Name: A Cultura da Motor Primário e neurônios sensoriais no Media Definidas em electrospun Poly-L-ácido lático nanofibras Andaimes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-15T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 3 s
Description: Aprenda a cultivar neurônios motores e sensoriais primários de ratos em nanofibras de poli-L-ácido lático eletrofiadas. Este método demonstra como a topografia das fibras direciona o crescimento neuronal para aplicações em engenharia de tecidos nervosos.

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NIH K08 EB003996

1. Poli-L-láctico (PLLA) Spinning Solution <ol><li> Dissolver 0,4 g PLLA em 9 mL de clorofórmio por agitação em fogo baixo. </li><li> Adicionar 1 mL dimetilformamida para a solução, trazendo a concentração final da solução para PLLA 4% (w / v) em clorofórmio: DMF 9:1 (v / v). </li><li> Coloque a solução em um polipropileno ou seringa de vidro com uma ponta de metal blunt 23ga. </li></ol> 2. Spinning Preparação do Substrato 1 <ol><li> Faça uma solução de 8% (w / v) de PLGA 85:15 (poli-lático-co-glicólico ácido) em clorofórmio por agitação em fogo baixo. </li><li> Revestimento de vidro limpo lamínulas em PLGA cobrindo a superfície de cada lamínula com a solução de PLGA. Permitir que o PLGA para secar a uma película fina (aprox. 30 min). </li></ol> 3. Eletrofiação 2 <ol><li> Seguro PLGA tampa de vidro revestido desliza para colecionador com fita de carbono condutora. Para fibras alinhadas, o coletor é uma roda motorizada. Para fibras aleatórias, o coletor é uma placa estacionária. </li><li> Seringa lugar na ponta da bomba com 20 cm de roda de colecionador. Conjunto de bomba a cerca de 2 mL / hr e se estiver usando uma roda, conjunto do motor para 300-400 RPM. Se possível, aplique um viés -2 kV DC para o coletor e 15 kV a ponta de metal. Na ausência de acesso a uma fonte de alimentação bipolar, terra do coletor. </li><li> Fibras será jato da ponta da seringa e recolher na roda girando. Continue girando até que a densidade desejada de fibras é obtido. Passe a ponta de metal com uma toalha de papel afixado a uma haste não-condutor periodicamente para evitar entupimento na ponta. </li></ol> 4. Moating 1 <ol><li> Spinning seguinte, 'fosso' as amostras electrospun pipetando uma linha de PLGA em todo o perímetro da lamínula. Permitir que o PLGA para secar. Isto irá manter o alinhamento das fibras durante a cultura. </li></ol> 5. Revestimento de proteína <ol><li> Fibras de vidro electrospun e controles precisam ser revestidas em proteínas antes de cultura de células. Cobrir os substratos em uma solução de proteína, pelo menos, uma hora e depois aspirar o excesso de solução e continuar aspirando até os substratos estão secos. Soluções de proteína possíveis incluem: PLL (poli-L-lisina) (100 mcg / mL), laminina (25 mcg / mL) ou fibronectina (50 mcg / mL). Se PLL é utilizado, os substratos devem ser lavados em água estéril e seco duas vezes após o revestimento inicial. </li></ol> 6. Obtenção de embriões de ratos 3 E15 * Todos os experimentos foram feitos de acordo com o Guia de NIH para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, aprovado pela Universidade de Michigan Comissão de Uso e Cuidados dos Animais. <ol><li> Preparação: Verifique se o animal está grávida. Descongelar 3 mL de tripsina, 3 mL FBS e uma garrafa quente do L15. Fogo polonês uma pipeta Pasteur. Desinfectar todos os instrumentos cirúrgicos em etanol 70% por 30 min. </li><li> Preparar e aquecer media chapeamento (ver Tabela 1). </li><li> Eutanásia: Realizar uma injeção IP de cetamina / xilazina. Esperar 10-15 minutos e verificar se há falta de córnea e pedal reflexos de retirada. Uma vez que os reflexos estão ausentes, execute uma injeção de pentobarbital IC (FatalPlus). </li><li> Tenda a pele do abdômen. Corte através da pele e camadas musculares para expor a cavidade abdominal. Localize o útero e retirá-la no colo do útero e ovários. </li><li> Remoção dos embriões do útero com uma tesoura e coloque-os imediatamente em L15 quente. (Todos os seguintes procedimentos sejam concluídos em um microscópio de dissecação e embriões e os cabos devem ser dissecados submerso em L15 quente em todos os momentos.) Decapite os embriões fechando forceps em torno do queixo e abaixo do osso occipital do crânio. </li></ol> 7. Dissecção 3 <ol><li> Coloque o embrião de um lado. Proteger a medula espinhal com um conjunto de pinças enquanto usa o outro conjunto para descascar afastado membros e órgãos abdominais. </li><li> Vire o embrião e mantê-lo firme com um conjunto de fórceps. Snip ao longo do comprimento do embrião, do pescoço à cauda, ​​até que o cabo inteiro é exposto. </li><li> Segure a extremidade do cabo com cuidado e puxe-o sobre si mesmo para a cauda para remover. O cabo vai puxar livre com membrana e gânglios da raiz dorsal (DRG) em anexo. </li><li> Se DRG explante ou cultura dissociada neurônio sensorial é a ser executada, o DRG snip fora o cabo e transferi-los para um prato de doce L15 quente. <ol><li> DRG para a cultura de explantes, pule para o passo 10,2 </li><li> Para a cultura neurônio sensorial dissociada, pule para o passo 9 </li><li> Para motor a cultura de neurônios, o DRG serão removidos com a membrana no passo 7,5 </li></ol></li><li> Remover a membrana da medula espinhal, segurando-o na extremidade superior da medula e peeling-lo para baixo, semelhante ao de remover uma meia longa. Repita o procedimento para todos os embriões e depois cortar as cordas em pequenos (2-3 mm) peças. </li></ol><pclass motor neuron processamento>5,6,7 <ol><li> Despeje os cabos cortados e L15 em um cone, girando em 1000 RPM por 2-3 min para agregar as peças. </li><li> Deitar fora o sobrenadante e adicionar 3 mL de tripsina para os cabos peletizada. Incubar em banho-maria a 37 ° C por 20 min. </li><li> Adicionar 3 mL FBS a cônica e girar a 1000 RPM por 2-3 min para re-pellet. </li><li> Deitar fora o sobrenadante e casaco de um incêndio polido Pasteur pipeta com FBS. </li><li> Adicionar uma pipeta Pasteur cheio de L15 para a cônica e depois triturar delicadamente até obter uma solução homogênea, sem grumos visíveis. Evitar bolhas. </li><li> Prepare uma solução de 9% do Optiprep em L15. Prepare um tubo com 3 mL da solução Optiprep para cada dois embriões (se houver um número ímpar de embriões, arredondar para cima). </li><li> Gota a solução homogeneizada para a solução Optiprep, dividindo-o igualmente entre todos os tubos. Girar os tubos a 2000 RPM por 15 min. </li><li> Recolher com cuidado o topo 2 mL de cada tubo e piscina em um 50 mL cônico. Preencher o cônico com L15 e girar a 1000 RPM por 5 minutos para enxaguar as células do Optiprep. </li><li> Deitar fora o sobrenadante e ressuspender as células em uma pequena quantidade de media chapeamento (250-500 mL). Contar as células usando a exclusão de tripan azul para identificar as células vivas. Pule para o passo 10,1 </li></ol> 9. Sensoriais Neuron Processing (SN) 7 <ol><li> Despeje o DRG removido da medula espinhal e L15 em um tubo cônico e giram a 1000 RPM por 2-3 min para agregar as peças. </li><li> Deitar fora o sobrenadante e adicionar 3 mL de tripsina ao DRG peletizada. Incubar em banho-maria a 37 ° C por 10 min. </li><li> Adicionar 3 mL FBS a cônica e girar a 1000 RPM por 2-3 min para re-pellet. </li><li> Deitar fora o sobrenadante e casaco de um incêndio polido Pasteur pipeta com FBS. </li><li> Adicionar uma pipeta Pasteur cheio de L15 para a cônica e depois triturar delicadamente até obter uma solução homogênea, sem grumos visíveis. Evitar bolhas. </li><li> Girar o homogeneizado a 1000 RPM por 5 min. Deitar fora o sobrenadante e ressuspender as células em uma pequena quantidade de media plating SN (250-500 mL). Contar as células usando a exclusão de tripan azul para identificar as células vivas. Continue até a etapa 10,1 </li></ol> 10. Revestimento e Cultura <ol><li> Para SN dissociados ou cultura MN: <ol><li> Cobrir os substratos com algumas gotas de mídia em seguida, adicione um volume adequado de suspensão celular. Células dissociadas devem ser banhados com uma densidade baixa (25-50 células / mm 2). Permitir que as células a aderir, pelo menos, uma hora antes de inundar os poços com a mídia. </li></ol></li><li> DRG para a cultura de explantes: <ol><li> Cobrir os substratos com algumas gotas de mídia em seguida, adicione DRG para a mídia. Organizar o DRG para que eles estão uniformemente distribuídas em todo o substrato (aproximadamente 4 DRG vai caber em um pedaço 22x22 mm capa). Permitir que o DRG para aderir por pelo menos 4 horas antes da inundação dos poços com a mídia. </li></ol></li><li> Culturas pode ser mantido por até 4 dias sem mudança de mídia. Para culturas mais, as mudanças meia media deve ser feito com alimentação de mídia. Alimentação de mídia é a mesma composição que media plating menos a L-glutamina. </li></ol> 11. Imunocitoquímica 1,5,8 <ol><li> Fixação células: media Aspirar e substituir com calorosa PFA 4% (paraformaldeído) por 30 min. Em seguida, executar 3X 5 min lava 1x PBS. </li><li> Bloqueio / permeabilização: Prepare bloco / perm solução (1,25% de soro albumina bovina em 1X PBS, 0,05% Triton X-100 e 2,0% de soro de cabra normal). Aspirar PBS e aplicar bloco / perm solução para amostras por 30 minutos. Em seguida, executar 1X 5 min lava 1x PBS. </li><li> Anticorpo primário: Prepare a solução de anticorpo primário de trabalho (10% soro de cabra normal, 1,25% albumina sérica bovina, 0,1% Na azida, 0,05% Triton X-100 mL e 10 com 1x PBS). Adicionar a quantidade adequada do anticorpo primário (ver Tabela 2). Linha de vários pratos com parafilme. Coloque uma gota 200μl de solução de anticorpo primário sobre o parafilme para cada substrato. Inverter os substratos, flutuando-los lado célula para baixo sobre a solução de anticorpo primário trabalhando durante a noite (se o quarto tem ar condicionado ou particularmente seco, um pedaço de papel saturado de água pode ser adicionada a um canto do prato para evitar a evaporação da solução de trabalho) . </li><li> Anticorpo secundário: Remove os substratos do primário (a solução de trabalho podem ser recolhidos, armazenados a 4 ° C e reutilizados) e realizar 2X 5 min lava 1x PBS. Aplicar 200 mL de anticorpo secundário diluído 1:200 em PBS (também invertida em parafilme prato forrado) por 4 horas. </li><li> Retire do secundário em seguida, executar 2X 5 min lava 1x PBS. Substratos de montagem em lâminas com Prolong ouro contendo DAPI ou outro contador adequado nuclear mancha. </li></ol> 12. Resultados representativos: A morfologia típica de alinhados e el aleatóriaectrospun fibras são mostrados na Figura 1. Nós normalmente obter MN pureza&gt; 90% 7,8 neurônios com este protocolo e mantivemos DRG culturas durante o tempo que uma semana sem qualquer crescimento de fibroblastos significativa. A Figura 2 mostra a aparência típica MN em vidro e fibras após 24 horas de cultura e imunomarcação. DRG imunocoradas cultivados por três dias em vidro e fibras são representadas na Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura alinhamento Fiber 1. É manipulado por escolha de colecionador. A.) Alinhados fibras fiadas em um coletor roda girando e B.) fibras aleatórias girou em um coletor placa estacionária. Barra de escala = 20 mM. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Neurônios motores Representante coradas para TuJ1 (verde) e DAPI (azul) após 24 horas de cultura na A. revestido PLL) fibras e B.) de vidro. Barra de escala = 20 mM. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Manchada Representante DRG para neurofilamento (verde) após 3 dias de cultura em PLL A. revestido) de vidro e B.) fibras. Barra de escala = 200 mM. <table border="1"><tbody><tr><td> Solução estoque: </td><td> MN mídia: </td><td> DRG / SN mídia: </td></tr><tr><td> 10 mg mL -1 de albumina </td><td> 12,5 mL </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 mg mL -1 apo-transferrina </td><td> 50 ul </td><td> 40 mL </td></tr><tr><td> 50 mg mL -1 β-estradiol </td><td> 2,7 mL </td><td> 2,2 mL </td></tr><tr><td> 0,1 mg mL -1 biotina </td><td> 50 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> 16 mg mL -1 catalase </td><td> 8 mL </td><td> - </td></tr><tr><td> 15 mg mL -1 D-galactose </td><td> 50 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> 50 mg mL -1 hidrocortisona </td><td> 3,7 mL </td><td> 2,9 mL </td></tr><tr><td> 0,63 mg mL -1 progesterona </td><td> 0,5 mL </td><td> - </td></tr><tr><td> 16 mg mL -1 putrescina </td><td> 50 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> 50 mg mL -1 de selênio </td><td> 3,4 mL </td><td> 4,1 mL </td></tr><tr><td> 2,5 mg mL -1 superóxido dismutase </td><td> 50 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> * 500 ng mL -1 fator de crescimento neural </td><td> - </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> * 100X PSN </td><td> 0,5 mL </td><td> 0,5 mL </td></tr><tr><td> * B27 </td><td> 1 mL </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> * 2 mM L-glutamina </td><td> 35 mL </td><td> 35 mL </td></tr><tr><td> * Neurobasal </td><td> a 50 mL </td><td> a 50 mL </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Adicionar asterisco (*) componentes para a mídia pouco antes de usar. Os demais componentes podem ser preparados como solução estoque e mantido a -20 ° C até ser necessário 6,7. <table border="1"><tbody><tr><td> Primário (concentração) </td><td> Neurônios: </td><td> Glia: </td><td> Fibroblastos: </td></tr><tr><td> anti-β-tubulina (TuJ1) (1:1000) </td><td> ✓ </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td> anti-neurofilamento (1:1000) </td><td> ✓ </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td> anti-S-100 (1:250) </td><td> X </td><td> ✓ </td><td> ✓ </td></tr><tr><td> anti-NGFR p75 (1:500) </td><td> ✓ </td><td> ✓ </td><td> X </td></tr></tbody></table> Tabela 2. A seleção do anticorpo primário depende dos objetivos do pesquisador. O acima são vários anticorpos e as concentrações que temos utilizado com sucesso em nosso laboratório. S-100 é particularmente útil para identificar as células de Schwann e / ou verificar se há contaminação fibroblastos, mas note que ele deve ser usado em combinação com NGFR p75 distinguir entre glia e fibroblasts4. Temos notado também que NGFR p75 manchas neurites muito levemente, enquanto neurofilamento ou TuJ1 são excelentes opções, se o objetivo é visualizar neurites individual. </pclass>

<ol><li>Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+electrospun+PLLA+nanofiber+scaffolds+compatible+with+serum-free+growth+of+primary+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons.</a> Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).</li>
<li>Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+nanofiber+morphologies+using+modulated+electrospinning+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mat.+Res.+Soc.+Symp.+Proc%22%5BJournal%5D)">Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications.</a> Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. , MIT Press. Chapter 19 (1998).</li>
<li>Kameda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+glial+progenitor+markers+p75NTR+and+S100+protein+in+the+developing+mouse+parathyroid+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of glial progenitor markers p75NTR and S100 protein in the developing mouse parathyroid gland.</a> Cell Tissue Res. 327, 15-23 (2007).</li>
<li>Corey, J. M., Lin, D. Y., Mycek, K. B., Chen, Q., Samuel, S., Feldman, E. L., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligned+electrospun+nanofibers+specify+the+direction+of+dorsal+root+ganglia+neurite+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Aligned electrospun nanofibers specify the direction of dorsal root ganglia neurite growth.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 83, 636-645 (2007).</li>
<li>Vincent, A. M., Mobley, B. C., Hiller, A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF-I+prevents+glutamate-induced+motor+neuron+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">IGF-I prevents glutamate-induced motor neuron programmed cell death.</a> Neurobiol. Dis. 16, 407-416 (2004).</li>
<li>Russell, J. W., Windebank, A. J., Schenone, A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor-I+prevents+apoptosis+in+neurons+after+nerve+growth+factor+withdrawal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor-I prevents apoptosis in neurons after nerve growth factor withdrawal.</a> J. Neurobiol. 36, 455-467 (1998).</li>
<li>Gertz, C. C., Leach, M. K., Birrel, L. K., Martin, D. C., Feldman, E. L., Corey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+neuritogenesis+and+maturation+of+primary+spinal+motor+neurons+in+response+to+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Accelerated neuritogenesis and maturation of primary spinal motor neurons in response to nanofibers.</a> Dev. Neurobiol. 70, 589-603 (2010).</li>
<li>Tan, S. -H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+parameter+study+for+ultra-fine+fiber+fabrication+via+electrospinning+process%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process.</a> Polymer. 46, 6128-6134 (2005).</li>
<li>Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., Hurtado, A., Oudega, M., Trombley, M. T., Gilbert, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+highly+aligned+electrospun+poly-L-lactic+acid+fibers+for+nerve+regeneration+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Creation of highly aligned electrospun poly-L-lactic acid fibers for nerve regeneration applications.</a> J. Neural Eng. 6, (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo tem várias etapas críticas. A primeira envolve a produção adequada dos substratos fibra electrospun. Em meio líquido, as fibras PLLA, PLGA cinema e fosso PLGA será separada da lamínula de vidro como uma única unidade. Se o PLGA é omitido, as fibras PLLA não continuará a ser uma folha plana - eles vão enrolar em um emaranhado inutilizável. Assim, o filme PLGA está incluído como um substrato adequado para manter o alinhamento da fibra durante a cultura. O fosso é adicionado após girar tanto para garantir que as fibras estão firmemente fixos ao filme PLGA e acrescentar rigidez estrutural para o filme. O fosso também serve como uma alça útil quando os substratos são manipuladas durante a fixação, coloração e montagem. Trituração é o segundo passo crítico. Todo esforço deve ser feito para evitar a formação de bolhas. Além disso, temos obtido rendimentos muito maior quando uma pipeta-fogo polido é utilizada para esta etapa. Ao fogo polonês, acender um bico de Bunsen e anexar uma lâmpada para a pipeta. Passe a ponta da pipeta rapidamente através da chama 2-3 vezes, enquanto continuamente apertando e soltando o bulbo - fluxo de ar através da pipeta ajudará a impedir que a ponta de fechar completamente. Examine a ponta da pipeta de modo que o buraco ainda está aberto e que as bordas ligeiramente arredondadas aparecem antes do uso. Eletrofiação é um processo muito versátil, os parâmetros electrospinning pode ser modificado para produzir fibras com uma variedade de morfologias. Tan et al. (2005) detalha um estudo sistemático dos parâmetros que afetam o diâmetro das fibras PLLA electrospun. Wang et al. (2009) apresenta um estudo detalhado dos parâmetros que influenciam o alinhamento das fibras electrospun PLLA.

<table><tbody><tr><td>PLLA</td><td>Boehringer Ingeheim</td><td>Resomer L210</td><td></td></tr><tr><td>PLGA 85:15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43471</td><td></td></tr><tr><td>L15</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2289</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrina</td><td>Akorn Inc</td><td>AK8227</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC 23009-0010</td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7556</td><td></td></tr><tr><td>Putrescina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Selênio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E 1132</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Superóxido dismutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4636</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>PSN</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15640</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Nalge Nunc international</td><td>1680149</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Nalge Nunc international</td><td>1689149</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Accurate Chemical &amp;amp; Scientific Corporation</td><td>2011</td><td></td></tr><tr><td>PLL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F 4759</td><td></td></tr><tr><td>Lamina</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TuJ1</td><td>BD Biosciences</td><td>556321</td><td></td></tr><tr><td>Anti-neurofilamento</td><td>EMD Millipore</td><td>AB1987</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NGFR p75</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3908</td><td></td></tr><tr><td>Soro normal de cabra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Fita de carbono</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13073-1</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold +DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr></tbody></table>

a cultura da motor primário e neurônios sensoriais no media definidas em electrospun poly-l-ácido lático nanofibras andaimes

The Culture of Primary Motor and Sensory Neurons in Defined Media on Electrospun Poly-L-lactide Nanofiber Scaffolds

Eletrofiação é uma técnica para a produção de micro-escala nanométrica para fibras. Fibras podem ser electrospun com diferentes graus de alinhamento, de altamente alinhado completamente ao acaso. Além disso, as fibras pode ser girado de uma variedade de materiais, incluindo polímeros biodegradáveis, tais como poli-L-láctico (PLLA). Estas características tornam as fibras electrospun adequado para uma variedade de aplicações andaime em engenharia de tecidos. Nosso foco é sobre o uso de fibras electrospun alinhados para a regeneração do nervo. Nós temos mostrado previamente que as fibras alinhadas electrospun PLLA direcionar o crescimento de ambos os neurônios sensoriais e motoras primária in vitro. Sustentamos que o uso de um sistema primário de cultura de células é essencial quando se avalia biomateriais para os neurônios modelo real encontrada in vivo, tanto quanto possível. Aqui, descrevemos técnicas utilizadas em nosso laboratório para electrospin andaimes fibroso e cultura explantes gânglios da raiz dorsal, bem como dissociar os neurônios sensoriais e motoras, em andaimes electrospun. No entanto, o electrospinning e / ou técnicas de cultura aqui apresentados são facilmente adaptadas para uso em outras aplicações.

Fibras alinhadas electrospun direcionar o crescimento de neurônios in vitro e são um componente potencial de andaimes regeneração nervosa. Nós descrevemos um procedimento para elaborar substratos fibra electrospun e da cultura livre de soro-sensorial primário de ratos E15 (DRG) e neurônios motores. Visualização de neurônios por imunocitoquímica também está incluído.

A Cultura da Motor Primário e neurônios sensoriais no Media Definidas em electrospun Poly-L-ácido lático nanofibras Andaimes

A eletrofiação é uma técnica para a produção de fibras em escala micro e nanométrica. As fibras podem ser eletrofias com variados graus de alinhamento, desde altamente alinhadas...

As fibras eletrofiadas de BUN alinhadas direcionam o crescimento de neurônios in vitro e são um componente potencial de scaffolds para regeneração nervosa. Aqui, são gerados scaffolds de fibras eletrofiadas de BUN e neurônios sensoriais e motores primários de rato são cultivados sobre eles. Primeiramente, scaffolds fibrosos são eletrofiados sobre lamínulas de vidro.Neurônios primários são então obtidos de ratos no dia embrionário 15 e cultivados em scaffolds de fibras eletrofiadas. Os neurônios são deixados aderirem e crescerem, depois são fixados e corados utilizando técnicas de imunocitoquímica. Os resultados de imagem revelam alterações na morfologia dos neurônios cultivados em fibras eletrofiadas, indicando que a nanotopografia das fibras eletrofiadas pode direcionar o crescimento dos neuritos.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o uso de linhagens celulares transformadas, é que os neurônios primários in vitro imitam mais fielmente o comportamento dos neurônios in vivo do que as células transformadas. Essas técnicas oferecem aos pesquisadores a possibilidade de utilizar fibras eletrofúnicas com outros tipos celulares. Alternativamente, os pesquisadores podem desejar usar neurônios motores e sensoriais cultivados para outras finalidades investigativas.Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque a eletrofiação é um processo delicado, o que explicamos em mais detalhes no nosso artigo em vídeo. Para preparar substratos de fibras eletrofiadas, comece preparando uma solução a 8% de ácido polilático-co-glicólico 85 a 15, ou PLGA, em clorofórmio e uma solução a 4% de poli-L-lactídeo ou PLLA em clorofórmio, agitando sob aquecimento baixo. Em seguida, recubra lâminas de vidro limpas com PLGA cobrindo toda a superfície de cada lamínula com a solução de PLGA. Deixe o PLGA secar formando uma película fina, o que leva aproximadamente 30 minutos.Uma vez que o PLGA esteja seco, use fita de carbono condutora para fixar uma lâmina de microscopia revestida com PLGA em uma roda acionada por motor para gerar fibras alinhadas ou em uma placa estacionária para fibras aleatórias. Coloque uma seringa contendo a solução de 4% de PLLA em uma bomba com uma ponta, posicionada a 20 centímetros do coletor.Configure a bomba para aproximadamente 0,22 mililitros por hora. Ajuste o motor da roda para 300 a 400 rotações por minuto. Aplique uma polarização contínua de menos dois quilovolts ao coletor e de mais 15 quilovolts à placa condutora, que está em contato com a ponta metálica.Na ausência de acesso a um terra de fonte de alimentação bipolar, o coletor inicia as fibras da bomba de seringa, que sairão pela ponta da seringa e se acumularão na roda giratória. Continue girando até obter a densidade desejada de fibras; para evitar entupimento da ponta metálica, limpe-a periodicamente com um papel-toalha fixado a uma haste não condutora, seguindo a linha de pipetagem rotativa de PLGA ao redor da borda da lamínula. Essencialmente, criando um fosso ao redor dos eletrodos.As amostras em forma de funil permitem que o PLGA seque. Isso manterá o alinhamento das fibras durante o cultivo. As fibras eletrofiadas e os controles de vidro precisam ser revestidos com proteína antes do cultivo celular.Para fazer isso, cubra os substratos com poliol, lisina, laminina ou fibronectina por pelo menos uma hora. Em seguida, aspire a solução em excesso até que os substratos estejam secos. Se for usada lisina de poliol, o substrato deve ser lavado com água estéril e seco duas vezes após o revestimento inicial.Uma vez secos, coloque os substratos em placas de cultura de tecidos de seis poços para cultura celular, a fim de preparar as células cultivadas que serão crescidas sobre as fibras de eletrofiação. Obtenha embriões E15 de uma rata grávida eutanasiada. Comece esterilizando a área com etanol 70% e, em seguida, levante a pele do abdômen formando uma barraca.Corte as camadas de pele e músculo para expor a cavidade abdominal. Localize o útero e separe-o no colo do útero e nos ovários. Transfira o útero para uma placa estéril.Em seguida, remova os embriões do útero com tesoura e coloque-os imediatamente em L 15 morno. Após decapitar os embriões, posicione um embrião de lado, protegendo a medula espinhal com um par de pinças. Use o outro par para remover os membros e os órgãos abdominais.Em seguida, vire o embrião e segure-o firmemente com um par de pin&ccedil;as. Retire cuidadosamente ao longo do comprimento do embri&atilde;o, do pesco&ccedil;o at&eacute; a cauda, at&eacute; que toda a medula espinhal esteja exposta. Segure a extremidade da medula espinhal com cuidado e, ent&atilde;o, puxe-a sobre si mesma em dire&ccedil;&atilde;o &agrave; cauda.Para removê-lo, o cordão será liberado com a membrana e os gânglios das raízes dorsais presos. Se for realizada uma cultura de gânglios das raízes dorsais x explante ou de neurônios sensoriais dissociados, corte os gânglios das raízes dorsais do cordão e transfira-os para um novo recipiente com L 15 morno. Para cultura de neurônios motores.Segure a membrana da medula espinhal na extremidade anterior da medula e desprenda-a em direção descendente. De maneira semelhante a remover uma meia comprida, repita este processo para todos os embriões e, em seguida, utilizando pinças, pique as medulas em pequenos pedaços para obter culturas de neurônios motores.Despeje as medulas espinhais picadas e o meio L-15 em um tubo cônico e centrifugue a 180 vezes a gravidade por dois a três minutos. Para obter o pellet dos fragmentos, remova o sobrenadante e adicione três mililitros de tripsina aos cordões pelotizados. Coloque o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius e incube por 20 minutos.Após a incubação, adicione três mililitros de soro bovino fetal (FBS) ao tubo cônico. Em seguida, centrifugue a 180 ×g por dois a três minutos para repelir. Enquanto isso, lave a pipeta de vidro COTA com ponta polida à chama usando FBS, aspirando o FBS para dentro da pipeta e depois expulsando-o.Isso evita que fragmentos de tecido aderem ao vidro durante a trituração. Após a centrifugação, remova o sobrenadante. Em seguida, adicione ao tubo cônico uma pipeta completa (tipo pasta) de L-15 e triture suavemente usando a pipeta revestida com SBF até que a solução fique homogênea, sem aglomerados visíveis.Evite bolhas. Prepare um tubo com três mililitros de 9%opre em L 15 para cada dois embriões. Se houver um número ímpar de embriões, adicione uma gota.A solução homogeneizada na parte superior da solução Opti-Prep, dividindo o homogenato uniformemente entre todos os tubos. O homogenato formará uma camada nublada visível na parte superior da solução Opti-Prep. Centrifugue os tubos a 700 vezes a gravidade durante 15 minutos.Colete cuidadosamente os dois mililitros superiores de cada tubo e transfira para um tubo cônico de 50 mililitros. Preencha o tubo cônico com L 15 e centrifugue a 180 ×g por cinco minutos para lavar as células do opre. Remova o sobrenadante.O pellet raramente é visível a olho nu. Nesta etapa, Reese, suspenda as células em uma pequena quantidade de meio de plaqueamento. Conte as células utilizando exclusão com azul de tripano para identificar as células vivas.As células estão agora prontas para semeadura. Espera-se obter uma pureza superior a 90% de neurônios para culturas de neurônios sensoriais. Comece despejando os gânglios da raiz dorsal removidos das medulas espinhais e o L 15 em um tubo cônico.Centrifugue a 180 ×g por dois a três minutos para formar o pellet dos fragmentos após a centrifugação. Descarte o sobrenadante e adicione três mililitros de trips ao DRG em pellet; incube em banho-maria a 37 °C. Após 10 minutos, retire o tubo do banho-maria e adicione três mililitros de SBF ao tubo; centrifugue a 180 ×g por dois a três minutos para re-pelletizar.Enquanto isso, recubra um pipeta de pasta polida ao fogo com FBS. Como antes, use a pipeta revestida com FBS para adicionar uma pipeta cheia de L-15 ao pellet e triar suavemente até que a solução esteja homogênea, sem grumos visíveis. Evite bolhas após centrifugar o homogenato a 180 vezes a gravidade por cinco minutos.Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em uma pequena quantidade de meio de plating para neurônios sensoriais. Conte as células utilizando exclusão com azul de tripano para identificar as células viáveis. As células estão agora prontas para serem semeadas em cultura para neurônios sensoriais ou motores.Inicie cobrindo os substratos de fibras eletrofiadas revestidos com proteína com algumas gotas de meio. Em seguida, adicione um volume apropriado de suspensão celular. As células dissociadas devem ser semeadas em baixa densidade.Deixe as células aderirem por pelo menos uma hora no incubador antes de inundar os poços com meio e devolvê-los ao incubador para cultivo. Beringelas de gânglios da raiz dorsal cobrem os substratos de fibras eletrofiadas revestidos com proteína com algumas gotas de meio. Em seguida, adicione gânglios da raiz dorsal ao meio.Organize os gânglios da raiz dorsal de modo que fiquem uniformemente distribuídos sobre o substrato. Aproximadamente quatro gânglios da raiz dorsal cabem em um lamínula de 22 por 22 milímetros. Coloque as culturas dos gânglios da raiz dorsal no incubador a 37 graus Celsius e deixe-as aderirem por pelo menos quatro horas após a incubação.Cubra os poços com meio e retorne-os ao incubador. Os cultivos podem ser mantidos por até quatro dias sem troca de meio. Para cultivos mais longos, devem ser realizadas trocas parciais de meio com meio de alimentação.O meio de cultivo tem a mesma composição do meio de plaqueamento, exceto pela ausência de L-glutamina. Quando as células atingirem o ponto temporal desejado, pode-se realizar a imunocitoquímica de acordo com as instruções no protocolo escrito acompanhante. Esta imagem de MEV ilustra a morfologia típica de fibras eletrofiadas alinhadas e aleatórias.O alinhamento das fibras é manipulado pela escolha do coletor. Observe que as fibras depositadas em um coletor rotativo são uniformemente alinhadas. Em contraste, as fibras depositadas em um coletor estacionário apresentam uma morfologia aleatória.Essas imagens mostram a coloração de neurônios motores para beta tubulina, exibida em verde, e a coloração nuclear com DPI, em azul. Após 24 horas de cultivo em fibras revestidas com PLL e em fibras de vidro, os neurônios motores geralmente possuem poucos prolongamentos que se projetam do corpo celular paralelamente à direção de alinhamento das fibras, que neste caso é da esquerda para a direita. Os prolongamentos principais das células cultivadas em fibras são muito mais longos do que os prolongamentos principais das células cultivadas em vidro no mesmo período de tempo.Os pontos nas neurônios motores de vidro normalmente possuem mais prolongamentos após 24 horas, que se estendem radialmente a partir do corpo celular. Os neurônios cultivados em fibras. O prolongamento principal também é mais curto em vidro do que aqueles observados em fibras nestas imagens.Os gânglios da raiz dorsal são corados para neurofilamento, mostrado em verde. Após três dias de cultivo em vidro revestido com PLL e fibras, neuritos emanam radialmente do gânglio da raiz dorsal. Também há uma sobreposição significativa de neuritos adjacentes nas fibras.Os neuritos também emanam radialmente do gânglio. No entanto, posteriormente eles mudam de direção e seguem o sentido das fibras alinhadas. Há significativamente menos sobreposição de neuritos adjacentes uma vez que esses procedimentos são dominados.A eletrofiação pode ser realizada em aproximadamente 30 minutos, e neurônios motores e sensoriais podem ser obtidos em cerca de duas horas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de utilizar técnica estéril. O uso de uma pipeta polida ao fogo na etapa de iteração é necessário para maximizar a sobrevivência neuronal.Além disso, é importante incubar a molécula de adesão e as fibras eletrofiadas pelo tempo apropriado. Por exemplo, se as fibras forem revestidas com polilisina por menos de uma hora, haverá uma cobertura insuficiente para suportar a adesão celular. No entanto, se a polilisina permanecer por muito tempo, como durante a noite, as fibras podem se degradar.É também importante lembrar que a maioria dos microscópios não permitirá a visualização de neurônios sobre as fibras durante o cultivo. Isso ocorre porque as fibras e os processos neuronais são muito semelhantes. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como cultivar culturas primárias de neurônios motores e sensitivos de ratos do dia embrionário 15 sobre substratos de fibras eletrofiadas.Não se esqueça de que trabalhar com altas tensões pode ser extremamente perigoso e apropriado. Precauções sempre devem ser tomadas para isolar o operador do conjunto elétrico de fiação.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Electrospinning Fator de Crescimento Releasing Microesferas em fibrosa Andaimes

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