Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina

O objetivo geral deste procedimento é registrar respostas evocadas pela luz em células ganglionares geneticamente marcadas na retina isolada de camundongo. Isso é realizado primeiramente dissecando a retina do olho do camundongo. O segundo passo do procedimento consiste em tratar a retina com enzima para remover o vítreo remanescente.

O terceiro passo do procedimento consiste em montar a retina com o lado das células ganglionares voltado para cima na câmara de gravação, posicionar a câmara sobre a platina do microscópio e identificar as células ganglionares geneticamente marcadas. O passo final do procedimento é obter uma gravação em célula inteira da célula ganglionar identificada e registrar as respostas evocadas pela luz. Em última análise, podem-se obter resultados que demonstram as propriedades funcionais de um tipo definido de célula ganglionar na retina do camundongo e que definem os sinais que ela transmite ao cérebro por meio de gravações individuais com eletrodo de patch.

Olá, meu nome é Tiffany Schmidt e sou aluna de pós-graduação em neurociência no laboratório do Dr. Paulo Ka Fuji na Universidade de Minnesota. Esta técnica permite a identificação e a gravação de uma população definida de células ganglionares geneticamente marcadas e subsequente análise morfológica. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da visão, como a forma pela qual diferentes subtipos de células ganglionares processam características-chave dos estímulos visuais antes de realizar a cirurgia.

Para remover a retina, a primeira tarefa é preparar as oito soluções necessárias para o experimento. Os ingredientes de todas as soluções utilizadas neste experimento estão indicados no texto acompanhante. Transfira 200 mililitros da solução extracelular para um béquer de 250 mililitros para armazenamento da retina.

Coloque a solução extracelular restante em um funil de separação para perfusão por gravidade durante a gravação. Ambas as soluções devem ser mantidas saturadas com 95%oxigênio, 5%dióxido de carbono em todos os momentos. Para visualizar as dendrites durante o experimento, adicione um marcador fluorescente, como LOR 5 94, à solução intracelular.

Se você planeja realizar imunohistoquímica após a gravação de célula inteira, adicione 0,3% de neurobiotina à solução intracelular. Uma vez que as soluções necessárias tenham sido preparadas, eutanazie um camundongo por asfixia com dióxido de carbono, enucleie o globo ocular inserindo suavemente uma pinça número dois em ângulo atrás do olho e levantando o globo ocular. Use tesoura oftalmológica para remover os músculos extraoculares e cortar o nervo óptico.

Coloque o globo ocular em uma placa de Petri de 35 milímetros cheia com solução extracelular. Corte a córnea com tesoura oftalmológica e remova a lente usando uma pinça número cinco. Use a pinça número cinco para rasgar a esclera e seccionar o nervo óptico remanescente no local onde a retina e a esclera se encontram.

Puxe suavemente a retina para longe do copo ocular, passando a pinça no espaço entre a retina e a esclera. Para economizar tempo, realize cada etapa em ambas as retinas antes de passar para a próxima etapa; uma etapa crucial é remover o vítreo aderido à retina. Comece usando a pinça para segurar o vítreo transparente acima da retina.

Se o vítreo for removido com sucesso, você verá uma pequena substância gelatinosa e transparente na ponta da pinça. Corte cada retina ao meio para maximizar a quantidade de tecido utilizável e facilitar a montagem da retina na câmara de gravação. Coloque as retinas na solução extracelular oxigenada à temperatura ambiente e minimize a exposição à luz permitindo apenas luz ambiente mínima, como a luz proveniente de telas de computador; as retinas permanecem viáveis por aproximadamente seis horas.

Após a dissecação, retire 500 microlitros da solução extracelular da solução na qual as retinas extras estão borbulhando. Dilua nela uma alíquota da solução enzimática de colagenase hialuronidase.

Coloque a solução enzimática em uma placa de Petri de 35 milímetros e transfira uma das retinas dissecadas para a placa. Gire a placa de Petri continuamente por 15 minutos, superperfundindo suavemente a solução com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. A solução enzimática remove qualquer vestígio de vítreo e facilita o acesso à camada de células ganglionares. Para retinas de animais mais jovens, com menos vítreo, ou se forem observados efeitos adversos, a digestão pode ser reduzida para cinco minutos.

Usando uma pipeta de transferência de plástico com a ponta cortada, remova a retina do meio contendo enzima. Lave a retina extensivamente com solução extracelular.

Transfira a retina para a câmara de registro. Com a camada de fotorreceptores voltada para baixo, remova qualquer fluido remanescente com uma pipeta ou papel absorvente e alise as bordas da retina para aplainar o tecido. Tenha cuidado para tocar apenas as bordas da retina e não a camada de células ganglionares.

Para fixar a retina, coloque um anel de platina com malha de náilon sobre a retina e, em seguida, encha imediatamente a câmara com solução extracelular. Monte a câmara de gravação sobre a platina do microscópio e conecte o tubo para perfusão por gravidade da solução extracelular, o tubo de sucção a vácuo e o fio terra. Ajuste a gravidade para que a gotejamento ocorra a uma taxa de um mililitro por minuto ou mais rápido.

Se a taxa de perfusão for muito lenta, o tecido não será suficientemente oxigenado e a sinalização sináptica poderá ser interrompida. O próximo passo é configurar o eletrodo para gravação de patch de célula inteira. Selecione uma pipeta com uma resistência na faixa de três a cinco megaohms.

Encha a pipeta de gravação com uma alíquota descongelada da solução intracelular e insira-a no suporte da pipeta utilizando iluminação infravermelha e óptica de contraste de interferência diferencial ou DIC sob uma objetiva de 10 x. Visualize a retina e a pipeta de gravação. A luz infravermelha é utilizada para minimizar a exposição da retina à luz visível e para reduzir a adaptação à luz; mude para uma objetiva de 40 x e traga o eletrodo para o campo de visão logo acima do tecido.

A linhagem de camundongos utilizada neste estudo expressa EGFP em suas células ganglionares, e, portanto, as células ganglionares são visíveis sob fluorescência epiluminiscente. A microscopia ilumina a retina com fluorescência epiluminiscente em 480 nanômetros. Se a retina estiver saudável, as células ganglionares individuais devem ser visíveis.

Retinas não saudáveis terão núcleos grandes e granulados e devem ser descartadas. Selecione uma das células ganglionares fluorescentes para gravação e use fita adesiva de laboratório para marcar a célula selecionada no monitor do computador. Alterne para óptica infravermelha para que o corpo da célula ganglionar selecionada fique visível.

Posicione o eletrodo de registro próximo à célula ganglionar alvo. Limpe a área imediatamente acima da célula aplicando pressão positiva suave ao registro. A pressão no eletrodo é aplicada por meio de uma seringa plástica de 12 cc conectada ao suporte da pipeta com tubo de polietileno no zero do amplificador.

Quaisquer desvios de tensão. Coloque o eletrodo sobre a célula ganglionar selecionada até que uma pequena reentrância apareça na superfície da célula. Com o amplificador no modo de fixação de tensão, aplique um pulso de teste e monitore a corrente que passa através da pipeta.

Aplique pressão negativa para criar um selo entre o eletrodo e a célula. Libere a pressão negativa quando o selo começar a se formar e aguarde até que a corrente de retenção indique um selo elétrico gigohm entre a membrana da célula e a pipeta. Aplique pulsos suaves de pressão negativa até que transientes capacitivos apareçam, indicando que o modo de gravação de célula inteira foi obtido, e então libere qualquer aplicação de pressão.

Se a resistência de acesso for maior que 30 megaohms, isso frequentemente pode ser melhorado com pulsos adicionais muito suaves de pressão negativa. Após obter o modo de célula inteira, desligue a luz infravermelha e cubra o microscópio com um pano preto. Deixe a célula se adaptar ao escuro por cinco minutos.

Após cinco minutos, o preparo está pronto para a gravação. No modo de fixação de corrente, ative a estimulação luminosa branca de campo total e registre a resposta da célula ganglionar. Se a célula ganglionar for estimulada múltiplas vezes, a retina deve ser deixada adaptar-se ao escuro conforme necessário entre as estimulações.

O estímulo luminoso também pode ser modificado neste momento para incluir estímulos padronizados ou cromáticos, a fim de avaliar as propriedades de resposta das células ganglionares após a gravação; a traçador fluorescente na solução intracelular terá se difundido até as dendrites ao alternar entre fluorescência epiluminiscente e óptica infravermelha DIC. O traçador pode ser visualizado em fluorescência epiluminiscente a 594 nanômetros, e é possível examinar as dendrites para determinar se a célula ganglionar é do tipo on-off ou estratificada. A neurobiotina que foi adicionada à solução intracelular difundiu-se para dentro da célula ganglionar, portanto o próximo passo é preparar a retina para imunohistoquímica.

Retire suavemente a pipeta para minimizar a perturbação da membrana celular. Observe que, se você registrar e preencher apenas uma célula ganglionar da retina por preparação, poderá então estabelecer correlações específicas entre a célula ganglionar registrada e sua morfologia detalhada. Em seguida, coloque a retina na solução de paraformaldeído e fixe durante a noite a quatro graus Celsius após a fixação durante a noite.

Lave a retina fixada em PBS, fazendo pelo menos seis trocas da solução de PBS ao longo de duas horas ou mais. Após a lavagem, transfira a retina para uma placa contendo solução bloqueadora, coloque a placa em agitador e deixe repousar por duas horas. À temperatura ambiente, substitua a solução bloqueadora pela solução strep evidence e retorne a retina ao agitador, deixando-a incubando por dois dias a quatro graus Celsius.

Após dois dias, lave a retina em PBS realizando seis lavagens de 20 minutos cada para montar a retina. Coloque-a com o lado das células ganglionares voltado para cima sobre uma lâmina de vidro usando vector shield. Cubra com meio de montagem, coloque uma lamínula e feche com esmalte, podendo agora observar a célula ganglionar marcada em um microscópio confocal.

Esta figura mostra células ganglionares da retina positivas para GFP visualizadas sob iluminação fluorescente epi com aumento de 40 vezes à esquerda e sob iluminação DIC à direita. Se a retina estiver saudável e a dissecação tiver sido bem-sucedida, células ganglionares individuais serão visíveis sob DIC com alto aumento. Retinas não saudáveis apresentarão núcleos grandes e granulados e devem ser descartadas.

Esta figura mostra o tipo de resposta à luz típica de uma célula ganglionar retiniana intrinsecamente fotossensível M dois com ramificação estratificada. Dependendo do tipo de célula ganglionar retiniana marcada geneticamente em uma preparação específica, as propriedades da resposta irão diferir. Se a resposta sináptica de uma determinada célula ganglionar estiver intacta, então a célula deve responder ao início ou ao fim da luz com potenciais de ação.

E no caso de uma célula ganglionar intrinsecamente fotossensível, uma despolarização sustentada; esta figura de uma célula ganglionar preenchida com neurobiotina mostra a morfologia de uma célula ganglionar retiniana intrinsecamente fotossensível típica do tipo M1 com estratificação em off. Após a gravação em célula inteira, a imunohistoquímica permite uma correlação entre a morfologia dendrítica e a resposta eletrofisiológica da célula ganglionar retiniana. Ao tentar realizar este procedimento, é importante lembrar-se de oxigenar adequadamente o compartimento retiniano e perfundir o tecido rapidamente para preservar as respostas sinápticas.

Obrigado por assistir a esta demonstração.