confocal (Figura 1C). </li></ol> Resultados representante Se a retina é saudável e, a dissecção foi bem sucedida, as células ganglionares indivíduo deve ser visível sob DIC em grandes ampliações (Figura 1A). Retinas insalubres terá núcleos, grandes granulado e deve ser descartada. Se a resposta sináptica de uma dada célula ganglionar está intacta, então a célula deve responder no início da luz ou compensado com potenciais de ação e, no caso de células ganglionares intrinsecamente fotossensíveis (Figura 1B), uma despolarização sustentada. <img src="/files/ftp_upload/2367/2367fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Localização, gravação e coloração de uma célula ganglionares da retina fluorescente etiquetado. (A) GFP RGC positiva visualizado sob iluminação de epifluorescência no aumento de 40 vezes (painel à esquerda) e sob iluminação DIC (painel direito). (B) a resposta de uma luz Synaptic células ganglionares da retina M2 intrinsecamente fotossensíveis registrados em todo o celular modo pinça de corrente de RGC fluorescente etiquetado. (C) M1 células ganglionares da retina intrinsecamente fotossensíveis que foi identificado sob epifluorescência, alvo de toda célula de gravação, cheia de neurobiotin, e então processadas para imunohistoquímica.

<ol><li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li>
<li>Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+light+responses+in+melanopsin-expressing+ganglion+cells+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development.</a> J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).</li>
<li>Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62, 327-334 (2009).</li>
<li>Siegert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+address+book+for+retinal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29, 476-482 (2009).</li>
<li>Newman, E. A., Bartosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eyecup+preparation+for+the+rat+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An eyecup preparation for the rat and mouse.</a> J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).</li>
<li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li>
<li>Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+retinal+dopaminergic+neurons+underlying+their+multiple+roles+in+vision%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision.</a> J Neurosci. 27, 692-699 (2007).</li>
<li>Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flattened+retina-eyecup+preparation+suitable+for+electrophysiological+studies+of+neurons+visualized+with+trans-scleral+infrared+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination.</a> J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).</li>
<li>Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+circuitry+mediating+light-evoked+signals+in+dark-adapted+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina.</a> Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).</li>
</ol>

Esta técnica é aplicável a qualquer gravações ganglionares da retina de células a partir de uma retina isolada. Embora na linha do rato usado acima intrinsecamente fotossensíveis, melanopsina expressando RGCs são rotulados com EGFP 2, 5, este protocolo é facilmente transferível para outros fluorescente etiquetado linhas RGC ou pode ser generalizada para gravar a partir de RGCs selecionados aleatoriamente também. Esta técnica é particularmente valioso porque o arbor dendríticas de cada RGC e seus respectivos n...

<table><tbody><tr><td>Meio de Ames&amp;rsquo;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS005273</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002592</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 594 Hidrazida</td><td>Invitrogen</td><td>A10442</td><td></td></tr><tr><td>Neurobiotina</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP1120</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodos</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Oftalmológica</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina 594</td><td>Invitrogen</td><td>S32356</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Cabra</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19210</td><td></td></tr></tbody></table>

uma preparação isolada da retina para gravar resposta luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Os primeiros passos na visão dos vertebrados ocorrem quando a luz estimula a bastonetes e cones da retina 1. Essas informações são então segregados em que são conhecidas como as vias de ON e OFF. A informação do sinal fotorreceptores de luz para as células bipolares (BCs), que despolarizar em resposta ao aumento (On ​​BCs) ou diminui (Off BCs) na intensidade da luz. Essa segregação da informação luz é mantido no nível das células ganglionares da retina (RGCs), que têm dendritos estratificação em qualquer sublamina o Off da camada plexiforme interna (IPL), onde recebem entrada excitatória direta de Off BCs, ou estratificação em o sublamina On do IPL, onde recebem entrada excitatória direta de On BCs. Essa segregação de informações sobre aumentos ou diminuições de iluminação (a On e Off caminhos) é conservada e sinalizada para o cérebro em paralelo. O RGCs são as células de saída da retina, e são, portanto, uma célula importante para o estudo, a fim de entender como a informação de luz é um sinal para os núcleos visuais no cérebro. Avanços da genética do rato nas últimas décadas resultaram em uma variedade de linhas repórter fluorescente mouse onde populações específicas RGC são rotulados com uma proteína fluorescente para permitir a identificação de subtipos RGC 2 3 4 e específicas destinadas para gravação eletrofisiológico. Aqui, apresentamos um método para a gravação respostas luz de células ganglionares fluorescente etiquetado em um intacto, isolado de retina. Esta preparação isolada da retina permite gravações de RGCs onde o arbor dendríticas está intacta e as entradas em todo o arbor dendríticas toda RGC são preservadas. Este método é aplicável em uma variedade de subtipos de células ganglionares e é passível de uma grande variedade de uma única célula técnicas fisiológicas.

Este artigo fornece uma descrição de como dissecar e registro da preparação isolada da retina em mouse. Em particular, descrevemos como luz para gravar as respostas de uma população fluorescente etiquetado células ganglionares e, posteriormente, identificar e analisar a sua morfologia.

Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina

As primeiras etapas da visão nos vertebrados ocorrem quando a luz estimula os fotorreceptores bastonetes e cones da retina 1. Essa informação é então...

O objetivo geral deste procedimento é registrar respostas evocadas pela luz em células ganglionares geneticamente marcadas na retina isolada de camundongo. Isso é realizado primeiramente dissecando a retina do olho do camundongo. O segundo passo do procedimento consiste em tratar a retina com enzima para remover o vítreo remanescente.O terceiro passo do procedimento consiste em montar a retina com o lado das células ganglionares voltado para cima na câmara de gravação, posicionar a câmara sobre a platina do microscópio e identificar as células ganglionares geneticamente marcadas. O passo final do procedimento é obter uma gravação em célula inteira da célula ganglionar identificada e registrar as respostas evocadas pela luz. Em última análise, podem-se obter resultados que demonstram as propriedades funcionais de um tipo definido de célula ganglionar na retina do camundongo e que definem os sinais que ela transmite ao cérebro por meio de gravações individuais com eletrodo de patch.Olá, meu nome é Tiffany Schmidt e sou aluna de pós-graduação em neurociência no laboratório do Dr. Paulo Ka Fuji na Universidade de Minnesota. Esta técnica permite a identificação e a gravação de uma popul

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui nós descrevemos um procedimento para a geração de adaptação ao escuro fatias da retina do rato para gravações eletrofisiológicas.

Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Nós descrevemos um método relativamente simples de transretinal eletrorretinograma (ERG) para a obtenção de gravações photoresponses haste e cone da retina do rato intacto. Esta abordagem tira vantagem do bloco de transmissão sináptica de fotorreceptores para isolar as suas respostas de luz e gravar os usando eléctrodos de campo colocados através da retina plana montado isolado.

Transretinal Recordings ERG de Retina do mouse: Rod e Photoresponses Cone

Este artigo descreve a gravação de células individuais de fluorescente etiquetado populações neuronais na retina do rato intacto. Usando dois fótons infravermelhos excitação transgenetically células marcadas foram alvo de patch-clamp de gravação para estudar as respostas de luz, as propriedades de campo receptivo, e morfologia.

Caracterização eletrofisiológica de GFP-Expressando populações de células na retina intacta

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55229/ single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells'&gt;Laboissonniere, et. al. RNA-seq de célula única de subconjuntos definidos de células ganglionares da retina. J. Vis. exp. (2017). Este vídeo demonstra uma técnica de rastreamento fluorescente para identificar subtipos de células ganglionares da retina (RGC) em uma retina de camundongo transgênico. O processo envolve proteger a retina isolada em uma...

Identificação de subtipos de células ganglionares da retina de camundongos por meio de rastreamento fluorescente

Nós descrevemos a preparação de fatias finas de retina aquático salamandras tigre...

Gravações Whole-cell simultâneas de fotorreceptores e os neurônios de segunda ordem em um anfíbio Retinal Slice Preparação

Este artigo vídeo ilustra os set-up, os procedimentos para consertar os corpos celulares e como implementar as gravações braçadeira dinâmicas a partir de células ganglionares em todo o monte do mouse retina. Esta técnica permite a investigação da contribuição precisa de inputs sinápticos excitatórios e inibitórios, e sua magnitude relativa e tempo para spiking neuronal.

Implementação da braçadeira dinâmico com Condutâncias Synaptic e Artificial em células ganglionares da retina do rato

Demonstraremos como preparar fatias de retina do olho do camundongo e registrar as respostas à luz nos neurônios da retina. Todo o procedimento é realizado em condições adaptadas ao escuro.

Gravação Light-provocou respostas pós-sinápticos nos neurônios em Dark-adaptados, Preparações da retina do rato fatia usando técnicas Grampo patch

Este protocolo demonstra como executar de células inteiras de gravação patch-clamp em neurônios da retina a partir de uma preparação flat-mount.

Patch-clamp gravação de células Starburst Amácrinas em um monte de Luxo Preparação de Deafferentated mouse Retina

Aqui, apresentamos uma abordagem combinatória para classificar tipos de células neuronais antes do isolamento e para a caracterização subsequente de transcriptomas de célula única. Este protocolo otimiza a preparação de amostras para o bem sucedido RNA Sequencing (RNA-Seq) e descreve uma metodologia projetada especificamente para a compreensão melhorada da diversidade celular.

Single-cell RNA-Seq de subgrupos definidos de células de gânglio retiniano

Milhões de pessoas sofrem de doenças degenerativas da retina que resultam em cegueira irreversível. Um elemento comum de muitas dessas doenças é a perda de células ganglionares da retina (RGCs). Este protocolo detalhado descreve o isolamento de RGC murinos primários por seleção positiva e negativa com citometria de fluxo.

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

Este trabalho apresenta uma preparação alternativa de retina flatmount na qual a remoção de corpos celulares fotorreceptores permite uma difusão mais rápida de anticorpos e um melhor acesso da pipeta de remendo aos neurônios internos da retina para experimentos de imunohistoquímica, hibridização in situ e eletrofisiologia.

Split Retina como uma Preparação Flatmount Melhorada para o Estudo de Neurônios da Camada Nuclear Interna na Retina de Vertebrados

Aprenda a registrar respostas à luz em células ganglionares geneticamente marcadas em retina isolada de camundongo. Este método de eletrofisiologia permite analisar propriedades funcionais e morfologia celular em neurociência.

Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina

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