Análise de Cinética mRNA Nuclear Exportação em células de mamíferos por microinjeção

O objetivo geral deste procedimento é medir a cinética da exportação nuclear de mRNA em células de mamíferos. Isso é conseguido primeiramente por meio da microinjeção de mRNA ou DNA nos núcleos de células cultivadas de tecido de mamíferos. Após a microinjeção, as amostras são fixadas após diversos períodos de incubação.

O mRNA é então corado por hibridização fluorescente in situ ou FISH. A etapa final do procedimento é obter imagens das células e quantificar a quantidade de fluorescência no citoplasma e no núcleo. Em última análise, a taxa de exportação de mRNA pode ser medida por meio de uma combinação de microinjeção e microscopia fluorescente.

Olá, sou SRG AV do laboratório de Alex Palazzo do Departamento de Bioquímica da Universidade de Toronto. Sou Stefan Toski, também do Laboratório Palazzo. Sou Amy do laboratório Palazzo e sou Khi Maha David do laboratório Palazzo.

Hoje vamos mostrar um procedimento para introduzir mRNA nos núcleos de células de cultura de tecidos de mamíferos por microinjeção. Também demonstraremos como corar o mRNA por hibridização fluorescente em duas dimensões. Utilizamos esses procedimentos em nosso laboratório para estudar a cinética da exportação nuclear de mRNA em células de mamíferos.

Então vamos começar. Antes da microinjeção, dilua o DNA plasmidial previamente preparado para uma concentração entre 50 e 200 microgramas por mililitro no tampão de injeção. Em seguida, adicione Oregon Green 488 ou OG conjugado com dextrana de 70 quilodaltons à mistura para permitir a identificação das células injetadas.

O dextrano conjugado com OG ajudará a determinar quanto do fluido foi injetado no núcleo e quanto vazou para o citoplasma. Centrifugue as amostras a 13.000 G e quatro graus Celsius por pelo menos 20 minutos para formar um pellet com qualquer material particulado que possa potencialmente obstruir a ponta da agulha. Escolha a linhagem celular de mamífero a ser microinjetada com base nos critérios descritos no custo do protocolo escrito.

Sete células são usadas como semente para esta demonstração. As células sobre lamínulas tratadas com ácido em placas de Petri de 30 milímetros devem ser preparadas pelo menos 24 horas antes da microinjeção. Idealmente, a monocamada celular deve estar aproximadamente de 70 a 90% confluente no momento da injeção, para permitir a fácil identificação das células injetadas; a monocamada celular é lesionada antes da injeção utilizando uma ponteira plástica de pipeta de 200 microlitros.

Faça um corte em forma de cruz no lamínula e deixe as células recuperarem no incubador de cultura de tecidos por pelo menos 15 minutos antes da injeção. Para microinjeção, utilize um microscópio invertido isolado em uma mesa pneumática para minimizar as vibrações que podem interferir no processo de microinjeção. Usando uma ponteira de gel loader einor, remova aproximadamente um microlitro da parte superior da amostra de centrífuga para evitar perturbar o pellet.

Insira a ponta da pipeta na extremidade posterior de uma agulha de microinjeção pré-fabricada e ejete o líquido. O líquido será aspirado para a ponta da agulha por ação capilar. Um menisco próximo à ponta deve ser visível entre cinco e 30 segundos.

Coloque a agulha cheia de fluido na haste e fixe-a ao micromanipulador. Em um ângulo de 45 graus, visualize a agulha usando a objetiva de 10 x e posicione-a no centro do campo de visão, próximo ao plano focal. Usando os botões grossos do micromanipulador, a haste é conectada por um tubo a uma seringa de vidro, que é utilizada para gerar a pressão necessária para ejetar o fluido da ponta da agulha.

Para manter uma pressão constante, a seringa é fixada em um grampo de tubo. Usando duas rolhas de borracha e dois grampos metálicos, eleve a agulha alguns milímetros para evitar que ela seja danificada em etapas posteriores e, em seguida, afaste o microscópio. Coluna, aumente a pressão empurrando o êmbolo da seringa.

0,5 a dois centímetros cúbicos. Coloque uma placa de Petri contendo uma lamínula com uma monocamada lesionada. Na platina de observação, afaste o microscópio.

Mova o pilar para frente até a posição vertical, fazendo com que o condensador se alinhe com a agulha para penetrar no líquido. Isso deve ser feito com cuidado para evitar que a agulha quebre ao atingir a lamínula. Usando a objetiva de 10 x, identifique o centro do cruzamento e posicione a agulha acima das células a serem injetadas.

Aumente a ampliação alternando para a objetiva de 40 x. Em seguida, abaixe e centralize a agulha utilizando os botões de ajuste fino do joystick. Inicie a injeção em um canto da cruz do ferimento abaixando a agulha até que entre em contato com o núcleo.

Uma vez injetada, uma célula apresenta uma mudança acentuada no brilho de fase. Continue ao longo de uma borda do corte transversal. Para facilitar a identificação das células injetadas durante a visualização, é fundamental que a pressão de injeção seja ajustada corretamente para cada agulha.

A pressão deve ser alta o suficiente para perfurar as membranas plasmática e nuclear, mas não tão alta a ponto de matar as células. Microinjete células ao longo da borda da ferida por um período fixo de tempo. Com prática, várias centenas de células podem ser injetadas durante esse intervalo.

Se estiver injetando DNA plasmidial, incubar as células microinjetadas a 37 graus Celsius em uma estufa de cultura de tecidos por 20 minutos antes da fixação, em seguida interromper a transcrição. Tratando as células com um micrograma por mililitro de alfa-amanitina dissolvida em meio de crescimento. Esta concentração inibe efetivamente a transcrição a partir de plasmídeos microinjetados.

Coloque as células de volta no incubador e permita que exportem o mRNA recém-sintetizado. Uma única agulha pode ser reutilizada para injetar várias lamínulas. Embora a agulha precise ser substituída quando o tipo de DNA ou RNA que é microinjetado for alterado.

Além disso, uma vez que a agulha é removida do bastão, ela deve ser descartada para obter uma medida precisa da cinética de exportação nuclear de mRNA. Amostras separadas devem ser fixadas em zero minuto, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos e 120 minutos. Após o tratamento com alfa manina no tempo apropriado, aspire o meio de crescimento e lave as células duas vezes com dois mililitros de solução de PBS.

É importante manter as lamínulas úmidas, minimizando o tempo em que não estão submersas em líquido. Fixe as células adicionando dois mililitros de aldeído 4% em PBS e incube as células por pelo menos 15 minutos à temperatura ambiente. Após lavar as amostras fixadas mais duas vezes, permeabilize as células com dois mililitros de Triton X-100 0,1% em PBS, novamente, incubando-as por pelo menos 15 minutos à temperatura ambiente.

Por fim, lave as amostras mais duas vezes para prepará-las para a hibridização. Lave as células duas vezes com um tampão de lavagem composto por uma solução de XSSC 1x contendo 25 a 60% de formamida. Em seguida, prepare a câmara de coloração para hibridização cobrindo o fundo de uma placa de Petri de 150 milímetros com água e colocando sobre ela um pedaço de paraformaldeído.

Remova a água virando o recipiente, permitindo assim que o paraforma adere ao fundo do recipiente. Remova manualmente quaisquer bolhas de ar de cada lamínula a ser corada. Pipete gotas de 100 microlitros da solução de hibridização sobre o paraforma.

Observe que a quantidade de formage deve ser otimizada para o peixe pro específico utilizado, com a ajuda de pinça. Remova uma lamínula com as células fixadas do disco de Petri de 30 milímetros. Usando papel-filtro Watman, seque a parte traseira da lamínula e remova o excesso de tampão da face frontal sem secar as células.

Em seguida, posicione a lamínula com a face voltada para baixo sobre a solução contendo o peixe. Repita este processo para cada lamínula. Após recolocar a tampa das câmaras de coloração, incube as amostras por cinco a 18 horas a 37 graus Celsius.

Prepare várias câmaras de lavagem da mesma maneira que a câmara de coloração foi preparada; para cada lamínula, pipete um mililitro de tampão de lavagem sobre a paraforma da câmara de lavagem. Após a incubação, remova as lamínulas da câmara de coloração pipetando um mililitro de tampão de lavagem. Ao lado da lamínula, o líquido deve ser puxado por ação capilar sob cada amostra.

Em seguida, remova as lamínulas com pinça e coloque cada uma sobre uma gota de tampão de lavagem incubada em temperatura ambiente por cinco minutos. Lave cada lamínula mais duas vezes, totalizando três lavagens para cada lamínula. Pipete de 10 a 30 microlitros de solução de montagem com dappy sobre uma lâmina previamente lavada. Cada lâmina pode acomodar duas lamínulas, utilizando pinça e papel filtro Watman.

Seque a parte traseira das lamínulas e remova o líquido em excesso do lado frontal da lamínula sem secar as amostras. Coloque cada lamínula com a face voltada para baixo sobre uma gota de solução de montagem. As amostras montadas podem ser armazenadas a quatro graus Celsius.

Aqui, os efeitos da alfa-mantina na transcrição de DNA plasmidial injetado foram demonstrados em células de fibroblastos NIH 3T3, previamente tratadas com concentrações variáveis de alfa-mantina. Foram injetadas com TFL s delta i, DNA plasmidial e dextrana conjugada com OG de 70 quilodaltons. Cada linha corresponde a um único campo de visão registrado para a dextrana de 70 quilodaltons marcada com OG e o RNA mensageiro do T uts delta I.

É evidente que altas concentrações da droga inibiram completamente a produção do transcrito T UTS delta I, enquanto isso não foi observado em concentrações mais baixas. Apresentado aqui está um curso temporal do custo de exportação nuclear de mRNA. Sete células foram injetadas com DNA plasmidial T UTS delta i e dextrana conjugada com OG de 70 kilodaltons.

Trinta minutos após a injeção, as células foram tratadas com alfa-mantina e incubadas a 37 graus Celsius por zero minuto, 60 minutos e 120 minutos. As células foram então fixadas e coradas com uma sonda contra o mRNA do T UTS delta I e com anticorpos contra o marcador do RE trap alfa. Cada linha corresponde a um único campo de células.

Para obter informações sobre como quantificar a exportação de mRNA, consulte o texto online aqui. O ponto temporal de 120 minutos foi ampliado Para demonstrar a colocalização do mRNA de TFS delta I no retículo endoplasmático, é mostrada uma sobreposição do mRNA de T UTS delta I em verde e da TRAP alfa em vermelho. Informações sobre como realizar marcação simultânea de mRNA com proteínas podem ser encontradas no texto online.

Acabamos de mostrar como medir a cinética de exportação nuclear de mRNA por microinjeção. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que uma microinjeção bem-sucedida exige uma preparação adequada. Etapas fundamentais, como o preparo de DNA e RNA, preparação da amostra, fabricação de micropipetas, alinhamento do equipamento óptico e solução de problemas de microinjeção, são descritas em nosso protocolo escrito.

Ao realizar a imagem e análise de mRNA microinjetado, é importante que a quantificação seja limitada a células que receberam mais de 90% do fluido injetado no núcleo. Uma injeção nuclear bem-sucedida pode ser avaliada por meio da visualização da distribuição do dextrano verde organ no núcleo e no citoplasma. Consulte nosso protocolo online para obter mais informações sobre o design de sondas para peixes e o uso de software de análise de imagem para analisar a distribuição de mRNA no citoplasma e no núcleo.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.