Transplante de progenitores neuronais derivados de células-tronco em fatias corticais humanas

Comece com uma cultura aderente de células-tronco progenitoras neuronais derivadas de células-tronco preparadas para diferenciação em neurônios corticais.

Remova o meio e, em seguida, adicione uma enzima para romper a matriz extracelular e separar as células.

Use um inibidor para neutralizar a enzima e, em seguida, adicione um meio novo.

Transfira a suspensão para um tubo, centrifugue e descarte o sobrenadante para isolar as células.

Ressuspenda as células em uma matriz de membrana basal para facilitar o transplante para o tecido cerebral e, em seguida, carregue-as em um tubo capilar frio.

Pegue uma fatia cortical humana em um conjunto de transwell contendo um meio.

Remova parte do meio e injete gotículas da suspensão celular no tecido.

Incube para permitir que a matriz se solidifique.

Adicione um meio para imergir o tecido e, em seguida, incube para permitir que as células progenitoras se diferenciem em neurônios, estendam seus neuritos e formem sinapses com os neurônios corticais hospedeiros.

A fatia cortical está agora pronta para análise.

Retirar o meio do balão de cultura de células. No sétimo dia de diferenciação, separe as células GFP-lt-NES com primer cortical adicionando 500 microlitros de tripsina e incube por 5 a 10 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, adicione um volume igual do inibidor de tripsina seguido de cinco mililitros de meio DDM. Ressuspenda as células, transfira suavemente a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros e centrifugue por cinco minutos a 300 G. Enquanto isso, transfira a placa contendo o tecido humano da incubadora para o exaustor e remova dois mililitros de mídia da parte superior da inserção. No final da centrifugação, remova o sobrenadante, ressuspenda as células em uma matriz de membrana basal fria e pura e transfira a suspensão para um tubo menor.

Recolha a suspensão celular num capilar de vidro frio ligado a uma tetina de borracha para aspiração. Injete a suspensão celular como pequenas gotas, esfaqueando a fatia de tecido semi-seco em vários locais. Deixe o gel solidificar a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Em seguida, transfira a placa da incubadora de volta para o capô e adicione cuidadosamente dois mililitros de meio cortical adulto humano na parte superior da inserção para submergir completamente o tecido.