Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina

O objetivo geral deste procedimento é registrar respostas evocadas por luz de células ganglionares geneticamente marcadas na retina isolada de camundongos. Isso é feito dissecando primeiro a retina do olho do camundongo. O segundo passo do procedimento é tratar a retina com enzima para remover o vítreo restante.

A terceira etapa do procedimento é montar as células ganglionares da retina com o lado voltado para cima na câmara de registro, montar a câmara no estágio do microscópio e identificar as células ganglionares geneticamente marcadas. A etapa final do procedimento é obter um registro de célula inteira da célula ganglionar identificada e registrar as respostas evocadas pela luz. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram as propriedades funcionais de uma célula ganglionar definida, digitam a retina do camundongo e definem os sinais que ela transmite ao cérebro por meio de gravações de grampo de patch de célula única.

Olá, meu nome é Tiffany Schmidt e sou estudante de pós-graduação em neurociência no laboratório do Dr. Paulo Ka Fuji na Universidade de Minnesota. Essa técnica permite a identificação e o registro de uma população de células ganglionares definida e geneticamente marcada e a análise morfológica subsequente. Essa técnica pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo visual, como como diferentes subtipos de células ganglionares processam as principais características dos estímulos visuais Antes de realizar a cirurgia.

Para remover a retina, a primeira tarefa é misturar as oito soluções necessárias para o experimento. Os ingredientes para todas as soluções usadas neste experimento são fornecidos no texto que acompanha. Transfira 200 mililitros da solução extracelular para um béquer de 250 mililitros para armazenamento na retina.

Colocar a solução extracelular restante num funil de separação para profusão por gravidade durante o registo. Ambas as soluções devem ser mantidas saturadas com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono o tempo todo. Para visualizar os dendritos durante o experimento, adicione um marcador fluorescente como LOR 5 94 à solução intracelular.

Se você planeja fazer imuno-histoquímica após o registro de células inteiras, adicione 0,3% de neurobiotina à solução intracelular. Uma vez preparadas as soluções necessárias, eutanasiar um camundongo por asfixia com dióxido de carbono, nuclear o globo ocular inserindo suavemente uma pinça número dois angulada atrás do olho e levantando o globo ocular. Use uma tesoura oftalmológica para limpar os músculos extraoculares e cortar o nervo óptico.

Coloque o globo ocular em uma placa de Petri de 35 milímetros cheia de solução extracelular. Corte a córnea com uma tesoura oftalmológica e retire a lente usando uma pinça número cinco. Use a pinça número cinco para abrir a esclera e cortar o nervo óptico restante onde a retina e a esclera se encontram.

Puxe suavemente a retina para longe da ocular, passando a pinça no espaço entre a retina e a esclera. Para economizar tempo, faça cada passo em ambas as retinas Antes de passar para a próxima etapa, um passo crucial é remover o vítreo ligado à retina. Comece usando uma pinça para agarrar o vítreo transparente acima da retina.

Se o vítreo for removido com sucesso, você verá uma substância gelatinosa pequena e clara na ponta da pinça. Corte cada retina ao meio para maximizar a quantidade de tecido utilizável e facilitar a montagem da retina na câmara de gravação. Coloque as retinas na solução extracelular oxigenada à temperatura ambiente e minimize a exposição à luz, permitindo apenas uma luz ambiente mínima, como a luz das telas dos computadores, as retinas permanecem viáveis por aproximadamente seis horas.

Após a dissecção, retire 500 microlitros da solução extracelular da solução na qual as retinas extras estão borbulhando. Dilua nele. Alíquota da solução enzimática de colagenase hialuronidase.

Coloque a solução enzimática em uma placa de Petri de 35 milímetros e transfira uma das retinas dissecadas para o Petri. Gire a placa de Petri por 15 minutos o tempo todo suavemente, superfundindo 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono na solução. A solução enzimática remove qualquer vítreo remanescente e permite um acesso mais fácil à camada de células ganglionares Para retinas de animais mais jovens com menos vítreo, ou se forem observados efeitos adversos, a digestão pode ser encurtada para cinco minutos.

Usando uma pipeta de transferência de plástico com uma ponta cortada. Remova a retina do meio contendo enzima. Lave a retina extensivamente em solução extracelular.

Transfira a retina para a câmara de gravação. Com a camada fotorreceptora voltada para baixo, remova qualquer fluido restante com uma pipeta ou lenço de papel e estenda as laterais da retina para achatar o tecido. Ter o cuidado de tocar apenas as bordas da retina e não a camada de células ganglionares.

Para ancorar a retina, coloque um anel de platina com malha de náilon sobre a retina e, em seguida, encha imediatamente a câmara com solução extracelular. Monte a câmara de gravação no microscópio stage e, em seguida, conecte o tubo para perfusão por gravidade da solução extracelular, o tubo de sucção a vácuo e o fio terra. Ajuste a gravidade para que goteje a um mililitro por minuto ou mais rápido.

Se a taxa de perfusão for muito lenta, o tecido não será suficientemente oxigenado e a sinalização sináptica pode ser interrompida. O próximo passo é configurar o eletrodo para gravação de adesivo de célula inteira. Selecione uma pipeta com uma resistência na faixa de três a cinco mega ohms.

Encha a pipeta de registo com uma alíquota descongelada de solução intracelular e insira-a no porta-pipetas utilizando iluminação infravermelha e contraste de interferência diferencial ou óptica DIC sob uma objetiva de 10 x. Visualize a retina e a pipeta de gravação. A luz infravermelha é usada para minimizar a exposição da retina à luz visível e para minimizar a adaptação à luz, mude para uma objetiva de 40 x e coloque o eletrodo à vista logo acima do tecido.

A linhagem de camundongos usada neste estudo expressa EGFP em suas células ganglionares e, portanto, as células ganglionares são visíveis sob epifluorescência. A microscopia ilumina a retina com epifluorescência a 480 nanômetros. Se a retina estiver saudável, as células ganglionares individuais devem ser visíveis.

Retinas insalubres terão grandes núcleos granulados e devem ser descartadas. Selecione uma das células ganglionares fluorescentes para gravação e use fita adesiva para marcar a célula selecionada no monitor do computador. Mude para a óptica infravermelha para que o corpo da célula ganglionar selecionado fique visível.

Posicione o eletrodo de gravação próximo à célula ganglionar alvo. Limpe a área que cobre imediatamente a célula aplicando uma leve pressão positiva na gravação. A pressão do eletrodo é aplicada por meio de uma seringa plástica de 12 cc conectada ao porta-pipetas com tubo de polietileno no amplificador zero.

Quaisquer compensações de tensão. Coloque o eletrodo na célula ganglionar selecionada até que uma covinha apareça na superfície da célula. Com o amplificador no modo de grampo de tensão, aplique um pulso de teste e monitore a corrente que passa pela pipeta.

Aplique pressão negativa para criar uma vedação entre o eletrodo e a célula. Libere a pressão negativa quando a vedação começar a se formar e espere até que a corrente de retenção seja indicativa de uma giga vedação elétrica entre a membrana da célula e a pipeta. Aplique pulsos suaves de pressão negativa até que apareçam transientes capacitivos indicando que o modo de gravação de célula inteira foi obtido e, em seguida, libere qualquer aplicação de pressão.

Se a resistência de acesso for superior a 30 mega ohms, isso geralmente pode ser melhorado por pulsos adicionais muito suaves de pressão negativa. Depois que o modo de célula inteira for obtido, desligue a luz infravermelha e cubra o microscópio com um pano preto. Deixe a célula se adaptar ao escuro por cinco minutos.

Após cinco minutos, a preparação está pronta para gravação. No modo de pinça atual, ative a estimulação de luz branca de campo total e registre a resposta da célula ganglionar. Se a célula ganglionar for estimulada várias vezes, a retina deve se adaptar ao escuro conforme necessário entre as estimulações.

O estímulo luminoso também pode ser modificado neste ponto para incluir estímulos padronizados ou cromáticos, a fim de avaliar as propriedades de resposta das células ganglionares após a gravação, o traçador fluorescente na solução intracelular terá se difundido para os dendritos alternando entre epifluorescência e óptica infravermelha DIC. O traçador pode ser visualizado sob epifluorescência a 594 nanômetros, e você pode examinar os dendritos para determinar se a célula ganglionar está ligada ou estratificada. A neurobiotina que foi adicionada à solução intracelular se difundiu na célula ganglionar e, portanto, o próximo passo é preparar a retina para a imuno-histoquímica.

Retraia a pipeta suavemente para minimizar a ruptura da membrana celular. Observe que, se você registrar e preencher apenas uma célula ganglionar da retina por preparação, poderá fazer correlações específicas entre a célula ganglionar registrada e sua morfologia detalhada. Em seguida, coloque a retina na solução de aldeído Paraform e fixe durante a noite a quatro graus Celsius após a fixação durante a noite.

Enxágue a retina fixa em PBS fazendo pelo menos seis trocas de solução de PBS ao longo de duas ou mais horas. Após o enxágue, transfira a retina para uma placa contendo solução bloqueadora, coloque a placa em uma coqueteleira e deixe descansar por duas horas. À temperatura ambiente, substitua a solução de bloqueio pela solução de evidência de estreptococos e coloque a retina de volta no agitador e deixe-a incubar por dois dias a quatro graus Celsius.

Após dois dias, enxágue a retina em PBS fazendo seis enxágues de 20 minutos cada para montar a retina. Coloque-o com o lado da célula ganglionar para cima em uma lâmina de vidro usando o escudo vetorial. Montagem da tampa do meio com uma tampa de vidro, deslizamento e vedação com esmalte, a célula ganglionar marcada agora pode ser examinada em um microscópio confocal.

Esta figura mostra células ganglionares da retina GFP positivas visualizadas sob iluminação epifluorescente com ampliação de 40 vezes à esquerda e sob iluminação DIC à direita. Se a retina estiver saudável e a dissecção for bem-sucedida, as células ganglionares individuais são visíveis sob DIC em alta ampliação. Retinas insalubres terão grandes núcleos granulados e devem ser descartadas.

Esta figura mostra o tipo de resposta à luz que é típica de um M dois na estratificação de células ganglionares retinianas intrinsecamente sensíveis a fotos. Dependendo do tipo de célula ganglionar da retina geneticamente marcada em uma determinada preparação, as propriedades de resposta serão diferentes. Se a resposta sináptica de uma determinada célula ganglionar estiver intacta, a célula deve responder no início da luz ou compensada com potenciais de ação.

E no caso de uma célula ganglionar intrinsecamente fotossensível, uma despolarização sustentada, esta figura de uma célula ganglionar cheia de neurobiotina mostra a morfologia de uma célula ganglionar retiniana tipicamente estratificada e intrinsecamente fotossensível. Após o registro de células inteiras, a imuno-histoquímica permite uma correlação da morfologia dendrítica e da resposta eletrofisiológica da célula ganglionar da retina. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de oxigenar bem a retina e perfundir o tecido rapidamente para preservar as respostas sinápticas.

Obrigado por assistir a esta demonstração.