Name: Purificação simplificada do DNA plasmidial das culturas Procarióticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Aprenda a purificar DNA plasmidial de E. coli com método simplificado e econômico usando placas de poços profundos. Esta técnica oferece maior rendimento de DNA de alta qualidade para aplicações em biologia molecular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Apuramento lisado <ol><li> Crescer E. culturas coli transformada com plasmídeo de DNA desejado no bem profundo placas (1 mL da cultura / poço) em caldo de Luria com antibiótico adequado durante a noite a 37 ° C com agitação. </li><li> E. coli Pellet em placa de cultura em 5.000 xg por 10 minutos, em seguida, o sobrenadante decantar. </li><li> Ressuspender cada pellet em 100 mL de buffer ressuspensão (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 mcg / mL de RNase A). </li><li> Adicionar 100 mL Tampão de Lise / poço (200 mM NaOH, 1% SDS) e agitar com placa shaker por 2 minutos. </li><li> Adicionar 100 mL de buffer Neutralização / poço (3,0 M acetato de potássio, pH 5.5) e agitar por 2 minutos. </li><li> Transferência lisado celular para lisado placa esclarecimento. </li><li> Colocar a placa de ligação ao DNA em cima de 350 mL prato de coleta e coloque em baixo do colector de vácuo. Montar coletor de vácuo (ver Figura 1). </li><li> Coloque placa de esclarecimento lisado em cima do aparelho de vácuo. </li><li> Aplicar vácuo a 10 pol Hg (0,34 bar) e coletar DNA filtrado para placa de ligação. Não use vácuo superior a 12 pol Hg. (0,41 bar). </li><li> Desmonte coletor de pó. Coloque 2 mL placa de coleta de lixo no fundo do aparelho. </li></ol> 2. DNA Binding <ol><li> Mover a placa de DNA de ligação ao topo do colector (ver Figura 2). </li><li> Adicionar 300 mL de buffer / poço Binding (6 M de guanidina-HCl) e uma pipeta cima e para baixo para misturar. </li><li> Aplicar vácuo [~ 5 pol Hg (0,17 bar) para vácuo lento] e descartar filtrado. DNA é agora obrigado a membrana. </li><li> Lavar com 400 mL / poço de tampão de lavagem (80% de etanol). </li><li> Aplicar vácuo, em seguida, descartar o filtrado. Descarte desnecessário se usar duas placas coleção mL ou filtragem diretamente para o lixo. </li><li> Repita lave uma vez. </li><li> Blot fundo da placa de filtro de papel absorvente para secar. </li><li> Aplicar vácuo mais uma vez por 5-10 minutos para assegurar a remoção de resíduo de álcool. </li><li> Blot fundo para assegurar a remoção de gotículas de etanol. </li></ol> 3. Eluição DNA <ol><li> Adicionar 70 mL tampão de eluição / poço (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). Se maior concentração de DNA é desejado, o volume pode ser reduzido a 50 mL / poço, mas o rendimento médio total será menor. </li><li> Incubar a placa em temperatura ambiente por um minuto. </li><li> DNA purificado pode ser eluída por qualquer vácuo ou centrifugação. </li><li> Método de vácuo: Coloque placa da coleção clean (DNase, RNase free) no colector de vácuo. Colocar a placa de filtro em cima do colector de vácuo, aplique vácuo de 15 pol Hg (0,5 bar) por 1 minuto até que todos tampão de eluição passou através da placa de DNA de ligação. Coletar DNA purificado (ver Figura 3). </li><li> Método de centrifugação: Coloque placa de purificação do filtro em cima da placa da coleção clean e centrifugar a 1000 xg por 5 minutos. </li></ol> 4. As análises quantitativas e qualitativas <ol><li> Medida OD 260/280, calcular concentração de DNA purificado. </li><li> Realizar análise de gel de agarose do PDNA purificada. </li></ol> 5. Resultados representante E. coli lisado clarificado utilizando centrifugação tradicionais e Pall AcroPrep Adiantamento Placas lisado esclarecimento de filtro mostrou redução significativa de detritos a partir de matéria-prima. (Figura 4). DNA do plasmídeo em três concentrações foi cravado em tampão TE e passado através da placa de esclarecimento AcroPrep Adiantamento lisado filtro. Uma comparação da concentração de DNA plasmidial, pré e pós-filtração, shows ~ recuperação de 100% (Figura 5) em todas as três concentrações. Para demonstrar a recuperação do DNA de E. esclarecidas coli DNA, lisado plasmídeo foi cravado em lisado bruto e, em seguida, esclareceu por filtração. O mesmo DNA do plasmídeo foi adicionado à célula de filtração após lisado. Eletroforese foi realizada em alíquotas de cada amostra (Figura 6). A banda, único e claro de intensidade semelhante de cada amostra demonstra pouco caso de qualquer perda de DNA durante a etapa de clarificação filtração-based. Culturas de E. coli contendo DNA plasmídeo PCAT foram purificados a partir de E. coli lisados ​​usando mL da Pall 350 mL e 1 DNA de ligação placas de filtro, bem como duas outras marcas de 350 placas de DNA mL de ligação. Todas as purificações foram realizados conforme especificado no protocolo recomendado pelo fabricante. A maior concentração de DNA e rendimento total são vistos a partir mL da Pall AcroPrep um avanço placa DNA de purificação do filtro (Figura 7 e Tabela 2). Embora Concorrente W também mostra alta concentração de DNA (155 ng / mL), rendimento de DNA total é a mais baixa (4,7 mg / poço), devido ao volume de recuperação baixo, ~ 30 mL. Concorrente M deu a menor concentração de DNA de 108 ng / mL com um rendimento total de 5,6 mg / poço. Agarose gel análise de DNA purificado PCAT das três placas de DNA diferentes ligação é mostrado na Figura 8. Cada volume da amostra coletada foi ajustado para 65 mL para corrigir diferenças no volume de recuperação antes da eletroforese. Todas as amostras de DNA mostram superenrolado plasmídeo, mas o rendimento do DNA de cada uma das placas de filtro varia. Figura 9 mostra o DNA é tudo preparado na forma superenrolado e tem concentração similar. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Montagem de Manifold vácuo de Esclarecimento Lysate. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Montagem de Manifold de vácuo para Binding DNA. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Montagem de Manifold de vácuo para eluição de vácuo. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Filtração simplifica esclarecimento amostra. Triplicatas de 300 mL de lisado bruto clarificado por filtração a vácuo (350 mL AcroPrep Adiantamento placa esclarecimento lisado filtro) ou centrifugação tradicional. OD 320 medido antes e após esclarecimento. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Recuperação total dos PDNA após a passagem por Antecipação AcroPrep placa de filtro lisado esclarecimento. 300 mL tampão TE enriquecida com PCAT a 25, 50 e 100 mcg / mL. Concentração de DNA e recuperação calculados a partir de 260 OD antes e após a filtração, N = 2. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Recuperação de DNA PCAT após esclarecimento. Quantidades iguais de pUC19 cravado em lisado antes ou depois do esclarecimento, então diluída 1 a 10 em tampão TE. Loaded 2 mL / lane em 1,2% agarose gel. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Maior rendimento de DNA plasmidial por poço com pall DNA Avanço Acroprep placa de filtro de ligação de chapas concorrentes. Rendimento DNA PCAT plasmídeo (OD 260) usando placas de purificação de DNA indicou com 1 mL (Pall e M Concorrente) ou 1,5 mL (Concorrente W) cultura overnight de DH5α. Purificação usando o protocolo recomendado pelo fabricante chapa. Barras de erro indicam o erro padrão (n&gt; 6). <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig8.jpg" alt="Figura 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Agarose gel análise de DNA purificado PCAT na placa de DNA indicaram vinculativo. 1,2% eletroforese em gel de agarose do PDNA purificada. Amostras combinadas de três purificações separado, eluato ajustada para 65 mL após purificação, 01:10 diluída. Loaded 2 mL por pista. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig9.jpg" alt="Figura 9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 9"> Figura 9. Qualidade e de recuperação do DNA puro que quando os métodos de centrifugação ou a vácuo são usados ​​para a final eluato eletroforese em gel de agarose coleção do PDNA purificada. Protocolo recomendado pelo fabricante de placas Adiantamento AcroPrep filtro foi seguido para a purificação PDNA. Eluição foi realizada por centrifugação a 1.000 xg por 5 minutos ou a vácuo com 15 pol Hg (0,5 bar) por 2 minutos.

Os autores deste artigo de vídeo-são funcionários da Pall Life Sciences que produzem os instrumentos e reagentes apresentado no vídeo e texto.

Nós descrevemos um protocolo, facile simplificada de placas de filtro AcroPrep antemão que oferece várias vantagens. Este método oferece rendimentos máximos DNA plasmídeo quando processados ​​em formatos Avanço manual, semi-automática ou totalmente automatizadas AcroPrep. Um pré-filtro integrada na placa de depuração lisado fornece filtração consistentes de amostras, inclusive aqueles contendo altos níveis de partículas. A geometria dos poços da placa de resultados no mais rápido, taxas de filtração mais uniforme em toda a placa com o volume mínimo de hold-up, ea geometria da ponta de saída fornece fluxo direto de amostras em placa de receptor sem preocupações de contaminação cruzada. Importante, a membrana de alta capacidade de ligação em chapa de DNA de ligação de placas Adiantamento AcroPrep filtro é otimizado para recuperação máxima de DNA de alta qualidade plasmídeo.

<table><tbody><tr><td>Placa de filtro AcroPrep Advance</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8175 (1 mL) ou PN 8075 (350 &amp;#181;l)</td><td>Membrana de fibra de vidro de 3 &amp;#x03BC;m e membrana Supor&amp;#174; de 0,2 &amp;#x03BC;m para clarificação</td></tr><tr><td>Placa de filtro AcroPrep Advance</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8132</td><td>para ligação de DNA</td></tr><tr><td>Manifold a vácuo</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 5017</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de pressão a vácuo</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 13157</td><td></td></tr></tbody></table>

purificação simplificada do dna plasmidial das culturas procarióticas

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

Descrevemos o processo completo de Placas Adiantamento AcroPrep Filtro para 96 ​​preparações plasmídeo, a partir de cultura procarióticas e terminando com DNA de alta pureza. Baseado em multi-filtração para o apuramento bem lisado bacteriano e purificação de DNA, esse método cria um processo simplificado para a preparação de plasmídeo. Placas de filtro à base de sílica contendo mídia pode facilmente ser processado por filtração a vácuo ou centrifugação para produzir quantidades apreciáveis ​​de DNA plasmidial. Análises quantitativas determinar o DNA purificado plasmídeo é consistentemente de alta qualidade com média de OD 260/280 índices de 1,97. No geral, os rendimentos plasmídeo oferecer DNA mais puro para aplicações a jusante, tais como seqüenciamento e clonagem. Este método simplificado de usar placas de Adiantamento AcroPrep filtro permite o processamento manual, semi-automática ou totalmente automatizadas.

Este protocolo é uma alternativa rentável para o esclarecimento paralela eficiente e purificação de DNA plasmidial de<em&gt; E. coli</em&gt; Culturas. O processo de Adiantamento AcroPrep começa com uma placa de filtro otimizado lisado esclarecimento seguida de purificação em uma ligação de alta capacidade de ligação DNA placa do filtro.

Purificação simplificada do DNA plasmidial das culturas Procarióticas

Descrevemos o processo completo de utilização das Placas de Filtração AcroPrep Advance para 96 preparações de plasmídeos, começando pela cultura procariótica e terminando com alta...

<a class="grey_button" href="/video/2711"> Chinês </a>

streamlined-purification-of-plasmid-dna-from-prokaryotic-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Purificação de DNA plasmidial colônias bacterianas Usando o Kit Qiagen Miniprep

Descreve-se um método para a purificação por afinidade, marcado de proteínas recombinantes, utilizando o líquido de manipulação robótica. Este método é geralmente aplicável para a purificação de pequena escala de solúveis Sua proteínas marcadas em um formato de alto rendimento.

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

Aqui, é apresentado um protocolo para a criação de um cromossomo artificial bacteriano infeccioso contendo um cDNA de comprimento total do RNA genômico de fita positiva do vírus da encefalite japonesa. Este protocolo pode ser usado para construir um cDNA funcional de outros vírus de RNA de fita positiva, tornando-o uma poderosa ferramenta genômica para estudar a biologia do vírus.

Bacteriana Artificial Chromosomes: Uma Ferramenta genómica funcional para o Estudo da Positivo-fio vírus RNA

O minivetor de DNA linear covalentemente fechado (LCC) (ministring de DNA) é um vetor de entrega de genes não viral que oferece alta eficiência de transfecção e é relevante para qualquer aplicação de entrega de DNA. O sistema de produção é simples, rápido e escalável in vivo. O protocolo a seguir fornece instruções visuais passo a passo para a produção de ministrings de DNA.

Produção de Double-stranded DNA Ministrings

Este artigo apresenta um método sensível chamado Circle-Seq para purificar o DNA circular extracromossômico (eccDNA). O método abrange purificação de coluna, remoção de DNA cromossômico linear restante, amplificação de círculo rolante e sequenciamento de alto rendimento. O Circle-Seq é aplicável à triagem em escala genômica de eccDNA eucariótico e ao estudo da instabilidade do genoma e da variação do número de cópias.

A purificação de todo o genoma de DNA circular Extracromossômica de células eucarióticas

Aqui, descrevemos um método para a purificação de enzimas pyrophosphokinase histidina-tag e utilizando cromatografia em camada fina dos produtos a ensaiar para a atividade enzimática em vitroe substratos marcadas com radioisótopos. O ensaio da atividade da enzima é amplamente aplicável a quinase, ciclase nucleotídeo ou reação de transferência de fósforo, cujo mecanismo inclui a hidrólise de nucleotídeos trifosfato.

Uma purificação e ensaio de atividade In Vitro para um ppGpp (p) sintetase de Clostridium difficile

A montagem in vivo é um método de clonagem independente de ligação que depende de enzimas intrínsecas de reparo de DNA em bactérias para montar fragmentos de DNA por recombinação homóloga. Este protocolo é eficaz em termos de tempo e custo, uma vez que são necessários poucos reagentes e a eficiência da clonagem pode chegar aos 99%.

Uso de montagem in vivo para construção de plasmídeo de alta eficiência

Este artigo descreve uma metodologia para superexpressar Nsp15 recombinante, uma nuclease tóxica, em um sistema de expressão C41 (DE3), seguido de purificação da proteína marcada utilizando cromatografia de afinidade e exclusão de tamanho. Esses protocolos podem ser adaptados para outras proteínas tóxicas desafiadoras.

Superexpressando e purificando uma nuclease tóxica de Escherichia coli

O estudo atual descreve um fluxo de trabalho para sequenciamento nanoporoso de plasmídeos quando a sequência cromossômica já é conhecida ou não tem interesse. Uma etapa inicial de enriquecimento de DNA plasmídico garante a profundidade ótima da sequência plasmídica e maximiza o número de amostras que podem ser sequenciadas por célula de fluxo.

Sequenciamento e montagem de plasmídeos de leitura longa usando fluxos de trabalho baseados em sequenciamento nanopore

Transformação do DNA plasmidial em E. coli Usando o método de choque térmico

Aprenda a purificar DNA plasmidial de E. coli com método simplificado e econômico usando placas de poços profundos. Esta técnica oferece maior rendimento de DNA de alta qualidade para aplicações em biologia molecular.

Purificação simplificada do DNA plasmidial das culturas Procarióticas

Explorar mais vídeos