Criopreservação de tecido cortical Blocos de Geração de culturas altamente enriquecido Neuronal
11 de novembro de 2010
Aqui, nós descrevemos um método eficiente para criopreservação e descongelamento de blocos de tecido cortical do cérebro para gerar altamente enriquecido culturas neuronal. Este protocolo simples, fornece flexibilidade para a geração posterior de culturas de células neuronais, astrócitos, e neuronal precursor.
Olá, meu nome é Alan e sou um laboratório do Dr. Horney Lu na Universidade da Califórnia em Irvine, no Departamento de Neurobiologia e Comportamento. E eu sou Bob. Hoje, o Dr. Haro mostrará um protocolo rápido, eficiente e confiável para a criopreservação de rotina de blocos de tecido cortical para a degeneração subsequente de culturas neuronais primárias de alta qualidade.
Então vamos começar. O tecido limpo e picado é carregado em frascos criogênicos contendo 10% de TMSO. Meio de congelamento.
Os frascos criogênicos são carregados em um recipiente de congelamento e colocados a 80 graus Celsius negativos por pelo menos quatro horas. Frascos criogênicos congelados são então colocados em nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo. Para a cultura, o frasco criogênico AC é derretido em banho-maria morno e enxaguado com HBSS quente para remover o DMSO restante.
HBSS fresco é adicionado junto com tryin d ns para dissociação, após o que DMM com 10% EBS é adicionado. Para interromper a atividade enzimática dissociativa, as células são giradas para baixo e o pellet ressuspenso em DMM fresco mais 10% de EBS e plaqueado em placas de polilisina pré-revestidas. Após 24 horas, o DMM mudou para um meio neurobasal suplementado e cresceu por 10 dias.
Este protocolo usa uma lâmina de barbear de aço para cortar o tecido cortical antes do uso. A lâmina deve ser esterilizada em etanol 70% por pelo menos duas horas. Uma solução salina tamponada de Hank HBSS é criada diluindo uma solução estoque de 10 x em água esterilizada, a X-H-B-S-S é então mantida no gelo ou a quatro graus Celsius até o processamento do tecido.
O óxido de dimetilsulfa ou DMSO é usado como crioprotegido no meio de congelamento. Este protocolo usa um volume de 10% e diluição de volume de DMSO em um X-H-B-S-S-D-M-S-O deve misturar completamente antes de armazenar a quatro graus Celsius. Nalgene e recipiente de congelamento são usados para controlar a taxa de congelamento das amostras.
O recipiente de congelamento é carregado com frascos criogênicos de 2,5 mililitros que foram rotulados previamente. Também é uma boa ideia rotular os próprios recipientes de congelamento se você tiver mais de um e anotar o recipiente correspondente na bile. O meio de congelamento a 10% previamente resfriado, bem como o recipiente de congelamento, são levados para uma cabine de segurança biológica estéril.
Aqui, um mililitro de meio de congelamento é adicionado lentamente a cada um dos frascos criogênicos Depois de certificar-se de que as tampas estão seguras, coloque o recipiente de congelamento com os frascos a quatro graus Celsius por pelo menos duas horas antes do processamento do tecido. A lâmina de barbear previamente esterilizada precisa ser bem enxaguada. Três, três minutos de lavagem.
O uso de água esterilizada deve ser suficiente para remover qualquer etanol restante. Este procedimento de lavagem deve ser rápido, pois a navalha é propensa à oxidação por submersão prolongada e água estéril. Antes de limpar o lenço deve ser colocado em uma bolsa de gelo.
Enxágue levemente com um X-H-B-S-S frio para remover quaisquer detritos flutuantes. Agulhas esterilizadas são usadas para limpar os pedaços de tecido de quaisquer membranas e vasos sanguíneos restantes. Deve-se tomar cuidado para preservar a integridade estrutural do tecido durante a limpeza.
À medida que isso aumentar, a eficiência do corte de tecido limpo será visivelmente diferente do tecido cru e deve ter a maioria das membranas ou vasos sanguíneos removidos. Depois que um lenço de papel for limpo e enxaguado, o corte pode começar. É importante fazer cortes limpos do tecido criando blocos de aproximadamente um milímetro de tamanho cúbico.
Blocos muito grandes nivelam um menor rendimento celular no descongelamento. Os blocos menores, no entanto, o processamento excessivo também devem ser evitados. O tecido picado pode ser coletado usando uma pipeta automática e uma X-H-B-S-S.
Certifique-se de enxaguar o prato com HBSS para recuperar todo o tecido coletado. O tecido é então adicionado a um grande volume de um X-H-B-S-S e deixado cair no fundo, criando um pellet frouxamente compactado. Isso limpa quaisquer detritos restantes que possam estar presentes à medida que o tecido está se depositando no HBSS, recupere o recipiente de congelamento previamente resfriado e os frascos criogênicos antes de alocar o tecido.
Certifique-se de destampar todos os frascos para acelerar o processo de enchimento do tecido. A exposição ao DMSO à temperatura ambiente deve ser limitada a não mais de 10 minutos. É uma boa ideia trabalhar com um recipiente de congelamento de cada vez até que todo o tecido seja usado.
Comece a aspirar o sobrenadante de um tecido solto, milho pellet o mais próximo possível do pellet sem perturbá-lo. Em seguida, encaixe uma ponta de orifício de 200 microlitros de largura em uma pipeta. Não use um orifício de ponta menor, pois isso comprometerá a estrutura dos blocos que vão para o fundo do pellet do bloco de tecido.
Colete 200 microlitros de tecido lento. Adicione este tecido a um frasco criogênico e passe para o próximo até que todos os frascos estejam cheios. Pode precisar de uma regra de 10 minutos.
Coloque rapidamente o recipiente de congelamento em frascos criogênicos com freezer negativo de 80 graus Celsius por pelo menos quatro horas ou durante a noite se o tempo for limitado. Após tempo suficiente, remova o recipiente de congelamento do freezer e aloque os frascos criogênicos para uma caixa criogênica o mais rápido possível. Coloque a caixa criogênica em um rack de nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.
Remova um crio vil do nitrogênio líquido o mais rápido possível, limitando as caixas criogênicas A exposição à temperatura ambiente derrete rapidamente a amostra submergindo em um banho-maria de 37 graus Celsius. Sempre mantendo a tampa acima da água. Verifique com frequência e continue descongelando até que um pequeno gelo P seja observado.
Antes de trazê-lo para a cabine de segurança, esterilize o crio vil com 70% de etanol. Prossiga para adicionar o tecido de descongelamento a um grande volume de um quente X-H-B-S-S se o tecido permanecer nas paredes do crio vil. Delicadamente coletado com HBSS.
Uma vez que todo o tecido foi coletado. Inverta o tubo três a quatro vezes e deixe o tecido assentar no fundo. Esta etapa garante diluição suficiente de DMSO.
Assim que o tecido estiver assentado, aspire o máximo possível do super natin. Em seguida, adicione 10 mililitros de um X-H-B-S-S fresco e quente a isso. Adicione 300 microlitros de 0,25% de tripsina e 50 microlitros de DNAs.
Prossiga para dissociar o tecido com agitação suave, criando uma suspensão celular turva após a dissociação do tecido. Pare a atividade enzimática adicionando DM quente a mais suspensões de células de centrização EPS de soro bovino enriquecido a 10% a 1200 G por cinco minutos. Ressuspenda o pellet celular em DMEM fresco mais 10% EBS e placa em placas revestidas de polilisina.
Deixe as células se prenderem aos pratos por 30 minutos. Em seguida, substitua a mídia por DM novo mais 10% EBS. Após 24 horas, substituir o meio contido em MS por meio neurobasal suplementado com N dois e B 27 e crescer por 10 dias.
Acabamos de detalhar um protocolo vasto, eficiente e confiável com uma preservação rotineira de criação de bloqueios de tecido cortical. Então, boa sorte.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método para a criopreservção eficiente e o descongelamento de blocos de tecido cerebral cortical, facilitando a geração de culturas neuronais enriquecidas. O protocolo permite o cultivo subsequente de culturas neuronais, de astrócitos e de células precursoras neuronais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Preservação de Tecidos
Fundo
- A criopreservção é essencial para manter a viabilidade do tecido cerebral.
- Técnicas eficientes de descongelamento são cruciais para uma cultura celular de alta qualidade.
- Culturas neuronais são vitais para vários estudos neurobiológicos.
- Os protocolos devem garantir danos mínimos à integridade do tecido durante o processamento.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método de criopreservção confiável para tecido cortical.
- Aumentar o rendimento das culturas neuronais primárias.
- Fornecer um protocolo flexível para gerar vários tipos celulares a partir de tecido preservado.
Métodos Utilizados
- Preparação de blocos de tecido cortical usando uma lâmina de barbear esterilizada.
- Uso de 10% de DMSO na mídia de congelamento para criopreservção.
- Descongelamento do tecido em um banho de água quente para minimizar a formação de cristais de gelo.
- Dissoção do tecido descongelado usando tripsina e DNase para cultura celular.
Principais Resultados
- O protocolo preserva com sucesso a viabilidade do tecido cortical.
- Culturas neuronais de alta qualidade foram obtidas após o descongelamento.
- Foi demonstrada flexibilidade na geração de diferentes tipos celulares.
- Métodos eficientes para processamento de tecido foram estabelecidos.
Conclusões
- O método de criopreservção descrito é eficaz para tecido cerebral cortical.
- Este protocolo pode ser adaptado para várias aplicações de cultura neuronal.
- Estudos futuros podem se basear neste método para pesquisa neurobiológica avançada.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Standardized cryopreservation of cortical tissue blocks enables reliable generation of highly enriched neuronal cultures, supporting consistent early discovery and assay development in neurobiology-focused R&D. This protocol increases operational flexibility and resource efficiency by decoupling tissue collection from downstream culture initiation, reducing biological variability and supporting scalable, reproducible workflows. The approach is directly relevant for biopharma teams seeking robust, bankable sources of primary neuronal and glial cells for target validation and screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent access to high-quality neuronal and astrocyte cultures for mechanistic studies.
- Supports functional target validation by providing reproducible primary cell systems.
- Facilitates biological de-risking through standardized tissue processing and storage.
- Improves predictive confidence in early-stage neurobiology research.
Screening & Assay Development
- Provides validated, reproducible cell sources for assay standardization and optimization.
- Enables scalable preparation of neuronal cultures for compound screening workflows.
- Supports quantitative readouts and reproducibility across experimental batches.
- Reduces batch-to-batch variability by allowing synchronized culture initiation.
Translational & Preclinical Research
- Facilitates generation of neural precursor cell cultures for disease-relevant modeling.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling flexible timing of culture generation.
- Aligns with translational biomarker studies requiring consistent primary cell sources.
- Reduces risk of biological drift in long-term research programs.
Pipeline & Workflow Integration
This cryopreservation protocol positions tissue banking as a foundational capability from early discovery through preclinical research, enabling on-demand generation of neuronal and glial cultures for diverse R&D needs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway analysis with standardized primary cultures.
- Screening: Provides assay-ready cells for reproducible compound evaluation and quantitative analysis.
- Analytics: Enables consistent measurement of neuritic growth and network expansion across experiments.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease models and biomarker studies using neural precursor-derived cultures.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue resource for multiple projects and cross-functional teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuronal assays.
- Operational Value: Standardizes tissue processing, enhances reproducibility, and supports scalable workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile tissue handling and primary cell culture techniques.
- Needs access to controlled-rate freezing equipment and liquid nitrogen storage.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and labeling protocols.
- Adaptation may be needed for different brain regions or species.
- Cell yield and viability depend on precise block sizing and handling as described.
