Preparação de um inóculo bacteriano unicelular

Faça uma cultura metabolicamente ativa de Mycobacterium marinum. Isso garante alta viabilidade bacteriana e ótimo estado fisiológico.

Centrifugue a cultura para pellet as bactérias.

Rejeitar o excesso de sobrenadante e ressuspender o sedimento em meios frescos contendo um agente dispersante.

Transferir a suspensão para tubos de microcentrífuga e sonicar em condições controladas.

A sonicação interrompe os agregados bacterianos e dispersa as células, resultando em uma suspensão unicelular viável.

Recolher a suspensão sonicada numa seringa e passá-la através de um filtro de membrana para remover os grumos remanescentes, garantindo uma população unicelular uniforme.

Com um espectrofotómetro, medir a densidade óptica da suspensão bacteriana.

Dilua a suspensão com meios novos contendo crioprotetor para atingir a concentração bacteriana desejada, preservando a viabilidade celular.

Alicote a suspensão final de célula única e armazene-a em temperaturas ultrabaixas. O crioprotetor ajuda a manter a viabilidade bacteriana durante o armazenamento a longo prazo.

Após a inoculação de acordo com o manuscrito, centrifugue a cultura a 3000 vezes G por 10 minutos para coletar o Mycobacterium marinum como um pellet. Descarte todos, exceto 300 microlitros do sobrenadante, e ressuspenda o pellet.

Adicione três mililitros de meio 7H9 com 10% de glicerol para ressuspender ainda mais o pellet e, em seguida, sonicar a suspensão em banho-maria a 100 watts, com 15 segundos ligado e 15 segundos desligado, por um total de dois minutos para obter um homogeneizado de célula única. Transfira a suspensão bacteriana para uma seringa de 10 mililitros e passe por um filtro de cinco mícrons para remover quaisquer aglomerados bacterianos. Usando um espectrofotômetro, meça a densidade óptica da suspensão e dilua-a com meio 7H9 contendo 10% de glicerol a OD 600 em um.

Divida a suspensão em alíquotas de 10 microlitros e armazene no freezer a 80 graus Celsius negativos para uso posterior.