Name: Rotulagem F-actina Termina farpado com Rodamina-actina em permeabilizadas Cones de Crescimento Neuronal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-17T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprenda a visualizar e quantificar terminais farpados de F-actina livre em cones de crescimento neuronal usando permeabilização com saponina e actina-rodamina. Este método permite estudar a dinâmica do actina em resposta a sinais de orientação axonal.

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Os autores agradecem ao Dr. James Bamburg e membros de seu laboratório para a colaboração nestes estudos. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH HD19950, EY07133 e por concessões do Minnesota Medical Foundation.

Para rodamina-actina rotulagem, os neurônios são cultivadas em lamínulas colocado no fundo de 35 pratos de plástico mm, ou em lamelas coladas em "video" pratos. 1. Preparação de Lamelas ou "Vídeo" Pratos <ol><li> Muitos tipos de neurônios são mal adesivo in vitro substratos. Lamínulas de vidro, que são necessários para este procedimento, podem não permitir a adesão neurônio-substrato suficiente a menos que sejam adequadamente limpo e preparado. Um procedimento detalhado para o ácido da lavagem e limpeza lamínulas de vidro é descrito no livro a cultura de células nervosas, editado por Banker e Goslin. Alternativamente, um revestimento de nitrocelulose para lamínulas, que avidamente se liga as moléculas de substrato, é descrito nos passos 1.7 e 1.8 abaixo. </li><li> Lamínulas de vidro (por exemplo, 18 mm ou 24 praças círculos mm) são lavados em dH 2 O e cozido em calor seco (≥ 225 ° C) o maior tempo possível (mínimo de vários dias até três meses ou mais) para remover traços de orgânicos compostos. Vá para o passo 1.6 ou para pratos de vídeo proceder a 1,3. </li><li> Para criar um substrato de vidro fina e clara para videomicroscopia de alta resolução, orifícios circulares de diâmetro adequado são perfurados no fundo dos 35 ou 50 Petri de plástico mm ou placas de cultura de tecido usando uma broca elétrica de cortiça (ou instrumento similar). Perfuração é feita lentamente, com uma leve pressão para evitar a quebra do plástico. Bordas do buraco perfurado são raspadas com uma tesoura para criar uma superfície lisa em ambos os lados. </li><li> Lamínulas de vidro são limpos para o uso de cultura de tecidos, como descrito em 1.1 ou 1.2. Lamínulas são colados no local sobre os buracos, usando non-toxic cimento aquário silicone (para lamínulas 18x18mm, um pouco 12mm de diâmetro é usado). O cimento é curado por 24 horas. </li><li> (Os passos seguintes são feitos usando condições estéreis) Os pratos são lavados video 3 vezes com dH 2 O estéril e permitiu secar ao ar. </li><li> Lamínulas são revestidos com moléculas de substrato para a cultura neuronal. Em primeiro lugar, a superfície é revestida com lamínula (250 mL de 18x18 lamela) uma solução de 100 mg / mL poli-D-lisina em PBS por 4-8 horas (ou noite) em um umidificado 38 ° C incubadora. Lamínulas são então enxaguadas 3 vezes com dH 2 O estéril para remover unbound poli-D-lisina e secas ao ar. Muitos tipos de neurônios são cultivadas em lamínulas revestidas com poli-D-lisina sozinho, se as proteínas do soro estão incluídos no meio de cultura. No entanto, os resultados mais relevantes para as condições in vivo são obtidos usando moléculas de substrato natural. Soluções destas moléculas, tais como laminina, fibronectina ou CAM L1 (1-20 mcg / mL em PBS), podem ser diretamente aplicadas a poli-D-lisina lamínulas revestido por 4-8 horas ou durante a noite, mas no nosso laboratório, rotineiramente revestimento do lamínulas preparadas com uma fina película de nitrocelulose antes de aplicar moléculas de adesão celular para aumentar a proteína-substrato de ligação. </li><li> Faça uma solução de nitrocelulose 1% dissolvendo 5 g de nitrocelulose em 5 mL de 100% acetato de amila. Aplicar 10 mL desta solução para as lamelas e delicadamente espalhe sobre a superfície. Ar seco de 10 minutos. </li><li> Aplicar 250 L de uma solução de 25 mg / mL laminina ou 4 mg / mL L1 CAM em PBS e espalhar sobre a superfície de nitrocelulose. Incubar 4 horas (ou noite) em um umidificado 38 ° C incubadora, substrato aspirado e imediatamente adicionar meio de cultura, de modo que o substrato não seque. </li></ol> 2. Preparação das Culturas Neuronal <ol><li> Embrionárias dia 7 embriões de galinha são removidos a partir de ovos, e colocado em 100 milímetros pratos petri contendo meio de cultura com soro de 10% para dissecção para remover os órgãos internos do tórax e abdome, utilizando um estereomicroscópio. </li><li> Os embriões são então enxaguadas com o meio e se mudou para um prato de 60 milímetros com meio líquido e posteriormente dissecadas para retirada e preparar explantes de gânglios da raiz dorsal (DRG) ou tecidos neurais da retina. Uma descrição detalhada dissecação pode ser encontrado em Métodos em Biologia Celular, volume 71, Neurônios: Métodos e Aplicações para a biologia celular, editado por Hollenbeck e Bamburg. Explantes DRG são gânglios 1/2-whole e neural explantes da retina são de 1 mm ou menos de diâmetro. </li><li> Após a limpeza dos explantes de tecidos estranhos, explantes individuais são movidos com uma pinça para relojoeiros as lamelas, que já estão em placas de cultura com o meio de cultura. Sob um microscópio de dissecação, o explante é delicadamente pressionado para o centro da lamela com uma pinça para evitar a movimentação durante o transporte para a incubadora. Explantes são cultivados em meio com B27 F12 aditivos, tamponado com HEPES 10 mM de pH 7,4 e colocado durante a noite em um umidificado 38 ° C incubadora. Fatores de crescimento podem ser adicionados, conforme necessário, para o meio de cultura. Neurotrofinas são muitas vezes adicionados aos DRG culturas a partir de embriões mais velhos, embora E7 neurônios DRG vai estender axônios a partir de explantes sem neurotrofinas acrescentou. Explantes de retina neural estender axônios neste meio de cultura semdding fatores de crescimento. </li><li> Culturas são incubadas por pelo menos 18 horas para permitir crescimento axonal suficiente antes de começar o procedimento abaixo. </li></ol> 3. Preparação de Rodamina actina-Buffer permeabilização <ol><li> A solução estoque de tampão contendo 138 mM permeabilização KCl, 10 mM PIPES, 3 mM EGTA, 4 mM MgCl 2, e BSA 1% (pH = 6.9) pode ser mantida até 2 semanas a 4 ° C11. Imediatamente antes da utilização, os seguintes componentes são adicionados para uma concentração final de: saponina 0,025%, 0,1 mM de ATP, e 100 nM Alexa-fluor 350 phalloidin. </li><li> Uma solução separada também é preparada imediatamente antes da utilização com estes mesmos componentes, mais 0,45 rodamina actina muscular não-A solução é alternadamente agitadas e tritrated por 5 minutos para dissolver rodamina actina-aglomerados, e é agitadas durante 1 min durante a etapa de permeabilização inicial para evitar a polimerização no tubo. Se, apesar disso, a montagem de filamento do tubo continua sendo um problema, a solução pode ser centrifugadas antes do uso. </li></ol> 4. Permeabilização das Culturas Neuronal e Incorporação de Rodamina-actina em F-actina Termina farpado <ol><li> A placa de cultura com explantes DRG ou da retina é cuidadosamente removida da incubadora e os passos seguintes são realizados à temperatura ambiente. </li><li> Todas as alterações das soluções deve ser feito com cuidado. A ponta da pipeta deve ser colocada na borda da lamínula, e as soluções devem ser removidos e adicionados lentamente e com pouca força. </li><li> O meio de cultura é removido com uma pipeta com cuidado, mas firmemente, e buffer de permeabilização suficiente para cobrir as células é adicionado para 1 min (para lamela x 18mm 18mm, ~ 60 mL). A cultura não é lavado com outras soluções antes de adicionar o buffer de permeabilização, e as lamelas não é permitida para secar antes de adicionar o buffer de permeabilização. </li><li> O buffer de permeabilização é gentilmente removido com uma pipeta e substituído pelo tampão contendo 0,45 mM permeabilização rodamina actina não-músculo por 4 min. </li><li> A rodamina-actina contendo tampão é gentilmente removido com uma pipeta, e os neurônios são fixadas pela adição de uma solução de paraformaldeído a 4% (qualidade laboratorial, feito com tampão fosfato, pH 7,3), glutaraldeído 0,05% e sacarose 10%. Após a fixação cinco minutos as lamelas são delicadamente lavados com PBS e montadas em Slowfade em lâminas de vidro de 3 polegadas. </li><li> Uma abordagem alternativa para soluções de mudança é a utilização de uma célula de fluxo. Esta pode ser uma célula de fluxo disponíveis comercialmente, ou uma célula de fluxo simples pode ser feita colocando pequenos pedaços de plástico (≤ 1 mm de espessura) como espaçadores nos cantos da lamínula, e então montar uma lamínula de mesmo tamanho na parte superior da lamela. Soluções podem ser trocados por colocar a pipeta em um dos lados da célula de fluxo e retirada soluções com um pavio (algodão ou um Kimwipe) no outro lado. </li><li> A incorporação de rodamina-actina em F-actina termina farpado e fluorescente-phalloidin rotulagem de F-actina em cones de crescimento é visualizado com epi-fluorescência óptica através de um objetivo 60X óleo de imersão, e as imagens são coletados, usando uma câmera CCD refrigerado. Um microscópio confocal pode fornecer imagens melhoradas. </li><li> Para melhor quantificação da rodamina-actina incorporação de todas as imagens devem ser recolhidos em uma única sessão, usando o mesmo ganho e as configurações de exposição da sensibilidade da câmera digital para cada imagem. Análise de rotulagem deve ser feita a partir de regiões equivalentes de cada imagem; Metamorph, Image J ou similar ferramentas informatizadas para análise de imagens pode ser usado. </li></ol> Variações deste PROCEDIMENTO 5. Uma variação: Colete Imagens Live Cell Antes de Rodamina actina-Labeling <ol><li> Pratos de vídeo são colocadas em um estágio do microscópio aquecida, e as imagens ao vivo cone de crescimento são coletados. Lamínulas em grade pode ser usado, ou gravuras e / ou marcas de caneta na lamela pode ser feita para encontrar mais facilmente células específicas após a rotulagem ou o prato de vídeo pode ser fixado no lugar no estágio do microscópio para a duração do procedimento. </li><li> Incorporação permeabilização, de rodamina-actina, e fixação de células são conduzidas no prato de vídeo, dentro ou fora do palco microscópio. Após a fixação, PBS é adicionado a pratos de vídeo para imagens imediatas. Para preservar a amostra para imagens mais tarde, slowfade meio de montagem é adicionado à lamela e uma lamela de igual tamanho é suavemente colocado em cima (evitar bolhas), e as bordas são seladas com unhas polonês claro. </li></ol> 6. Variação dois: Imunoquímica de Proteínas Co-label adicionais <ol><li> Rodamina actina-incorporação e fixação pode ser realizada em neurônios cultivados em lamelas ou em pratos de vídeo, como descrito acima (4,2-4,4). </li><li> Após a fixação e lavagem em PBS, as células são tratados 15 min com 0,1 M de glicina em PBS e, em seguida, extraída com 0,1% Triton X-100 (TX-100) em PBS com soro de cabra 2% e BSA 1% durante 1 h. Lamínulassão incubadas com os anticorpos primários diluídos em PBS contendo BSA 1% durante 1 h. As lamelas são então lavados e incubados em 0,1% TX-100 em PBS com soro de cabra 2% e BSA 1% durante 1 h, antes de aplicar fluorescentes anticorpos secundários na diluição 1:1000 em PBS com BSA 1% durante 1 h. Após a lavagem, as lamelas são novamente incubadas em 0,1% TX-100 em PBS com soro de cabra 2% e BSA 1% por 30 min, lavadas, e montados em anti-fading médio. A localização de algumas proteínas é interrompida pela etapa inicial permeabilização (4.3). Para manter estas proteínas para localização com anticorpos, paraformaldeído e glutaraldeído 0,05% 0,05% pode ser adicionado ao buffer permeabilização por 1 min (isto é, antes de adicionar o rodamina-actina) sem afetar a rotulagem final farpado por rodamina-actina. </li><li> Imagens de cones de crescimento triple-rotulados são recolhidos por microscopia de fluorescência confocal ou. </li></ol> 7. Variação Três: Avaliação dos Efeitos da Cues Orientação sobre extremidades livres F-actina farpado <ol><li> Um fator de crescimento ou sugestão orientação é adicionado a placas de cultura na incubadora, em concentrações de vários ng / mL por alguns minutos (ou um tempo de tratamento apropriado) antes de retirar o prato da incubadora e iniciar o procedimento de permeabilização. Isto permite a avaliação dos efeitos de curto prazo de fatores de crescimento ou pistas de orientação sobre extremidades livres F-actina farpado. </li><li> Um prato de vídeo com as culturas de neurônios pode ser colocado em um estágio do microscópio aquecida, e fatores de crescimento ou pistas de orientação podem ser liberados a partir de uma micropipeta em um gradiente próximo a um cone de crescimento antes de começar a permeabilização e rodamina actina-incorporação. Por exemplo, NGF pode ser liberado para DRG neurônios ou netrin de células ganglionares da retina neural. A pipeta pode ser introduzida para tão curto quanto 1-2 minutos antes de iniciar o procedimento de permeabilização. Isto permite a avaliação dos efeitos locais de um gradiente de cue orientação sobre a formação de extremidades livres F-actina farpado nas margens de crescimento cone principal (ver citação de referência 10 para imagens). </li><li> Estas variações podem ser combinados com mediada por anticorpos rotulagem de outros componentes neuronal, como descrito em 6.2 acima. </li></ol> 8. Quatro variação: F-actina Labeling extremidade livre farpado em Neurônios Transfectados <ol><li> O uso de construções constitutivamente ativa ou dominante-negativo ou knockdown proteínas usando RNAi (com um marcador fluorescente identificar) pode ser usado para avaliar o envolvimento de uma proteína na regulação da F-actina livre termina farpado. Dependendo da proteína, sua localização dentro do cone de crescimento, e se ele é fundido a uma etiqueta fluorescente, a proteína fluorescente expressa em células transfectadas pode ser perdida após permeabilização. Se este for o caso, pratos de vídeo pode ser usado para identificar uma célula transfectadas microscopicamente antes de permeabilização ea permeabilização pode ser realizada no palco microscópio, depois de marcar as posições das células transfectadas. Alternativamente, uma construção GFP-actina pode ser co-transfectadas com GFP-um constructo de interesse. Neste caso, GFP-actina serão incorporados F-actina, e não será perdida por permeabilização, permitindo a identificação de células transfectadas após permeabilização. </li><li> Esta variação pode ser combinada com a adição de pistas de orientação, conforme descrito no 7,1-7,3 acima. </li></ol> 9. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Além global de NGF aumentos totais F-actina e F-actina termina farpado na margem cone de maior crescimento. Quando um cone de crescimento DRG é estimulado com fator de crescimento neural (NGF) por 5 minutos, polimerização de actina é estimulada na margem principal, e uma banda de rodamina-actina rotulagem é visto em torno da periferia do cone de crescimento. A Figura 1 compara rodamina-actina incorporação em um cone unstimulated DRG crescimento e uma NGF estimulada cone de crescimento DRG. A fluorescência verde nas imagens fundidas é phalloidin rotulagem de F-actina no cone de crescimento eo vermelho é rodamina-actina rotulagem. Um bom controle de rotulagem final farpado é adicionar 10-6 M ou superior citocalasina B ou D no buffer de permeabilização nos passos 4.2 e 4.3. Citocalasinas cap F-actina termina farpado e inibir rodamina actina-binding para fins farpado. Isso deve reduzir drasticamente ou eliminar a incorporação de rodamina-actina na célula. Barra de escala, 10 mM. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Um gradiente de NGF localmente aumenta a F-actina termina farpado. A micropipeta que libera NGF é trazido para um lado de um cone de crescimento DRG por 2 minutos, seguido de rotulagem de F-actina livre termina farpado. As imagens abaixo mostram que a exposição a um gradiente de NGF localmente estimula um aumento na extremidades livres F-actina farpado na região cone de crescimento mais perto da pipeta. A imagem mesclada mostra phalloidin em verdee rodamina-actina em vermelho. Barra de escala, 10 mM. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. ERM proteínas ativadas acumulam na margem cone de maior crescimento. Rotulagem imunocitoquímico de phospho-Ezrin/Radixin/Moesin (PERM) com extremidades livres F-actina farpado. Gluteraldehyde (0,05%) e paraformaldeído (0,05%) foram adicionados ao tampão de permeabilização inicial para uma min para preservar a localização de ERM. Rodamina-actina, vermelho, PERM, verde; phalloidin, azul. Barra de escala, 10 mM. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Estimulação da polimerização de actina requer proteínas ERM ativo. DRGs Dissociated foram co-transfectadas com GFP-actina e um controle GFP plasmídeo ou um dominante negativo Ezrin / Radixin / Moesin (DN ERM) construir. O uso de GFP-actina permite a identificação de células transfectadas após permeabilização. Aqui, NGF foi adicionado 5 min antes de rotulagem de F-actina termina farpado. Observe o cone de crescimento transfectadas com DN ERM tem reduzido os níveis de final farpado na margem cone de crescimento inicial (painel inferior do meio), o que contrasta com um cone de crescimento próxima untransfected (painéis inferiores), ou com o controle GFP (painel de média alta). Rodamina-actina, vermelho; GFP-actina, verde. Barra de escala, 10 mM.

<ol><li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+Understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).</li>
<li>Letourneau, P. Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLetourneau%2C+P+%22Encyclopedia+of+Neuroscience%22">Encyclopedia of Neuroscience</a>. Squire, L. R. , Academic Press. Oxford. 1139-1145 (2008).</li>
<li>Kalil, K., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Touch+and+go%3A+Guidance+cues+signal+to+the+growth+cone+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobio%22%5BJournal%5D)">Touch and go: Guidance cues signal to the growth cone cytoskeleton.</a> Curr Opin Neurobio. 15, 521-526 (2005).</li>
<li>Dent, E. W., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+and+transport+in+growth+cone+motility+and+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance.</a> Neuron. 40, 209-227 (2003).</li>
<li>Pak, C. W., Flynn, K. C., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-binding+proteins+take+the+reins+in+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Actin-binding proteins take the reins in growth cones.</a> Nat Rev Neurosci. 9, 136-147 (2008).</li>
<li>Guan, K. L., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+mediating+neuronal+responses+to+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues.</a> Nat Rev Neurosci. 4, 941-956 (2003).</li>
<li>Gallo, G., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+growth+cone+actin+filaments+by+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of growth cone actin filaments by guidance cues.</a> J. Neurobiology. 58, 92-102 (2004).</li>
<li>Fass, J., Gehler, S., Sarmiere, P., Letourneau, P., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+filopodial+dynamics+through+actin-depolymerizing+factor%2Fcofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Sci+Inter%22%5BJournal%5D)">Regulating filopodial dynamics through actin-depolymerizing factor/cofilin.</a> Anat Sci Inter. 79, 173-183 (2004).</li>
<li>Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2Fcofilin%3A+A+functional+node+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ADF/cofilin: A functional node in cell biology.</a> Trends Cell Biol. 20, 187-195 (2010).</li>
<li>Marsick, B. M., Flynn, K. C., Santiago, M., Bamburg, J. R., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+ADF%2Fcofilin+mediates+attractive+growth+cone+turning+toward+nerve+growth+factor+and+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin-1.</a> Dev Neurobiol. 70, 565-588 (2010).</li>
<li>Symons, M. H., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+actin+polymerization+in+live+and+permeabilized+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts.</a> J Cell Biol. 114, 503-513 (1991).</li>
<li>Chan, A. Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J. B., Segall, J. E., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+stimulates+an+increase+in+actin+nucleation+and+filament+number+at+the+leading+edge+of+the+lamellipod+in+mammary+adenocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells.</a> J Cell Sci. 111, 199-211 (1998).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os métodos aqui apresentados permitem resolução temporal e espacial de componentes celulares que estão envolvidos na remodelação dinâmica do citoesqueleto de actina na margem líder de migração cones de crescimento. A ação das moléculas de atrativo, como NGF ou netrin, para estimular rapidamente a polimerização de actina filamento é revelado como um aumento local na actina termina farpado, criado por actina cortando filamento ativado ADF / cofilina 10, como mostrado nas Figuras 1 e 2. O método permite a locali...

<table><tbody><tr><td>lamínula de 18x18 mm</td><td>Gold Seal</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri de 35 mm</td><td>Falcon BD</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>cimento para aquário</td><td></td><td>DAP 100% silicone aquarium sealant</td><td>qualquer loja de material de construção</td></tr><tr><td>poli-D-lisina (mm &amp;gt; 300.000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td></td></tr><tr><td>laminina natural de camundongo</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>L1 CAM</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>777-NC</td><td></td></tr><tr><td>alexa-fluor 350 faloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A22281</td><td></td></tr><tr><td>actina não muscular rodamina</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>meio de cultura F12</td><td>Invitrogen</td><td>21700-075</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Slowfade</td><td>Invitrogen</td><td>536937</td><td></td></tr></tbody></table>

rotulagem f-actina termina farpado com rodamina-actina em permeabilizadas cones de crescimento neuronal

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

As pontas móveis de axônios em crescimento são chamados cones de crescimento. Cones de crescimento levam a navegar axônios através dos tecidos em desenvolvimento, interagindo com pistas expressas localmente orientação molecular que se ligam receptores cone de crescimento e regulam a dinâmica e organização do citoesqueleto cone de crescimento 3-6. O principal alvo desses sinais de navegação é a malha filamento de actina que enche a periferia cone de crescimento e que dirige a motilidade cone de crescimento através da polimerização de actina contínua e dinâmica remodelação 7. Pistas de orientação positiva ou atraentes induzir cone de crescimento transformando estimulando actina filamento (F-actina) polimerização na região da periferia do cone de crescimento que é mais perto da fonte do cue atrativo. Esta polimerização de actina unidades locais de crescimento cone protrusão de adesão, da margem de liderança e alongamento axonal em direção ao atrativo. Polimerização de actina filamento depende da disponibilidade de monômero de actina suficiente e nos núcleos de polimerização ou termina filamento de actina farpado para a adição de monômero. Actina monômero é abundantemente disponível no pinto gânglio da raiz dorsal e da retina (DRG) cones de crescimento. Conseqüentemente, a polimerização aumenta rapidamente quando livre F-actina termina farpado ficam disponíveis para a adição de monômero. Isso ocorre no pinto DRG e cones da retina de crescimento através da ativação local da actina proteína F-actina cortando depolymerizing fator (ADF / cofilina) na região cone de crescimento mais perto de uma 80-10 atrativo. Esta atividade ADF / cofilina heightened severs filamentos de actina para criar novos F-actina termina farpado para polimerização. O método a seguir demonstra esse mecanismo. Conteúdo total de F-actina é visualizado através da coloração com phalloidin fluorescente. F-actina termina farpado são visualizados através da incorporação de rodamina-actina dentro de cones de crescimento que são permeabilizadas com o procedimento descrito a seguir, que é adaptado a partir de estudos anteriores de outras células móveis 11, 12. Quando rodamina-actina é adicionado em uma concentração acima da concentração crítica para além de monômero de actina para fins farpado, rodamina-actina monta para livre termina farpado. Se a sugestão atraente é apresentado em um gradiente, como sendo liberados a partir de uma micropipeta posicionada para um lado de um cone de crescimento, a incorporação de rodamina-actina em F-actina termina farpado será maior no lado cone de crescimento para a micropipeta 10 . Cones de crescimento são estruturas celulares pequenas e delicadas. Os procedimentos de permeabilização rodamina-actina fixação incorporação, e visualização de fluorescência são cuidadosamente feito e pode ser realizada no palco de um microscópio invertido. Estes métodos podem ser aplicados ao estudo de polimerização de actina locais nos neurônios migrar, outras células do tecido primário ou linhas celulares.

Um método de visualizar e quantificar F-actina termina farpado em cones de crescimento neuronal é descrito. Depois de neurônios cultura em lamínulas, as células são permeabilizadas com uma solução contendo saponina. Em seguida, um de incubação curto com o buffer contendo saponina rodamina-actina incorpora actina fluorescente para fins de actina livre farpado.

Rotulagem F-actina Termina farpado com Rodamina-actina em permeabilizadas Cones de Crescimento Neuronal

As extremidades móveis de axônios em crescimento são chamadas de cones de crescimento. Os cones de crescimento guiam a navegação dos axônios através de tecidos em desenvolvimento ao interagirem localmente...

O objetivo geral do experimento a seguir é visualizar a localização e o número de filamentos de actina livres, com extremidades ativas disponíveis para polimerização de actina em cones de crescimento neurais expostos a sinais de orientação axonal. Isso é conseguido primeiramente imergindo neurônios cultivados em lamínulas em um tampão contendo saponina, para tornar os cones de crescimento permeáveis. Em seguida, as células são expostas a um tampão contendo actina rumina por quatro minutos, permitindo que a actina rumina entre nos cones de crescimento e polimerize nas extremidades ativas livres da actina F.Por fim, as células são fixadas quimicamente e lavadas para preservar a distribuição da actina F. Extremidades pontiagudas que incorporaram actina rumina. Com base em microscopia de fluorescência e análise quantitativa de imagens, obtêm-se resultados que mostram que sinais quimiotáticos atrativos aumentam o número de f efeitos livres.Extremidades com ponta na borda anterior de cones de crescimento em migração. Olá, sou Paul Erno do Departamento de Neurociência da Escola de Medicina da Universidade de Minnesota. Hoje vamos demonstrar o preparo de culturas de cones de crescimento neurais de pintinho.Vamos demonstrar um método para visualizar nos cones de crescimento as extremidades livres dos filamentos de actina, que são componentes dinâmicos do citoesqueleto responsáveis por impulsionar os axônios para a frente enquanto eles se deslocam através dos embriões até seus alvos sinápticos. Embora utilizemos este método para investigar a dinâmica da actina e cones de crescimento nervosos, ele pode ser aplicado a outras células neurais móveis, como gliócitos, células da crista neural ou neurônios migratórios. Demonstração dos procedimentos.Hoje estarão presentes os membros do laboratório, Bonnie Marek, pesquisadora pós-doutoranda, e Jose San Miguel Ruiz, aluno de medicina e doutorado. Para preparar as placas de vídeo utilizadas para marcação da actina neuronal com rumina, lave lamínulas de vidro quadradas de 18 milímetros ou circulares de 24 milímetros com água destilada e as asse em calor seco por três meses ou mais. Outros métodos de limpeza de lamínulas podem substituir o processo de esterilização em estufa. Faça furos circulares de diâmetro apropriado no fundo de placas de Petri ou de cultura de tecidos plásticas de 35 ou 50 milímetros utilizando um saca-rolhas, broca ou outro instrumento. Em seguida, raspe as bordas dos furos com uma tesoura para criar uma superfície lisa em ambos os lados.Em seguida, uma lamínula limpa é colada sobre o orifício em cada placa com cimento de aquário de silicone e as placas são lavadas várias vezes com água destilada estéril. As placas estão agora prontas para o revestimento do substrato. Aplique uma solução de 100 microgramas por mililitro de PDL em PBS sobre as lamínulas ou placas para vídeo e incube por duas a quatro horas em um incubador úmido a 38 graus Celsius.Aspire a solução de PDL e lave as lamínulas três vezes com água destilada estéril, deixando secar ao ar. Em seguida, prepare uma solução de nitrocelulose 1% dissolvendo cinco miligramas de nitrocelulose em cinco mililitros de acetato de amila. Aplique 10 microlitros dessa solução sobre a superfície de uma lamínula e incline-a para espalhar uniformemente, deixando secar ao ar por aproximadamente 10 minutos.Por fim, aplique 250 microlitros de laminina a 25 microgramas por mililitro, ou L um cam a 4 microgramas por mililitro em PBS, e espalhe sobre a superfície de nitrocelulose. Incube de seis a oito horas em um incubador umidificado a 38 graus Celsius. Em seguida, em uma capela de cultura de tecidos, aspire o substrato e adicione imediatamente o meio de cultura, garantindo que o substrato não seja deixado secar.Explan.Culturas de gânglios da raiz dorsal ou GRDs ou tecidos retinianos neuronais são preparadas por dissecação de embriões de pintos de sete dias. Os implantes de GRD correspondem à metade de um gânglio inteiro e os explantes retinianos possuem um milímetro ou menos de diâmetro.Sob um microscópio estereoscópico, use pin&ccedil;as para posicionar o explante sobre a lamínula. Em seguida, pressione-o suavemente no centro da lamínula para evitar movimenta&ccedil;&atilde;o durante o transporte at&eacute; a incubadora. As placas com lamínulas s&atilde;o cuidadosamente movidas e colocadas em uma incubadora aquecida e umidificada por per&iacute;odo de 18 horas ou durante a noite.Durante este período, axônios de várias centenas de micrômetros são estendidos a partir do explante. Prepare o tampão de permeabilização de actina rumine adicionando os seguintes componentes: saponina A TP e LOR três 50 fein. A composição deste tampão é descrita no protocolo escrito.Prepare uma solução separada utilizando os mesmos componentes mais 0,45 micromolar de taxa de actina não muscular de ermine T e vortexie para misturar, a fim de permeabilizar e marcar as células neuronais. Remova cuidadosamente do incubador uma placa de cultura com implantes de GDR ou retina e realize os seguintes passos à temperatura ambiente. Com uma pipeta, remova cuidadosamente o meio de cultura e adicione quantidade suficiente de tampão de permeabilização para cobrir as células; incube por um minuto.Remova cuidadosamente o tampão de permeação e substitua-o pelo tampão contendo 0,45 micromolar de actina de músculo não ruminoide, incubando por quatro minutos. Por fim, remova o tampão contendo actina de ruminoide e fixe os neurônios com 4% de paraformaldeído e 0,05% de glutaraldeído por cinco minutos. Lave suavemente com PBS e monte com slow fade em lâminas de vidro de três polegadas.Utilize um microscópio de fluorescência epi com uma objetiva de imersão em óleo de 60 x para visualizar a incorporação da actina R domine na actina F, nas extremidades barbadas e na marcação fluorescente da actina F nos cones de crescimento, a fim de obter a melhor quantificação da incorporação da actina R domine. Todas as imagens devem ser coletadas em uma única sessão, utilizando as mesmas configurações de ganho de sensibilidade e tempo de exposição da câmera digital para cada imagem. Analise a marcação de regiões equivalentes utilizando o MetaMorph ImageJ ou um software similar de análise de imagens.Várias variações deste procedimento também podem ser realizadas. Uma variação envolve imunoquímica para localizar outras proteínas além da F actina e das extremidades em ponta. Após fixar a actina rumina incorporada e lavar com PBS, podem ser adicionados anticorpos contra outro componente do cone de crescimento, seguidos por lavagem, bloqueio e uma incubação com um anticorpo secundário fluorescente apropriado para marcação tripla com actina r domina e falina fluorescente.Uma terceira variação avalia os efeitos de sinais orientadores sobre o F ACT e as extremidades barbadas livres mediante a adição de fator de crescimento ou sinal orientador aos discos de cultura no incubador por cinco a 15 minutos antes de remover o disco do incubador e iniciar o procedimento de permeabilização. Isso permite avaliar os efeitos de curto prazo de fatores de crescimento ou sinais orientadores sobre o FAC e as extremidades barbadas livres. Alternativamente, coloque um disco para vídeo com culturas neuronais sobre a platina aquecida do microscópio e utilize uma micropipeta para liberar fatores de crescimento ou sinais orientadores em gradiente diante do cone de crescimento neuronal antes de iniciar a permeabilização e a incorporação de actina marcada.Os fatores de crescimento podem ser introduzidos por apenas um a dois minutos antes de iniciar o procedimento de permeação. A permeação e a fixação podem ser realizadas mantendo o prato de vídeo na platina do microscópio. Isso permite a avaliação dos efeitos locais de um gradiente de sinal de orientação na formação de F ACT e extremidades livres em barbantes nos cones de crescimento.Este vídeo mostra a rápida expansão da margem do cone de crescimento em resposta à adição global de Fator de Crescimento Neural (NGF). Quando um cone de crescimento de gânglio da raiz dorsal (DRG) é tratado globalmente com fator de crescimento nervoso por cinco minutos, a polimerização de actina é estimulada na margem anterior e uma faixa brilhante de incorporação de actina rumine é observada ao redor da periferia do cone de crescimento. Este vídeo mostra um cone de crescimento mudando de direção em direção a uma micropipeta que libera NGF e cria um gradiente de NGF mostrado aqui.Quando um lado de um cone de crescimento de gânglio da raiz dorsal é exposto a um gradiente de NGF por dois minutos, ele estimula localmente um aumento na incorporação de actina R domine em F act e nas extremidades livres em barbante. Neste exemplo, a distribuição da rinidina moin fosforilada é revelada por imunoquímica. Além de marcar F ACT e extremidades livres em barbante pela incorporação de actina R domine quando o NGF é adicionado globalmente aqui, os neurônios do gânglio da raiz dorsal foram cotransfectados com actina GFP e um construto dominante negativo de ezrina ridin moisan; o NGF foi adicionado cinco minutos antes da marcação das extremidades em barbante da actina F.Observe que o cone de crescimento transfectado com o construto dominante negativo de ERM possui poucas extremidades livres de F-actina na margem anterior do cone de crescimento, o que contrasta com um cone de crescimento próximo não ressecionado. Ao combinar este procedimento com imunoquímica, a localização de F-actina e extremidades livres pode ser relacionada à distribuição de outras proteínas que regulam a dinâmica e a organização da actina. Ao realizar este procedimento, é importante ter cuidado para não perturbar a estrutura delicada dos cones de crescimento neurais.

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Neuroscience

Neurociência

Para compreender como as formas de células complexas, como dendritos neuronais, são alcançados durante o desenvolvimento, é importante ser capaz de precisão organização de microtúbulos ensaio. Aqui nós descrevemos um método imuno etiquetagem robusta para analisar a organização dos microtúbulos dos dendritos arborização dendrítica neurônio sensorial, traquéia, músculos e...

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Este vídeo demonstra o procedimento para coloração fluorescente de neurônios corticais de ratos para microscopia. Ele tem como alvo a F-actina e as proteínas dendríticas para analisar a integridade estrutural e calcular a densidade da F-actina, que é crucial para estudar a função e a saúde neuronal.

Quantificação de pontos filamentosos de actina em neurônios corticais de ratos

Fonte: Alluri, H., et al. Privação e reoxigenação de oxigênio-glicose como um modelo de lesão de isquemia-reperfusão in vitro para estudar a disfunção da barreira hematoencefálica. J. Vis. Exp. (2015). O vídeo demonstra a localização fluorescente de proteínas de junção apertada e fibras de estresse em células endoteliais microvasculares do cérebro de ratos (RBMECs). Na monocamada estressada, anticorpos marcados com fluorescência são usados para marcar as proteínas de junção apertada, enquanto a...

Localização de fluorescência de proteínas de junção apertada e fibras de estresse em células endoteliais

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Quantificação de filamentosas actina (F-actina) puncta no Rat neurônios corticais

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Stripe Ensaio para estudar a atividade atração ou repulsão de um substrato de proteína utilizando dissociado neurônios do hipocampo

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In Vitro Polimerização de F-Actina no início endossomos

Descrevemos como micro e photomanipulation técnicas tais como o FRAP e photoactivation permitem a determinação de parâmetros de motilidade e a spatiotemporal dinâmica de proteínas dentro de migração de células. Leituras experimentais incluem subcellular dinâmica e volume de negócios de reguladores da motilidade ou o citoesqueleto de actina subjacente.

Técnicas de micromanipulação, permitindo a análise da dinâmica morfogenética e rotatividade dos reguladores do citoesqueleto

Descrevemos um método para rastreamento retrógrado dos neurônios motores embrionários Drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos.

Rastreamento retrógrado de neurônios motores embrionários drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos

Relatamos um ensaio simples, eficiente e de alta produtividade baseado em espectroscopia de fluorescência para a quantificação de filamentos de actina em amostras biológicas ex vivo de tecidos cerebrais de roedores e seres humanos.

Um ensaio baseado em espectroscopia de fluorescência com eficiência temporal para avaliar o status de polimerização de actina em roedores e tecidos cerebrais humanos

Este protocolo demonstra um método simples e robusto para estudar na dinâmica do cone de crescimento e crescimento do axônio. Ele descreve como preparar ex vivo fisiologicamente relevantes fatias cerebrais agudas e fornece um pipeline de análise amigável.

In situ Visualização da Dinâmica do Cone de Crescimento e Crescimento do Axon em Culturas agudas de fatias de cérebro embrionário ex vivo

Para avançar, os cones de crescimento devem exercer forças de tração contra o ambiente externo. A geração de forças de tração depende da dinâmica actin e do acoplamento da embreagem. O presente estudo descreve métodos para analisar a dinâmica do actin, acoplamento de embreagem e forças de tração para o avanço do cone de crescimento.

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Aprenda a visualizar e quantificar terminais farpados de F-actina livre em cones de crescimento neuronal usando permeabilização com saponina e actina-rodamina. Este método permite estudar a dinâmica do actina em resposta a sinais de orientação axonal.

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