Expressão gênica via eletroporação de célula única em culturas de fatias de hipocampo de camundongos

Comece com uma fatia de hipocampo de um cérebro de camundongo cultivado em uma inserção de cultura em um prato.

Corte o inserto que contém a fatia e prenda-o em uma câmara de eletroporação sob um microscópio.

Perfunda a câmara com um tampão contendo um bloqueador dos canais de sódio dependente de voltagem para inibir a superexcitação e evitar a toxicidade celular.

Posicione uma pipeta contendo plasmídeos com o gene de interesse perto da fatia.

Mantenha a pressão positiva para evitar o entupimento da pipeta ao se aproximar de um neurônio do hipocampo alvo até que uma covinha da membrana se forme.

Mude para pressão negativa para criar uma vedação com a membrana.

Alterne entre pressão positiva e negativa para minimizar os danos celulares.

Aplique um pulso de eletroporação para permeabilizar transitoriamente a membrana, facilitando a entrada do plasmídeo.

Retire a pipeta mantendo a pressão positiva e repita a eletroporação para os neurônios-alvo vizinhos.

Transfira a fatia eletroporada para uma nova inserção e incube-a para permitir a expressão do gene de interesse.

Para preparar culturas de fatias para eletroporação, transfira as inserções de cultura de interesse para placas de Petri individuai