Injeção estereotáxica de vírus para modificação genética estável em um modelo de camundongo

Comece com um camundongo anestesiado com o crânio exposto em uma estrutura estereotáxica.

Abaixe o porta-seringas até que a ponta da agulha se alinhe com o bregma, um ponto de referência do crânio.

Usando as coordenadas estereotáxicas pré-determinadas, localize a zona ventricular-subventricular ou

V-SVZ, um nicho neurogênico contendo principalmente células-tronco neurais ou NSCs, e marque essa região.

Remova a seringa e faça um pequeno orifício com cuidado, evitando danos cerebrais.

Encha uma seringa estéril com vírus portadores do transgene e posicione a agulha sobre a superfície do cérebro.

Reposicione a seringa e abaixe-a até que a ponta toque a camada superficial mais interna do cérebro.

Penetre no cérebro para alcançar a V-SVZ, injete lentamente o vírus, segure brevemente e retire a seringa.

No V-SVZ, o vírus entra nas NSCs por meio da fusão por membrana. Seu RNA reverso transcreve em DNA.

Esse DNA então se integra ao genoma do NSC, permitindo a modificação genética estável dos NSCs.

Após a anestesia, um camundongo de seis a oito semanas raspa a área entre as orelhas. Em seguida, desinfete a pele usando um iodóforo, como iodo, povidona ou etanol a 70%. Em seguida, coloque o animal em decúbito ventral em uma estrutura estereotáxica.

Fixe cuidadosamente a cabeça usando as barras auriculares e o suporte do palato do aparelho. Mantenha o mouse em uma almofada de aquecimento ajustada a 37 graus Celsius e aplique lubrificante oftálmico em seus olhos.

Em seguida, faça uma incisão de 1 centímetro de comprimento no couro cabeludo e retraia suavemente a pele para expor o crânio. Limpe cuidadosamente a superfície óssea com um aplicador estéril com ponta de algodão e remova qualquer tecido restante. Depois disso, monte a seringa esterilizada no dispositivo estereotáxico usando o suporte da seringa. Posicione a agulha no bregma e certifique-se de que a posição 0 do eixo ventral dorsal esteja na superfície do crânio no bregma.

Agora, mova a seringa para as coordenadas designadas x e y, anote as coordenadas de destino x, y e z na escala Vernier como o local da injeção e marque o osso usando um marcador cirúrgico.

A escala Vernier é uma ferramenta de medição precisa, permitindo-nos determinar as coordenadas estereotáxicas do bregma com alta precisão. O 0 na escala principal marca as unidades e o número alinhado com a escala principal determina décimos de milímetro.

Em seguida, afaste a seringa da área de trabalho. Faça um furo no crânio com cuidado sem danificar o cérebro.

A broca deve ser usada horizontalmente na superfície do crânio, e o monitoramento contínuo dos avanços deve ser feito para interromper a perfuração quando a superfície pial for exposta. Não danifique o cérebro subjacente.

Em seguida, carregue a seringa com uma agulha chanfrada afiada de calibre 33 com 1 microlitro da solução viral. Posicione a agulha da seringa em um ângulo de 90 graus em relação à superfície do cérebro. Mova a seringa de volta para o local da injeção e abaixe-a até que a ponta toque a superfície pial e penetre no cérebro.

Para minimizar os danos ao tecido cerebral devido à pressão excessiva do fluido, libere lentamente a suspensão viral. Após a injeção, aguarde de 5 a 10 minutos para minimizar o refluxo da suspensão viral antes de retrair lentamente a seringa.