Name: Criopreservação de tecido cortical Blocos de Geração de culturas altamente enriquecido Neuronal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprenda a criopreservar blocos de tecido cortical para gerar culturas neuronais enriquecidas de alta qualidade. Este método utiliza DMSO e técnicas de descongelação controlada para preservar a viabilidade celular em pesquisas neurobiológicas.

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Esta pesquisa foi suportada por concessões do Programa de Graduação Oportunidades de Pesquisa da UCI (AR e SP) e subvenções do Estado da Califórnia Initiative da doença de Alzheimer e os Institutos Nacionais de Saúde não conceder. HD38466, e doença de Alzheimer Research Center não conceder. AG16573 (JB)

1. Criopreservação de tecido cortical Blocos Preparação de material <ol><li> Preparar a solução de 1X Hank Sal Buffered (HBSS), diluindo a solução estoque 10X em água estéril (1:9). HBSS armazenar a 4oC. </li><li> Prepare meio de congelamento de 10% DMSO por diluição de DMSO em HBSS (1:9). O meio de congelamento deve ser feita antes da criopreservação fresco e armazenado a 4oC até refrigerados. </li><li> Uma lâmina de barbear de aço é usada para o corte sistemático de tecido. Antes do uso, a lâmina de barbear é esterilizado por submersão em etanol 70% para 2 hr. Imediatamente antes da transformação do tecido, lavar a lâmina com água estéril 3 vezes. Evite deixar a lâmina em água estéril para uma quantidade excessiva de tempo, como é propensa à oxidação. </li><li> Um recipiente de congelamento Nalgene é carregado com criotubos (2,5 mL) e depois levados a um gabinete estéril biológica. 1 mL de meio de congelamento refrigerados é adicionado a cada frasco. O recipiente de congelamento é então colocada a 4oC por pelo menos 2 horas. </li></ol> Limpeza, Chopping, e Congelamento <ol><li> O tecido cerebral para ser congelado é limpo da membrana meníngea e vasos sanguíneos. Use dicas agulha estéril para remover cuidadosamente os restos de tecido, enquanto trabalhava em cima de um bloco de gelo. Tecido limpas devem ser lavadas levemente com HBSS frio e transferidos para uma placa de Petri nova para cortar. </li><li> Trabalhando em cima de um bloco de gelo, use uma lâmina de barbear esterilizados para rapidamente cortar o tecido em aproximadamente 1 mm a 3 quadras. Trabalhar com pequenas porções de tecido limpo em um tempo resulta em um melhor controle sobre o processo de corte, resultando em tamanhos de bloco mais uniforme. </li><li> Lentamente, adicionar o tecido cortado em 50 mL de HBSS em um tubo cônico de 50 mL. Lave o prato de Petri com HBSS a fim de recolher todos os blocos tecido remanescente. Permitir que os blocos de tecido para descer ao fundo do tubo, criando um tecido ligeiramente comprimido bloco pellet. </li><li> Enquanto o tecido está se instalando, trazer o recipiente previamente refrigerados congelamento e criotubos para o gabinete de segurança biológica. Destape todos os criotubos para apressar o processo de adição de tecido. </li><li> Depois de todos os blocos de tecido se instalaram, aspirar cuidadosamente a HBSS excesso, deixando uma camada muito fina de mídia acima da pelota. Centrifugação é desencorajado, pois ele fará com que os blocos de tecido para aderir uns aos outros, diminuindo significativamente a eficiência de congelamento. </li><li> Lentamente coletar 200 mL do fundo do bloco de tecido solto pellet usando ponteira com orifícios de largura (cortar a ponta com uma tesoura esterilizada). Transferir o material para um cryovial e passar para o tecido, ao lado de novo recolher do fundo do sedimento. É essencial que o procedimento de atribuição de todo o tecido não leva mais do que 3-4 min por recipiente de congelamento. Isso garante que o tecido é exposto a DMSO por apenas um curto período de tempo antes do congelamento. Depois de transferir o tecido para os frascos, colocar o recipiente em congelamento a-80oC freezer por pelo menos 4 horas. Alternativamente, o recipiente de congelamento podem ser deixados durante a noite a -80 oC. Repita esse processo para todos os recipientes de congelamento restantes. </li><li> Transferir os criotubos do recipiente de congelamento (s) para um cryobox e coloque em um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo. </li></ol> 2. Descongelamento e Cultivo de Blocos Congelados tecido cortical Preparação de material <ol><li> Um dia antes de amostras de tecido de descongelamento, poli-L-lisina revestido Petri pratos / lamelas estão preparados. Em geral, para os neurônios corticais que preparam pratos revestido com 500 mcg / mL ou 1 mg / mL. Adicione o suficiente solução de poli-L-lisina (feita em tampão borato) para cobrir totalmente o fundo do prato. Se lamínulas de vidro são necessários, garantir que eles são completamente submerso na solução de poli-L-lisina. Incubar por pelo menos 12 hr. Antes de usar, lave os pratos com uma quantidade generosa de água estéril 3 vezes, 5 min cada. </li><li> HBSS quente é usado para limpar o tecido descongelado, bem como dissociar o tecido em células em suspensão. O volume de HBSS necessário irá variar dependendo da quantidade de tecido a ser descongelado, mas normalmente um cryovial irá diluir em 50 mL de HBSS e será dissociada em 10 mL de HBSS. </li><li> Modificado Dulbecco Medium Eagle com 10% de ferro suplementado bovinos soro bovino (EBS) e 1% antibiótico / antimicótico (AA) mistura (DMEM (++)) deve ser colocado em banho-maria a 37 ° C. </li><li> Médio chapeamento (NB (+++)) deve ser feito fresco antes de usar. Este meio é preparado pela adição de 1% antibiótico / antimicótico mais B27 e suplementos N2. </li></ol> Nota: Nomes de mídia anexados com cruzes (+) indicam a inclusão de aditivos à base de composição dos meios de comunicação. Neste texto, DMEM (+ +) denota DMEM acrescido de 10% EBS mais 1% AA, enquanto NB (+++) denota NB plnos 1% AA mais B27 além de N2. Descongelamento e Cultivo <ol><li> Remova a criotubos do tanque de nitrogênio líquido e descongelamento rápido a 37 ° C em banho-maria até que apenas uma pequena pelota de gelo é observada dentro do conteúdo do frasco. </li><li> Gentilmente transferir o conteúdo para frasco 50 ml de HBSS quente em um tubo cônico. Use uma ponta de orifício largo para desalojar qualquer gentilmente blocos tecido remanescente preso no cryovial. Inverter o tubo 3-4 vezes e permitir que o tecido para coletar lentamente na parte inferior. Tecido deve resolver rapidamente, mas se os blocos são muito pequenos isso não pode ocorrer e luz centrifugação (~ 200 x g) é recomendado. </li><li> Aspirar HBSS excesso. </li><li> Adicionar 10 mL de HBSS quente para o tecido da pelota e 300 mL de tripsina 0,25% e 50 mL de DNAase. Incubar em banho-maria a 37 ° C por 5 min, em seguida, coloque em um agitador orbital ajustado para 80 rpm e 37 ° C para um adicional de 5 min. </li><li> Após este período, trazer os blocos de tecido em um gabinete de segurança biológica e usar uma pipeta 10 mL com cuidado agitar os blocos de tecido até obter uma suspensão celular nublado é formado. Desactivar a tripsina, adicionando 10 mL de DMEM quente (+ +) para a suspensão de células. </li><li> Centrifugar as células dissociadas em 1200 x g por 5 min. Aspirar e desprezar o sobrenadante, ressuspender o pellet celular em 10 mL de DMEM quente (+ +) e quantificar o número de células usando um hemocitômetro. </li><li> Células placa de poli-L-lisina pratos revestido. Tipicamente, um prato de 60 mm será revestida com 1x10 6 células. </li><li> Permitir que as células para anexar ao prato / lamínulas durante aproximadamente 1 hora na cultura de tecidos incubadora. É recomendado para monitorar o progresso de apego em uma placa a cada 10 minutos até apego eficaz é observado. Então, gentilmente substituir o meio com DMEM fresco (++). </li><li> Após 24 horas, substituir o DMEM (+ +) com água morna NB (+++). Alterações médias parciais (50%) são realizadas a cada 5 dias com novas NB (+++). Culturas saudáveis ​​normalmente apresentam sinais de diferenciação e crescimento dos processos após 24 hrs. Sob essas condições, e realizando mudanças médio parcial a cada 4-5 dias, as culturas podem ser mantidas por períodos prolongados de tempo até 4-6 semanas. </li><li> Para a geração de células precursoras neuronais (NPCs), um protocolo semelhante é usado com a ressalva de que após a centrifugação, DMEM sem EBS é usado. As células são plaqueadas em frascos T-25 em DMEM/F12 (1:3), suplementado com B27 e EGF (20 ng / mL) para permitir a formação de neuropheres. Para diferenciar NPCs, neurospheres são semeadas em laminina (10 ug / mL) lamínulas revestido em DMEM/F12 (1:3) meio suplementado com N2. </li></ol> 3. Resultados representante Culturas saudáveis ​​irá mostrar um crescimento significativo e diferenciação após 5 dias pós-descongelamento e normalmente irá estabilizar em seu crescimento por 10 dias (Figura 1). Coloração Immuncocytochemical destas culturas revela numerosos astrócitos (Figura 2A) e neurônios (Figura 2B), tanto para humanos e ratos culturas primárias neuronais. Este protocolo também é adequado para a geração de NPCs como livre-flutuante neurospheres (Figura 3A), que, em condições de diferenciação, resultam em culturas de alta qualidade mista (Figura 3B, C). <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Culturas de células de tecidos humanos congelados cortical. Congelados humana blocos de tecido cortical são descongeladas e semeadas em poli-lisina lamínulas revestido e cresceu por 10 dias. De dia 5 expansão celular é aparente e por 10 dias confluência seja alcançado. Barra de escala: 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Coloração imunocitoquímica de culturas de células. (A) As culturas foram coradas com o marcador glial fibrilar glial proteína ácida (GFAP, setas grossas). (B) Os neurônios foram detectados com o marcador neuronal beta-tubulina III (TIII, setas finas). (C) Ambas as culturas humanas e de ratos mostram abundantes e glia neurônios após 10 dias de cultura. Anticorpos primários: mouse anti-GFAP (1:1000) e de coelho anti-TIII (1:1000). Anticorpos secundários: anti-rato Alexa 594 (1:500) e anti-coelho Alexa 488 (1:500). Coloração núcleos: Hoestch azul (1:1000). Barra de escala: 50 mm. <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Geração de neurospheres. (A) de tecido congelado foi processado como descrito acima e permissão para se propagar como neurospheres. (B) Neurospheres foram semeadas em lamínulas em condições de diferenciação e crescimento por 10 dias, resultando em células migram longe do neurosphere. (C) Ambos os neurônios e astrócitos estão presentes na franja expansão de um neurosphere diferenciação. Contracoloração nuclear, os anticorpos primário e secundário usado como na Figura 2.

<ol><li>Robbins, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human brain tissue.</a> Exp Neurol. 107, 208-213 (1990).</li>
<li>Ware, C. B., Nelson, A. M., Blau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled-rate+freezing+of+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Controlled-rate freezing of human ES cells.</a> Biotechniques. 38, 879-880 (2005).</li>
<li>Paynter, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+practical+issues+for+cryopreservation+of+nerve+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells.</a> Brain Res Bull. 75, 1-14 (2008).</li>
<li>Thirumala, S., Gimble, J. M., Devireddy, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+stromal+vascular+fraction+of+adipose+tissue+in+a+serum-free+freezing+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium.</a> J Tissue Eng Regen Med. 4, 224-232 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Criopreservação oferece a oportunidade de amostras de cérebro banco precioso tecido para uso futuro. Aqui nós descrevemos um protocolo simples, mas eficaz para gerar tanto neurônio enriquecido culturas e células precursoras neuronais a partir de blocos de tecido congelado cérebro. Este procedimento evita os custos econômicos das técnicas de criopreservação tradicionais que utilizam mais caro taxa controlada freezers. O protocolo permite a geração de culturas viáveis ​​neuronal pós-descongelamento, proporcionando um meio rápido, mas eficaz para congelar blocos de tecido. O processo de congelamento completo pode demorar tão pouco como 20 minutos. Além de culturas primárias de neurônios, o uso desse blocos de tecido método também pode ser descongelado para gerar NPCs cresceu como livre neurospheres flutuante. A este respeito, a falta de soro no nosso meio de congelamento garante que as células são preservadas em um estado indiferenciado. Em condições de diferenciação, neurospheres produzido a partir de tecidos congelados de expansão show e as taxas de diferenciação muito comparável à neurospheres gerados a partir de tecido fresco.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;Meio de Eagle Modificado (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11995-073</td><td>Glicose alta 1X</td></tr><tr><td>Soro de bezerro bovino suplementado</td><td>Hyclone</td><td>SH30072.03</td><td>Para o meio de cultura </td></tr><tr><td>Meio Neurobasal-A (1X), líquido</td><td>Invitrogen</td><td>1088-022</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Suplemento para o meio Neurobasal</td></tr><tr><td>Suplemento N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Suplemento para o meio Neurobasal</td></tr><tr><td>Tripsina (10X)</td><td>Cellgro</td><td>25-054CI</td><td>Dissociação tecidual</td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease 1 do pâncreas bovino (DNase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527-30KU</td><td>Dissociação tecidual</td></tr><tr><td>Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS) (10X)</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>14065</td><td>Limpeza do tecido, lavagens e meio de congelamento</td></tr><tr><td>Polilisina-L – 500 mg</td><td>Invitrogen</td><td>P2636</td><td>Substrato para adesão de células neuronais</td></tr><tr><td>antibiótico-antimicótico (100X), líquido</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Para prevenir contaminação</td></tr><tr><td>Pipetas com orifício grande (1-200 μl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-141</td><td>Para prevenir estresse por cisalhamento nas células</td></tr><tr><td>Pipetas graduadas (101-1000 μl)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-2721</td><td></td></tr><tr><td>21 agulhas-guia de precisão G1</td><td>BD Biosciences</td><td>305165</td><td>Para limpar o tecido</td></tr><tr><td>Pipeta de 10 ml </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1071-0810</td><td>Embalado individualmente</td></tr><tr><td>tubos de 50 ml</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>926-9-04</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear de borda única</td><td>Smith &amp;& Nephew Inc.</td><td>67-0238</td><td>Para cortar o tecido</td></tr><tr><td>placa de Petri de poliestireno de 60 x 15 mm </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0160</td><td>Para cultura geral</td></tr><tr><td>placa de Petri de poliestireno 100 x 15 mm </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0010</td><td>Para limpeza de tecido</td></tr><tr><td>Caixa criogênica </td><td>Nalge Nunc International</td><td>5026-1010</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente para congelação</td><td>Nalge Nunc International</td><td>5100-0001</td><td>&quot;Mr. Frosty&quot;</td></tr><tr><td>frascos criogênicos de 2,0 ml</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5012-0020</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td>Para meio de congelação</td></tr><tr><td>Etanol 200 provas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Para esterilizar lâmina de barbear</td></tr></tbody></table>

criopreservação de tecido cortical blocos de geração de culturas altamente enriquecido neuronal

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Neste estudo, descrevemos um protocolo padronizado para a criopreservação e descongelamento de blocos de tecido cortical do cérebro para gerar altamente enriquecido culturas neuronal. Para este protocolo o meio de congelamento utilizado é de 10% dimetil sulfóxido (DMSO) diluído em solução de Hank Sal Buffered (HBSS). Blocos de tecido cortical são transferidos para criotubos contendo o meio de congelamento e, lentamente, congelados a -1 ° C / min em um recipiente taxa controlada de congelamento. Pós-descongelamento de processamento e dissociação de blocos de tecido congelado consistentemente produzidos neuronal enriquecido culturas que apresentaram crescimento rápido durante neuríticas os primeiros 5 dias em cultura e expansão significativa da rede neuronal em 10 dias. Coloração imunocitoquímica com o marcador glial fibrilar astrocíticos proteína ácida (GFAP) e do marcador neuronal beta-tubulina classe III, revelou um alto número de neurônios e astrócitos em culturas. Geração de culturas de células precursoras neurais após a dissociação do tecido bloco resultou em rápida expansão neurospheres, que produziu um grande número de neurônios e astrócitos em condições de diferenciação. Este protocolo de criopreservação simples permite a preservação rápido, eficiente e barata de blocos de tecido cortical do cérebro, que concede uma maior flexibilidade para a geração posterior de culturas de células neuronais, astrócitos, e neuronal precursor.

Aqui, nós descrevemos um método eficiente para criopreservação e descongelamento de blocos de tecido cortical do cérebro para gerar altamente enriquecido culturas neuronal. Este protocolo simples, fornece flexibilidade para a geração posterior de culturas de células neuronais, astrócitos, e neuronal precursor.

Criopreservação de tecido cortical Blocos de Geração de culturas altamente enriquecido Neuronal

Neste estudo, descrevemos um protocolo padronizado para a criopreservação e o descongelamento bem-sucedidos de blocos de tecido cerebral cortical para gerar altamente ...

Olá, meu nome é Alan e sou do laboratório da Dra. Horney Lu, da Universidade da Califórnia em Irvine, no Departamento de Neurobiologia e Comportamento. E eu sou Bob. Hoje, a Dra. Haro mostrará a vocês um protocolo rápido, eficiente e confiável para a criopreservação rotineira de blocos de tecido cortical, visando o subsequente estabelecimento de culturas primárias neuronais de alta qualidade.Então vamos começar. O tecido limpo e picado é colocado em frascos criogênicos contendo meio de congelamento com 10% de DMSO.Os tubos criogênicos são colocados em um recipiente de congelamento e armazenados a menos 80 graus Celsius por pelo menos quatro horas. Os tubos criogênicos congelados são então transferidos para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo. Para o cultivo, o tubo criogênico é descongelado em banho-maria aquecido e lavado com HBSS morno para remover o DMSO remanescente.HBSS fresco é adicionado juntamente com tripsina para dissociação, após o qual DMM com 10% EBS é adicionado. Para interromper a atividade enzimática dissociativa, as células são centrifugadas e o pellet é ressuspenso em DMM fresco mais 10% EBS e plaqueado em placas pré-revestidas com polilisina. Após 24 horas, o DMM é substituído por um meio neurobasal suplementado e cultivado por 10 dias.Este protocolo utiliza uma lâmina de aço para cortar o tecido cortical antes do uso. A lâmina deve ser esterilizada em etanol 70% por pelo menos duas horas. Uma vez a solução salina tamponada com Hank (HBSS) é preparada pela diluição de uma solução estoque 10 vezes em água esterilizada; a solução uma vez HBSS é então mantida em gelo ou a quatro graus Celsius até o processamento do tecido.O óxido sulfídrico dimetílico ou DMSO é utilizado como crioprotetor no meio de congelamento. Este protocolo utiliza uma diluição de 10% em volume de DMSO em um X-H-B-S-S-D-M-S-O que deve ser completamente misturado antes do armazenamento a quatro graus Celsius. Um recipiente de congelamento Nalgene é utilizado para controlar a taxa de congelamento das amostras.O recipiente de congelação é carregado com criotubos de 2,5 mililitros que foram previamente rotulados. Também é recomendável rotular os próprios recipientes de congelação, caso você tenha mais de um, e anotar o recipiente correspondente na amostra de bile. A solução crioprotetora com DMSO 10% previamente resfriada, assim como o recipiente de congelação, são levados para dentro de uma cabine de segurança biológica estéril.Aqui, um mililitro de meio de congelamento é lentamente adicionado a cada um dos frascos criogênicos. Após verificar que as tampas estão bem fechadas, coloque o recipiente de congelamento com os frascos a quatro graus Celsius por pelo menos duas horas, logo antes do processamento do tecido. A lâmina de barbear previamente esterilizada precisa ser bem enxaguada. Três lavagens de três minutos.O uso de água esterilizada deve ser suficiente para remover qualquer etanol remanescente. Este procedimento de lavagem deve ser rápido, pois a lâmina é propensa à oxidação por imersão prolongada em água estéril. Antes da limpeza, o tecido deve ser colocado sobre uma bolsa de gelo.Lave levemente com uma X-H-B-S-S fria para remover qualquer detrito solto. Agulhas esterilizadas são usadas para limpar os fragmentos de tecido de quaisquer membranas e vasos sanguíneos remanescentes. É necessário ter cuidado para preservar a integridade estrutural do tecido durante a limpeza.À medida que isso aumentar, a eficiência do picotamento do tecido limpo será visivelmente diferente da do tecido bruto e deverá ter a maioria das membranas ou vasos sanguíneos removidos. Uma vez que o tecido tenha sido limpo e enxaguado, o picotamento pode ser iniciado. É importante fazer cortes precisos no tecido, criando blocos com aproximadamente um milímetro cúbico de tamanho.Blocos que são muito grandes resultam em um rendimento celular menor após o descongelamento. Os blocos menores, no entanto, devem evitar o processamento excessivo. O tecido picado pode ser coletado usando uma pipeta automática e um pouco de H-B-S-S X frio.Certifique-se de lavar a placa com HBSS para recuperar todo o tecido coletado. O tecido é então adicionado a um grande volume de HBSS 1X e deixado decantar até o fundo, formando um pellet frouxamente compactado. Isso remove qualquer detrito remanescente que possa estar presente enquanto o tecido se sedimenta no HBSS. Recupere o recipiente de congelamento previamente resfriado e os criotubos antes de distribuir o tecido.Certifique-se de destampar todos os frascos para acelerar o processo de preenchimento do tecido. A exposição ao DMSO em temperatura ambiente deve ser limitada a não mais de 10 minutos. É recomendável trabalhar com um recipiente de congelamento por vez até que todo o tecido seja utilizado.Comece a aspirar o sobrenatante de um tecido solto, posicionando o pipetador o mais próximo possível do pellet sem perturbá-lo. Em seguida, acople uma ponteira de orifício largo de 200 microlitros a uma pipeta. Não utilize um orifício de ponteira menor, pois isso comprometerá a estrutura dos blocos que vão para o fundo do pellet do bloco de tecido.Colete 200 microlitros de tecido lentamente. Adicione este tecido a um tubo criogênico e prossiga para o próximo até que todos os tubos estejam cheios. Pode ser necessário seguir uma regra de 10 minutos.Coloque rapidamente o recipiente de congelamento em tubos criogênicos no congelador a menos 80 graus Celsius por pelo menos quatro horas ou durante a noite, caso o tempo seja limitado. Após tempo suficiente, retire o recipiente de congelamento do congelador e distribua os tubos criogênicos em uma caixa criogênica o mais rapidamente possível. Coloque a caixa criogênica em uma grade de caixa de nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.Retire um criotubo do nitrogênio líquido o mais rapidamente possível, limitando a exposição das caixas de congelação à temperatura ambiente, mergulhando-o rapidamente em banho de água a 37 graus Celsius. Mantenha sempre a tampa acima da água. Verifique com frequência e continue o descongelamento até que um pequeno cristal de gelo seja observado.Antes de levar ao gabinete de segurança, esterilize o tubo de criopreservação com etanol 70%. Prossiga adicionando o tecido descongelado a um grande volume de HBSS aquecido a uma vez, caso o tecido permaneça nas paredes do tubo de criopreservação. Colete suavemente com HBSS.Após coletar todo o tecido, inverta o tubo de três a quatro vezes e deixe o tecido sedimentar no fundo. Este passo garante uma diluição suficiente de DMSO.Uma vez que o tecido esteja assentado, aspire o máximo possível do sobrenadante. Em seguida, adicione 10 mililitros de H-B-S-S fresco e aquecido a 1 X. Adicione 300 microlitros de tripsina a 0,25% e 50 microlitros de DNAse.Prossiga com a dissociação do tecido com agitação suave, criando uma suspensão celular turva após a dissociação do tecido. Interrompa a atividade enzimática adicionando DMEM aquecido mais soro bovino enriquecido a 10% e centrifugue as suspensões celulares a 1200 ×g por cinco minutos. Re-suspenda o pellet celular em DMEM fresco mais 10% de SBE e plaque em placas revestidas com polilisina.Deixe as células aderirem às placas por 30 minutos. Em seguida, substitua o meio por DM fresco mais 10% de EBS. Após 24 horas, substitua o meio contendo DM por meio neurobasal suplementado com N dois e B 27 e cultive por 10 dias.Acabamos de detalhar um protocolo amplo, eficiente e confiável com preservação criogênica rotineira de blocos de tecido cortical. Boa sorte.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo mostra um procedimento para a geração de culturas de neurônios a partir de embrião tarde e córtex do rato pós-natal precoce. Essas culturas podem ser usados ​​para imunocitoquímica, bioquímica, eletrofisiologia, cálcio e sódio de imagem e fornecer uma plataforma para estudar o desenvolvimento neuronal de animais transgênicos que carregam uma mutação genética pós-natal letal.

Preparação de Dissociated rato Culturas Neuron Cortical

Este protocolo descreve os passos necessários para dissecar, transfectar via de eletroporação e neurônios do hipocampo e da cultura do mouse cortical. Curto prazo, as culturas podem ser utilizados para estudos sobre crescimento do axônio e orientação, enquanto culturas a longo prazo podem ser usados ​​para estudos de sinaptogênese e análise espinha dendrítica.

Nucleofection e Cultura Primária de Neurônios do hipocampo do rato embrionárias e Cortical

Um método simples e confiável sobre o isolamento e cultura de células-tronco neurais de tecido fetal humano descartado cortical é descrito. Derivados de culturas humanas conhecidas doenças neurológicas podem ser usados ​​para a caracterização de processos patológicos celular e molecular, bem como fornecer uma plataforma para avaliar a eficácia farmacológica.

Geração de células-tronco neurais de Discarded tecido fetal humano Cortical

Fonte: Palma-Tortosa, S., et.al. Culturas organotípicas do córtex humano adulto como um modelo ex vivo para transplante e validação de células-tronco humanas. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra o transplante de células-tronco progenitoras neuronais derivadas de células-tronco em fatias de tecido cortical humano. O procedimento envolve isolar e ressuspender células progenitoras em uma matriz de membrana basal, seguida por sua injeção em uma fatia cortical colocada em um conjunto transwell.

Transplante de progenitores neuronais derivados de células-tronco em fatias corticais humanas

Este vídeo demonstra o método de cultura de neurônios embrionários criopreservados, envolvendo descongelamento controlado, diluição com meio neurobasal e semeadura em uma placa revestida de poli-L-lisina. A incubação subsequente suporta o crescimento e a manutenção das conexões neuronais.

Gerando uma cultura de neurônios primários de baixa densidade a partir de neurônios embrionários congelados

Aqui nós apresentamos um protocolo para Ca2 + imagem em neurônios e células gliais, que permite que a dissecação de Ca2 + sinais em resolução subcellular. Este processo é aplicável a todos os tipos de células que permitem a expressão de geneticamente codificado Ca2 + indicadores.

Dissecação de locais de Ca2 + sinais em pilhas cultivadas pelos indicadores de membrana-alvo Ca2 +

Aqui apresentamos um protocolo para a geração espontânea de neuroesferas enriquecidas em células progenitoras neurais de neurônios chapeados de alta densidade. Durante a mesma experiência, quando os neurônios são chapeados em uma densidade mais baixa, o protocolo igualmente conduz às culturas preliminares prolongadas do neurônio de rato.

Geração de neuroesferas do hipocampal preliminar misturado e dos neurônios corticais isolados de E14-E16 embrião do rato de Sprague Dawley

Aqui, apresentamos uma abordagem simples usando meios de cultura específicos que permitem o estabelecimento de culturas enriquecidas com neurônios e astrócitos, ou culturas neuron-glia do córtex embrionário, com alto rendimento e reprodutibilidade.

Um modelo de cultura celular para estudar o papel das interações neurônio-glia na isquemia

Neste estudo, fornecemos uma técnica detalhada para um sistema de cultura organoide cortical simples, mas robusto, usando culturas hPSC padrão sem alimentador. Este é um protocolo rápido, eficiente e reprodutível para gerar organoides que modelam aspectos da senescência cerebral in vitro.

Geração robusta e altamente reprodutível de organoides cerebrais corticais para modelar senescência neuronal cerebral in vitro

Um estoque congelado pronto para uso de neurônios é uma ferramenta poderosa para avaliar as funções sinápticas. Aqui, apresentamos uma cultura primária fácil de baixa densidade a partir de estoque congelado usando uma placa de 96 poços.

Cultura Primária de Baixa Densidade Fácil e Reprodutível usando Estoque Congelado de Neurônios Embrionários do Hipocampo

Aprenda a criopreservar blocos de tecido cortical para gerar culturas neuronais enriquecidas de alta qualidade. Este método utiliza DMSO e técnicas de descongelação controlada para preservar a viabilidade celular em pesquisas neurobiológicas.

Criopreservação de tecido cortical Blocos de Geração de culturas altamente enriquecido Neuronal

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