Name: Análise de Cinética mRNA Nuclear Exportação em células de mamíferos por microinjeção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Aprenda a medir a cinética de exportação nuclear de mRNA em células de mamíferos usando microinjeção e hibridização in situ fluorescente. Este método permite quantificar precisamente o movimento do mRNA do núcleo para o citoplasma.

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Gostaríamos de agradecer a E. Gomes de conselhos úteis e Wilde A. por nos permitir usar vários equipamentos. Este trabalho foi financiado por uma doação à AFP a partir do Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (FRN 102.725).

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<li>Buratowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+through+the+RNA+polymerase+II+CTD+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Progression through the RNA polymerase II CTD cycle.</a> Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Microinjeção é uma ferramenta poderosa que pode ser usado para estudar uma série de diferentes processos celulares. Ao contrário de transfecção celular convencional, microinjeção permite ao pesquisador efetivamente introduzir ácidos nucléicos no núcleo celular dentro de um prazo muito estreito. Como resultado, pode-se realizar análises cinética, como determinar as taxas de exportação de mRNA, a localização do mRNA e síntese protéica. Além disso, desde o período do experimento é relativamente breve, pode-se expor as células de compostos tóxicos em prazos curtos, sem incorrer em efeitos pleiotrópicos. Além disso, inibitório ou estimulatório compostos tais como proteínas dominante negativo, pode ser co-injetados com os ácidos nucléicos. Finalmente, microinjeções evitar a exigência de reagentes de transfecção, que muitas vezes são tóxicos para as células e pode perturbar diferentes funções celulares. mRNA vs injeções de DNA plasmidial A escolha de qual ácido nucléico para injetar vai depender de uma série de considerações. Após a injeção do plasmídeo DNA, RNA polimerase II não apenas sintetiza mRNA, mas também recruta fatores de proteína para a transcrição nascente 12,13. Como esses fatores governam eventos tais como processamento de mRNA, a exportação nuclear e localização citoplasmática, injeções de DNA plasmidial podem ser usados ​​para avaliar o modo como a transcrição é acoplado a processos a jusante. Embora a transcrição pode ser acoplado a exportação nuclear 14, descobrimos que mRNA injetado é exportado pouco mais rápido do que em mRNA transcrito vivo 6. As razões para isto não são claros no momento, mas esse resultado pode sugerir que o mRNA recentemente sintetizado emerge da RNA polimerase II, pode ser amarrado em complexos que exportam retardar nuclear. Existem algumas vantagens com injeções de mRNA. Primeiro, o pesquisador não tem que usar inibidores da RNA polimerase, que pode afetar como as células regulam o metabolismo geral do RNA. Em segundo lugar, o RNA pode ser modificado in vitro antes da injeção. Por exemplo, mRNAs podem ser sintetizados com vários análogos 5 &#39;cap ou poli (A) comprimento da cauda, ​​a fim de avaliar como essas características afetam exportação nuclear 6. Em terceiro lugar, a quantidade exata de RNA que é injetado pode ser grosseiramente estimado. Seguindo o protocolo descrito acima, estimamos que aproximadamente 20.000 a 50.000 moléculas são injetados em cada núcleo, que é relativamente pequeno quando comparado ao número total de transcritos em uma célula típica de mamíferos (400.000 a 850.000 moléculas) 15. A principal desvantagem com as injeções mRNA é que durante a microinjeção, algum vazamento de fluido de injeção para o citoplasma é inevitável. Desde mRNA injetado diretamente no citoplasma é estável por longos períodos (A. Palazzo, observação não publicada), um cuidado extra deve ser tomado para selecionar quais células são quantificadas. Geralmente analisamos as células que receberam&gt; 90% do fluido de injeção no núcleo, como avaliado pela distribuição de OG-dextran.

<table><tbody><tr><td>Tampão de injeção</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>140 mM KCl e 10 mM HEPES, pH 7,4</td></tr><tr><td>Dextrana Oregon Green 488-70kD</td><td>Invitrogen</td><td>D7173</td><td>O estoque de 10 mg/mL no tampão de injeção pode ser armazenado por longos períodos a -80&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Tubos capilares de borossilicato</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta para carregar agulhas de injeção</td><td>Eppendorf</td><td>022351656</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse Ti-S</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narishige International</td><td>NT-88-V3MSH</td><td></td></tr><tr><td>Seringa para injeção</td><td>BD Biosciences</td><td>512311</td><td></td></tr><tr><td>Tampão PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 2 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 7,4</td></tr><tr><td>Tampão SSC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>150 mM NaCl, 15 mM citrato de sódio, pH 7,4</td></tr><tr><td>Paraformaldeído 4%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15686</td><td>O estoque de paraformaldeído a 37% é diluído em PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100 0,1% (Surfact-Amps)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>28314</td><td>O estoque de Triton X-100 a 10% é diluído em PBS</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Fisher Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de dextrana</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td></td></tr><tr><td>Complexo de ribosídeo de vanadila (VRC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3380</td><td></td></tr><tr><td>Papel filtro Whatman</td><td>VWR international</td><td>28298-020</td><td></td></tr><tr><td>Mesa com controle de vibração</td><td>Kinetic Systems</td><td>5702E-3036-21</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-amanitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Puxador de micropipetas Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Graxa a vácuo</td><td>Dow Corning</td><td>695400008</td><td></td></tr><tr><td>Polimerase de RNA T7</td><td>New England Biolabs</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>Polimerase de poli(A)</td><td>Ambion</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de hibridização</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>100 mg/mL sulfato de dextrana, 5 mM VRC, 150 mM NaCl, 15 mM citrato de sódio, 0,5 mg/mL &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA, 60% formamida</td></tr></tbody></table>

análise de cinética mrna nuclear exportação em células de mamíferos por microinjeção

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Em eucariotos, o RNA mensageiro (mRNA) é transcrito no núcleo e devem ser exportados para o citoplasma para acessar as máquinas de tradução. Embora a exportação de mRNA nuclear foi estudada extensivamente em oócitos Xenopus 1 e organismos geneticamente tratáveis, tais como levedura 2 ea linha de células derivadas Drosophila S2 3, poucos estudos foram conduzidos em células de mamíferos. Além disso, a cinética de exportação mRNA em células somáticas de mamíferos só poderia ser inferido indiretamente 4,5. Para medir a cinética de exportação nuclear de mRNA em células de cultura de tecidos de mamíferos, temos desenvolvido um ensaio que utiliza o poder da microinjeção juntamente com hibridização fluorescente in situ (FISH). Estes testes têm sido utilizados para demonstrar que em células de mamíferos, a maioria dos mRNAs são exportados de forma splicing dependentes 6,7, ou de forma que requer seqüências específicas de RNA, como a região seqüência de sinais de codificação (SSCR) 6. Neste ensaio, as células são microinjeções tanto in vitro mRNA sintetizado ou DNA plasmídeo contendo o gene de interesse. As células são incubadas por microinjeção vários pontos do tempo, em seguida, fixa e da localização sub-celular do RNA é avaliada através de FISH. Em contraste com a transfecção, onde ocorre a transcrição de várias horas após a adição de ácidos nucléicos, microinjeção de DNA ou mRNA permite a expressão rápida e permite a geração de precisão dos dados cinéticos.

Aqui nós descrevemos um ensaio que utiliza o poder da microinjeção juntamente com fluorescentes<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação, a fim de medir com precisão a cinética de exportação nuclear de mRNA em células somáticas de mamíferos.

Análise de Cinética mRNA Nuclear Exportação em células de mamíferos por microinjeção

Nos eucariotos, o RNA mensageiro (mRNA) é transcrito no núcleo e deve ser exportado para o citoplasma para aceder à maquinaria de tradução. Embora ...

O objetivo geral deste procedimento é medir a cinética da exportação nuclear de mRNA em células de mamíferos. Isso é conseguido primeiramente por meio da microinjeção de mRNA ou DNA nos núcleos de células cultivadas de tecido de mamífero. Após a microinjeção, as amostras são fixadas após diversos períodos de incubação.O mRNA é então corado por hibridização in situ fluorescente ou FISH. A etapa final do procedimento é obter imagens das células e quantificar a quantidade de fluorescência no citoplasma e no núcleo. Em última análise, a taxa de exportação de mRNA pode ser medida por meio de uma combinação de microinjeção e microscopia fluorescente.Olá, sou SRG AV do laboratório de Alex Palazzo do Departamento de Bioquímica da Universidade de Toronto. Sou Stefan Toski, também do Laboratório Palazzo. Sou Amy do laboratório Palazzo e sou Khi Maha David do laboratório Palazzo.Hoje vamos mostrar um procedimento para introduzir mRNA nos núcleos de células de cultura de tecidos de mamíferos por microinjeção. Também demonstraremos como corar o mRNA por hibridização fluorescente em C dois. Utilizamos esses procedimentos em nosso laboratório para estudar a cinética da exportação nuclear de mRNA em células de mamíferos.Então vamos começar. Antes da microinjeção, dilua o DNA plasmidial previamente preparado para uma concentração entre 50 e 200 microgramas por mililitro no tampão de injeção. Em seguida, adicione Oregon Green 488 ou OG conjugado com dextrana de 70 quilodaltons à mistura para permitir a identificação das células injetadas.O dextrano conjugado com OG ajudará a determinar quanto do fluido foi injetado no núcleo e quanto vazou para o citoplasma. Centrifugue as amostras a 13.000 G e quatro graus Celsius por pelo menos 20 minutos para formar um pellet com qualquer material particulado que possa potencialmente obstruir a ponta da agulha. Escolha a linhagem celular de mamífero a ser microinjetada com base nos critérios descritos no custo do protocolo escrito.Sete células são usadas como semente para esta demonstração. As células sobre lamínulas tratadas com ácido em placas de Petri de 30 milímetros devem ser preparadas pelo menos 24 horas antes da microinjeção. Idealmente, a monocamada celular deve estar aproximadamente entre 70 a 90% confluente no momento da injeção, para permitir a fácil identificação das células injetadas; a monocamada celular é lesionada antes da injeção utilizando uma ponteira plástica de 200 microlitros.Faça um corte em forma de cruz no lamínula e deixe as células recuperarem no incubador de cultura de tecidos por pelo menos 15 minutos antes da injeção. Para microinjeção, utilize um microscópio invertido isolado em uma mesa pneumática para minimizar as vibrações que podem interferir no processo de microinjeção. Usando uma ponteira de gel loader einor, remova aproximadamente um microlitro do topo da amostra de centrífuga para evitar perturbar o pellet.Insira a ponta da pipeta na extremidade posterior de uma agulha de microinjeção pré-fabricada e ejete o líquido. O líquido será aspirado para a ponta da agulha por ação capilar. Um menisco próximo à ponta deve ser visível entre cinco e 30 segundos.Coloque a agulha cheia de fluido na haste e fixe-a ao micromanipulador. Em um ângulo de 45 graus, visualize a agulha usando a objetiva de 10 x e posicione-a no centro do campo de visão, próximo ao plano focal. Usando os botões grossos do micromanipulador, a haste é conectada por um tubo a uma seringa de vidro, que é usada para gerar a pressão necessária para ejetar o fluido pela ponta da agulha.Para manter uma pressão constante, a seringa é fixada em um grampo de tubo. Usando duas rolhas de borracha e dois grampos metálicos, eleve a agulha alguns milímetros para evitar que ela seja danificada em etapas posteriores e, em seguida, afaste o microscópio. Coluna, aumente a pressão empurrando o êmbolo da seringa.0,5 a dois centímetros cúbicos. Coloque uma placa de Petri contendo uma lamínula com uma monocamada lesionada. Na platina de observação, afaste o microscópio para trás.Mova o pilar para frente até a posição vertical, fazendo com que o condensador se alinhe com a agulha para penetrar no líquido. Isso deve ser feito com cuidado para evitar que a agulha quebre ao tocar a lamínula. Usando a objetiva de 10 x, identifique o centro do cruzamento e posicione a agulha acima das células a serem injetadas.Aumente a ampliação alternando para a objetiva de 40 x. Em seguida, abaixe e centralize a agulha utilizando os botões de ajuste fino do joystick. Inicie a injeção em um canto da cruz do ferimento abaixando a agulha até que entre em contato com o núcleo.Uma vez injetada, uma célula apresenta uma mudança acentuada no brilho de fase. Continue ao longo de uma borda do corte transversal. Para facilitar a identificação das células injetadas durante a visualização, é fundamental que a pressão de injeção seja ajustada corretamente para cada agulha.A pressão deve ser alta o suficiente para perfurar as membranas plasmática e nuclear, mas não tão alta a ponto de matar as células. Microinjete células ao longo da borda da ferida por um período fixo de tempo. Com prática, várias centenas de células podem ser injetadas durante esse intervalo.Se estiver injetando DNA plasmidial, incubar as células microinjetadas a 37 graus Celsius em uma estufa de cultura de tecidos por 20 minutos antes da fixação, em seguida interromper a transcrição. Tratando as células com um micrograma por mililitro de alfa, uma mantina dissolvida em meio de crescimento. Esta concentração inibe efetivamente a transcrição a partir de plasmídeos microinjetados.Coloque as células de volta no incubador e permita que exportem o mRNA recém-sintetizado. Uma única agulha pode ser reutilizada para injetar várias lamínulas. Embora seja necessário substituir a agulha quando o tipo de DNA ou RNA que é microinjetado for alterado.Além disso, uma vez que a agulha é removida do bastão, ela deve ser descartada para obter uma medida precisa da cinética de exportação nuclear de mRNA. Amostras separadas devem ser fixadas em zero minuto, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos e 120 minutos. Após o tratamento com alfa manina no tempo apropriado, aspire o meio de crescimento e lave as células duas vezes com dois mililitros de solução de PBS.É importante manter as lamínulas úmidas, minimizando o tempo em que não estão submersas em líquido. Fixe as células adicionando dois mililitros de aldeído 4% em PBS e incube as células por pelo menos 15 minutos à temperatura ambiente. Após lavar as amostras fixadas mais duas vezes, permeabilize as células com dois mililitros de Triton X-100 0,1% em PBS, novamente, incubando-as por pelo menos 15 minutos à temperatura ambiente.Lave finalmente as amostras mais duas vezes para prepará-las para hibridização. Lave as células duas vezes com um tampão de lavagem composto por uma solução de XSSC 1x contendo 25 a 60% de formamida. Em seguida, prepare a câmara de coloração para hibridização cobrindo o fundo de uma placa de Petri de 150 milímetros com água e colocando sobre ela um pedaço de paraformaldeído.Remova a água virando o recipiente, permitindo assim que o paraforma adere ao fundo do recipiente. Remova manualmente quaisquer bolhas de ar de cada lamínula a ser corada. Pipete gotas de 100 microlitros da solução de hibridização sobre o paraforma.Observe que a quantidade de formol deve ser otimizada para o peixe específico utilizado com a ajuda de pinça. Remova uma lamínula com as células fixadas do disco de Petri de 30 milímetros. Usando papel-filtro Whatman, seque a parte traseira da lamínula e remova o excesso de tampão da face frontal sem secar as células.Em seguida, coloque a lamínula com a face voltada para baixo sobre a solução contendo o peixe. Repita este processo para cada lamínula. Após recolocar a tampa das câmaras de coloração, incube as amostras por cinco a 18 horas a 37 graus Celsius.Prepare várias câmaras de lavagem da mesma maneira que a câmara de coloração foi preparada, adicionando com pipeta um mililitro de tampão de lavagem sobre a paraforma de cada câmara de lavagem. Após a incubação, remova as lamínulas da câmara de coloração pipetando um mililitro de tampão de lavagem. Ao lado da lamínula, o líquido deve ser puxado por ação capilar sob cada amostra.Em seguida, remova as lamínulas com pinça e coloque cada uma sobre uma gota de tampão de lavagem incubada em temperatura ambiente por cinco minutos. Lave cada lamínula mais duas vezes, totalizando três lavagens para cada lamínula. Pipete de 10 a 30 microlitros de solução de montagem com dappy sobre uma lâmina previamente lavada. Cada lâmina pode acomodar duas lamínulas, utilizando pinça e papel filtro Watman.Seque a parte traseira das lamínulas e remova o excesso de líquido do lado frontal da lamínula sem secar as amostras. Coloque cada lamínula com a face voltada para baixo sobre uma gota de solução de montagem. As amostras montadas podem ser armazenadas a quatro graus Celsius.Aqui, os efeitos da alfa-mantina na transcrição de DNA plasmidial injetado foram demonstrados em células de fibroblastos NIH 3T3, previamente tratadas com concentrações variáveis de alfa-mantina. As células foram injetadas com TFL s delta i, DNA plasmidial e dextrana conjugada com OG de 70 quilodaltons. Cada linha corresponde a um único campo de visão obtido para a dextrana de 70 quilodaltons marcada com OG e o RNA mensageiro de T uts delta I.É evidente que altas concentrações do fármaco inibiram completamente a produção do transcrito T UTS delta I, enquanto isso não foi observado em concentrações mais baixas. Apresentado aqui está um curso temporal do custo da exportação nuclear de mRNA. Sete células foram injetadas com DNA plasmidial T UTS delta i e dextrana conjugada com OG de 70 quilodaltons.Trinta minutos após a injeção, as células foram tratadas com alfa-mantina e incubadas a 37 graus Celsius por zero, 60 e 120 minutos. As células foram então fixadas e coradas com uma sonda contra o mRNA do T UTS delta I e com anticorpos contra o marcador do retículo endoplasmático trap alfa. Cada linha corresponde a um único campo de células.Para obter informações sobre como quantificar a exportação de mRNA, consulte o texto online aqui. O ponto temporal de 120 minutos foi ampliado Para demonstrar a colocalização do mRNA TFS delta I no retículo endoplasmático, é mostrada uma sobreposição do mRNA T UTS delta I em verde e da TRAP alfa em vermelho. Informações sobre como realizar marcação simultânea de mRNA com proteínas podem ser encontradas no texto online.Acabamos de mostrar como medir a cinética de exportação nuclear de mRNA por microinjeção. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que uma microinjeção bem-sucedida exige uma preparação adequada. Etapas fundamentais, como preparação de DNA e RNA, preparo da amostra, puxamento de agulhas, alinhamento do equipamento óptico e solução de problemas de microinjeção, são descritas em nosso protocolo escrito.Ao realizar a imagem e análise de mRNA microinjetado, é importante que a quantificação seja limitada às células que receberam mais de 90% do fluido injetado no núcleo. Uma injeção nuclear bem-sucedida pode ser avaliada por meio da visualização da distribuição do dextrano verde organ no núcleo e no citoplasma. Consulte nosso protocolo online para obter mais informações sobre o design de sondas para peixes e o uso de software de análise de imagem para analisar a distribuição de mRNA no citoplasma e no núcleo.Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Desenvolvemos um ensaio de repórter de biogênese intrônica para ser usado em células in vitro com quatro plasmídeos: um com miRNA intrônico, um com o alvo, um para superexpressar uma proteína regulatória, e outro para a luciferase renilla. O miRNA foi processado e pôde controlar a expressão da luciferase ligando-se à sequência de alvos.

Um ensaio repórter para analisar a maturação intronic microRNA em células mamíferas

Microinjeção é um método bem estabelecido e eficaz para a introdução de substâncias estranhas em embriões de peixe-zebra fertilizado. Aqui, nós demonstramos uma técnica de microinjeção robusta para a realização de superexpressão do mRNA, e oligonucleotídeos morfolino estudos gene knockdown no zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

Análise de DNA dupla fita-Break Repair (DSB) em células de mamíferos

Aprenda a medir a cinética de exportação nuclear de mRNA em células de mamíferos usando microinjeção e hibridização in situ fluorescente. Este método permite quantificar precisamente o movimento do mRNA do núcleo para o citoplasma.

Análise de Cinética mRNA Nuclear Exportação em células de mamíferos por microinjeção

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