Expressão gênica via eletroporação de célula única em culturas de fatias de hipocampo de camundongos

Comece com uma fatia de hipocampo de um cérebro de camundongo cultivado em uma inserção de cultura em um prato.

Corte o inserto que contém a fatia e prenda-o em uma câmara de eletroporação sob um microscópio.

Perfunda a câmara com um tampão contendo um bloqueador dos canais de sódio dependente de voltagem para inibir a superexcitação e evitar a toxicidade celular.

Posicione uma pipeta contendo plasmídeos com o gene de interesse perto da fatia.

Mantenha a pressão positiva para evitar o entupimento da pipeta ao se aproximar de um neurônio do hipocampo alvo até que uma covinha da membrana se forme.

Mude para pressão negativa para criar uma vedação com a membrana.

Alterne entre pressão positiva e negativa para minimizar os danos celulares.

Aplique um pulso de eletroporação para permeabilizar transitoriamente a membrana, facilitando a entrada do plasmídeo.

Retire a pipeta mantendo a pressão positiva e repita a eletroporação para os neurônios-alvo vizinhos.

Transfira a fatia eletroporada para uma nova inserção e incube-a para permitir a expressão do gene de interesse.

Para preparar culturas de fatias para eletroporação, transfira as inserções de cultura de interesse para placas de Petri individuais de três centímetros carregadas com 900 microlitros de meio de cultura e coloque as culturas em uma incubadora de dióxido de carbono de mesa. Em seguida, pré-incube as inserções de cultura fresca com um mililitro de meio de cultura por fatia por pastilha em uma placa de Petri de 3,5 centímetros por pelo menos 30 minutos e esterilize as linhas do equipamento de eletroporação com alvejante a 10% por cinco minutos.

No final da perfusão, enxágue as linhas com água autoclavada ionizada por pelo menos 30 minutos antes de perfundir com aCSF esterilizado por filtro contendo 0,001 milimolar tetrodotoxina. Defina o pulso do eletroporador para uma amplitude de menos cinco volts, um pulso quadrado, um trem de 500 milissegundos, uma frequência de 50 hertz e uma largura de pulso de 500 microssegundos. Encha uma pipeta de vidro com cinco microlitros de solução interna contendo plasmídeo e bata suavemente na ponta várias vezes para remover quaisquer bolhas presas.

Use um microscópio de dissecção para confirmar se a ponta não está danificada e prenda firmemente a ponta da pipeta ao eletrodo. Quando a ponteira entrar em contato com o aCSF, registre a leitura da resistência da pipeta do eletroporador. Para isolar uma cultura de fatias, corte a membrana do inserto de cultura com uma lâmina afiada e use uma pinça de ângulo afiado para transferir cuidadosamente a cultura de fatias para a câmara de eletroporação.

Em seguida, fixe a posição da cultura com uma âncora de fatia. Para eletroporação das células de interesse, aplique pressão positiva na pipeta por via oral e use os controles tridimensionais do botão para manobrar a ponta da pipeta para perto da superfície da cultura de fatias. Visualizando a cultura com o microscópio, aproxime-se da célula-alvo com a ponta, mantendo a pressão positiva aplicada até que uma covinha se forme na superfície da célula.

Após a visualização da covinha, aplique rapidamente uma leve pressão negativa por via oral para que uma vedação solta se forme entre a ponta da pipeta e a membrana plasmática. A membrana entrará ligeiramente na pipeta. Deve-se observar um aumento de aproximadamente 2,5x na resistência inicial da pipeta, conforme indicado pelo aumento do tom dos alto-falantes.

Reaplique rapidamente a pressão positiva para que a covinha se reforme. Em seguida, complete imediatamente pelo menos mais dois ciclos de pressão, conforme demonstrado, sem pausa. Após o último pulso de pressão, mantenha a pressão negativa por um segundo.

Quando o tom dos alto-falantes atingir um ápice estável no tom, use o pedal para pulsar rapidamente o eletroporador. Após a eletroporação, retraia suavemente a pipeta aproximadamente 100 mícrons da célula sem aplicar pressão e reaplique a pressão positiva, verificando se a resistência é semelhante à leitura da linha de base antes de se aproximar da próxima célula. Quando todas as células de interesse tiverem sido eletroporadas, transfira a cultura de fatias para uma das pastilhas de cultura fresca preparadas e coloque a pastilha a 35 graus Celsius por até três dias.