Name: Desenvolvimento de um marcador negativo selecionáveis para Entamoeba histolytica /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-12T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Aprenda a validar o sistema FCU1 como método de seleção negativa em Entamoeba histolytica usando 5-fluorocitosina. Esta técnica permite eliminar seletivamente células transfectadas e curar plasmídeos episomais.

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Gostaríamos de agradecer Erbs Dr. Philippe por nos fornecer a seqüência de FCU1 gene. Este trabalho foi financiado pelo NIH AI 26649 conceder.

1. FCU Sistema de Seleção Negativa em Entamoeba histolytica <ol><li> A linha de controle de vetores (HM1 / pKT3M) ea linha experimental (HM1/pKT3M-FCU1) foram gerados por técnicas descritas anteriormente 1,2. Sementes das linhas em estudo a partir dos tubos de ações em frascos T-25 e manter a seleção, adicionando antibiótico adequado (12 mcg / mL G418) em TYI-S-33 de médio 3. Os frascos devem ser 70-80% confluentes após 16-18 horas de crescimento a 37 ° C. </li><li> Prepare uma solução estoque 50 mM fresco de 5-fluorocitosina (5-FC, Sigma) em meio TYI-S-33 quente. Vortex rigorosamente por vários minutos para dissolver 5-FC completamente. Filtro de esterilizar a solução de ações por passagem através de um filtro de 0,22 mM. </li><li> Trofozoítos colheita, colocando os frascos no gelo por 3-5 minutos e recolher as células por centrifugação a 200xg por 5 minutos em temperatura ambiente. Ressuspender o sedimento em meio TYI fresco e contar as células. </li><li> Projeto de um experimento típico usa 0,5 x 10 4 células por poço de uma placa de 48 bem em um volume final de 1 mL; e repete em triplicado para cada condição de teste. Além disso, para facilitar as medições fluorescente, um prato separado é usado para cada cepa por ponto de tempo. </li><li> Sementes 0,5 x 10 4 células por poço para cada teste 5-FC concentração, em triplicata. Manter a pressão de seleção de antibióticos no meio TYI. Agora adicione a quantidade necessária de 5-FC solução estoque e trofozoítos a cada poço. </li><li> Incubar as placas em um saco anaeróbica a 37 ° C. </li></ol> 2. Determinação da eficiência da seleção <ol><li> Prepare 2 mg / mL solução estoque de celular rastreador verde CMFDA (Invitrogen) em DMSO. Para fazer a solução de trabalho diluir o estoque 1.000 vezes em meio livre de soro TYI. </li><li> Remova o meio completamente de placas de cultura trofozoíto e substituir com 150 mL CMFDA TYI sem soro contendo. Continue incubação a 37 ° C por 1 hora. </li><li> Remover a solução corante de poços e ler a placa na espectrofluorímetro Spectramax microplaca M2. O comprimento de onda de excitação deve ser fixado em 492 nm ea emissão de fluorescência lida em 517 nm. </li><li> Compare os valores de fluorescência para as células controle versus o transfectants teste. </li><li> Continue a ler as placas em cada intervalo de tempo. Uso positivo apropriado (TYI só) e negativo (25 mcg / mL higromicina) poços de controlo em cada prato. </li></ol> 3. Resultados representante O E. transfectants histolytica mostrou expressão robusta de códon otimizado FCU1 recombinante (Figura 1). Quando este protocolo é seguido corretamente, resulta na eliminação seletiva de E. histolytica células expressando FCU1 na presença de 0,5 mM 5-fluorocitosina. Células controle, em contraste continuar a crescer normalmente em até 5 mM de concentração de 5-FC e chegar a confluência entre 72 e 96 horas (Figura 2-a). O FCU1 células que carregam em 48 horas são completamente lisadas quando os poços tratados são vistos sob um microscópio. Estas também mostram diminuição da fluorescência quando corados com o corante vital CMFDA, que é usado em estudos quantitativos que envolvem grande número de amostras (figura 2-b). O sistema FCU1/5-FC é uma ferramenta eficaz e poderoso de seleção negativa para E. histolytica trofozoítos. <img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Geração de E. histolytica HM1 transfectants expressar marcador selecionável negativo (A) FCU1 proteína recombinante foi detectada em um western blot utilizando anticorpo anti-c Myc (painel superior). Como esperado, uma banda de 42kDa pode ser detectado (indicado por uma seta) no lisado total do transfectants FCU, mas não no vetor sozinho transfectants controle. O painel inferior mostra o mesmo sondado blot com anticorpo anti actina como controle de carga. (B) Resultado do quantitativo PCR em tempo real mostrando a expressão de mRNA específicos FCU1 normalizado para lgl4 controle. <img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Drogas sensibilidade in vitro de E. transfectants histolytica expressar marcador selecionável negativo Curvas de sobrevivência de transfectants (a) e controle (b) transfectants FCU1 expressar cultivadas em 48 poços da placa. As células foram cultivadas na presença de concentrações crescentes do pró-fármaco-5-fluorocitosina; sobrevivência celular foi quantificada através da coloração CMFDA em cada intervalo de tempo conforme indicado no eixo X. O eixo Y representa unidades de fluorescência e é um reflexo direto da população de células sobreviventes. Por favor, note que o FCU1 transfectants expressar mostrou sensibilidade significativa na concentração de 0,5 mM pró-fármaco em comparação com o controle. Nenhuma célula foi observada no ponto de tempo 120h nestes poços como comcomparação com o crescimento confluente visto nos poços de controle correspondente ao microscópio (dados não mostrados). Higrômetro denota 25μg / mL higromicina usado como um controle negativo.

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</ol>

A produção deste vídeo foi patrocinado pela Sigma Aldrich, Inc, que produz alguns dos reagentes utilizados neste artigo.

Embora tenha havido avanços substanciais na Entamoeba molecular ferramentas biológicas não existem métodos atuais disponíveis para eliminar ou interromper genes 4. Knockdown da expressão do gene específico foi alcançado através da utilização de RNAs hairpin 5, pequena interferência RNA 6 e bactérias expressa dsRNA 7. No entanto, estes métodos enquanto eficaz para os genes-alvo respectivos, várias limitações, incluindo o uso de produtos químicos caros, a seleção contínua contra os antibióticos ea necessidade de validação constante devido à alta incidência de reversão que ocorre ao longo do tempo (Alicia Linford, comunicação pessoal) 8. Qualquer plasmídeo pode replicar em Entamoeba como não há, aparentemente, uma exigência estrita seqüência de origens de replicação do DNA 9, e assim uma vez transfectadas, que normalmente é difícil de curar um plasmídeo. Isso limita a possibilidade de utilização de plasmídeos intactos em experimentos knockout recombinação e gene. Marcadores de seleção negativa são componentes-chave de gene targeting métodos como eles podem ser usados ​​para eliminar subpopulações recombinante. Temos expressa com sucesso um códon otimizado FCU1 gene em Entamoeba histolytica e testado o seu potencial como um marcador negativo selecionáveis. Este gene de fusão tem sido utilizado para a terapia de gene do suicídio de células tumorais humanas e metaboliza o pró-fármaco 5-FC em tóxicos produtos a jusante, resultando em inibição da RNA e síntese de DNA 10. FCU1 foi recentemente utilizado como um marcador negativo selecionável em Plasmodium, um outro protozoário. Células Plasmodium berghei expressar FCU1 foram encontrados para ser quase 1000 vezes mais sensíveis ao pró-fármaco in vitro e in vivo do tratamento com 5-FC matou mais de 99,9% do infectando parasitas recombinantes no modelo do rato eritrocítica estágio de malária 11. E. histolytica células expressando FCU1 mostrou apenas uma sensibilidade 30 vezes maior para o pró-fármaco 5-FC, em contraste com a sensibilidade observada em P. berghei. Possíveis razões para isso poderia ser grande pool de nucleotídeos disponível no meio de crescimento competindo com os metabólitos tóxicos. Em ambos os P. berghei e P. falciparum marcador FCU1 tem sido utilizado na interrupção do gene alvo. estudos 11,12. Nosso objetivo é manipular o genoma Entamoeba usando recombinação homóloga. A validação do sistema de seleção FCU1/5-FC negativos é um passo importante para este objectivo.

<table><tbody><tr><td>Meio TYI-S-33</td><td>ATCC</td><td></td><td>Referência incluída no texto</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F7129%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC">5-Fluorocitosina&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7129</td><td></td></tr><tr><td>Rastreador celular verde CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas Spectra Max M2</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento de um marcador negativo selecionáveis ​​para entamoeba histolytica</em

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica é o agente causador da amebíase e infecta até 10% da população do mundo. As técnicas moleculares que permitiram a cima e para baixo-regulação da expressão gênica dependem da transfecção de plasmídeos mantida de forma estável. Enquanto estes têm aumentado nossa compreensão de fatores de virulência Entamoeba, a capacidade de integrar DNA exógeno no genoma, o que permitiria experimentos de genética inversa, seria uma vantagem significativa no estudo deste parasita. Os desafios apresentados por este organismo incluem a incapacidade para selecionar para eventos de recombinação homóloga e dificuldade para curar DNA plasmídeo epissomal de trofozoítos transfectadas. Os resultados mais tarde, em um fundo elevado de DNA exógeno, um grande problema na identificação de trofozoítos no qual um evento de integração bona fide genômica ocorreu. Nós relatamos o desenvolvimento de um sistema de seleção negativa baseada em expressão transgênica de uma citosina deaminase fermento e uracil fosforribosil transferase quimera (FCU1) seleção e com o pró-fármaco 5-fluorocitosina (5-FC). A enzima converte FCU1 non-toxic 5-FC em tóxicos 5-fluorouracil e 5-fluorouridina-monofosfato-5&#39;. E. linhas histolytica expressar FCU1 foram encontrados para ser 30 vezes mais sensíveis aos pró-fármaco em comparação com a estirpe de controlo.

Nós relatamos o desenvolvimento de um sistema de seleção negativa no<em&gt; E. histolytica</em&gt; Baseada em expressão transgênica de uma proteína quimérica (FCU1) e seleção com o pró-fármaco 5-fluorocitosina. A proteína FCU1 é uma fusão de deaminase levedura citosina e uracil fosforibosiltransferase. Expressão de FCU1 resultou em aumento<em&gt; E. histolytica</em&gt; Sensibilidade para 5-fluorocitosina.

Desenvolvimento de um marcador negativo selecionáveis ​​para Entamoeba histolytica</em

A Entamoeba histolytica é o agente causador da amebíase e infecta até 10% da população mundial. As técnicas moleculares que permitiram a ...

O objetivo geral deste experimento é validar o uso do sistema FCU1 cinco FC como um método de seleção negativa em Entamoeba histolytica. Em placas de 48 poços, semeie E. histolytica e transfete linhagens que expressem o gene FCU1 ou o controle vetorial apropriado. Trate as células com a pró-droga cinco FC; nas células que expressam altos níveis de FCU1, o cinco FC será convertido em quantidades efetivas de produtos finais tóxicos. A população celular sobrevivente é corada com C-M-F-D-A para demonstrar a eliminação seletiva das células que expressam FCU1 na presença de cinco FC e para comparar quantitativamente a eficiência da seleção negativa. Este sistema de seleção negativa permitirá, pela primeira vez, a eliminação de plasmídeos episomais de Entamoeba histolytica transfectadas.Dada a dificuldade em relação à presença de manipulação genética convencional, este método pode nos permitir interromper e deletar genes e, em seguida, testar fatores VIR-alvo em nosso programa de descoberta de fármacos. Trofozoítos podem variar quanto à capacidade com que as culturas estocadas prosperam em cultura. Um erro no início pode produzir artefatos e, portanto, uma etapa crítica inicial é o controle de qualidade da cultura inicial.Plante as linhagens inba hisa em estudo a partir de tubos estoque em frascos T25 e mantenha a seleção adicionando o antibiótico apropriado em TYIS 33. Incube os frascos em meio a 37 graus Celsius por 16 horas para que os cultivos atinjam cerca de 80% de confluência. Para este procedimento, prepare sempre um estoque fresco de 50 milimolar de cinco fluorina ou FC em TYIS 33 morno.Vortexar vigorosamente o meio por vários minutos para dissolver completamente os cinco FC e filtrar, esterilizando a solução estoque através de um filtro de 0,22 mícron para colher os trofozoítas. Colocar os frascos sobre gelo por três a cinco minutos e coletar as células por centrifugação a 200 vezes a gravidade durante cinco minutos à temperatura ambiente. Re-suspender o pellet em meio TYI fresco e contar as células para facilitar as medidas fluorescentes subsequentes.Realize os experimentos em triplicata e utilize uma placa separada de 48 poços para cada linhagem por ponto temporal de semente, com 0,5 vezes 10 à quarta células por poço em um volume de 0,5 mililitros para cada teste. Concentração de FC cinco, e mantenha a pressão de seleção com antibiótico no meio TYI. Adicione agora a quantidade necessária da solução estoque de FC cinco, seguida de meio TYI, até um volume final de um mililitro em cada poço e incube as placas em saco anaeróbio a 37 graus Celsius.Prepare uma solução estoque de dois miligramas por mililitro do rastreador celular verde C-M-F-D-A em DMSO. Em seguida, para preparar a solução de trabalho, dilua a solução estoque mil vezes em meio TYI sem soro nos pontos temporais experimentais especificados. Remova completamente o meio das placas de cultura de Tropho Xite e substitua por 150 microlitros de meio TYI sem soro contendo C-M-F-D-A.Continue a incubação a 37 graus Celsius por uma hora, aspire a solução DI dos poços. Finalmente, leia a placa no espectrofluorímetro de microplacas Spectra Max M2, utilizando um comprimento de onda de excitação de 492 nanômetros e uma emissão fluorescente de 517 nanômetros. Compare os valores de fluorescência das células controle com os das transfeções-teste.Continue a leitura das placas em cada intervalo de tempo. Utilize sempre poços de controle positivo e negativo apropriados em cada placa. As análises Western BLO demonstram a geração bem-sucedida do transfectante lya que expressa FCU um, a citosina desaminase de levedura, e a quimera fosforribotransferase de uracila.Esses resultados também são refletidos em medições de PCR quantitativa. Na presença de cinco fluorocitos, as células-controle crescem normalmente até uma concentração de cinco milimolares e atingem confluência entre 72 e 96 horas. Em contraste, as células de E. histolytica que expressam FCU1 são seletivamente eliminadas na presença de 0,5 milimolar do pró-fármaco, conforme observado por microscopia de campo claro.A resposta seletiva das células de E. histolytica que expressam FCU ao fármaco FC Pro cinco é visível pelo clareamento das células. Neste caso, 72 horas após a transfeção, as células são cultivadas. Ao realizar este experimento, é importante lembrar-se de monitorar o crescimento em todos os pontos temporais.Este método pode ser utilizado na mutagênese do tipo "hit and run", que usaremos para responder perguntas importantes sobre a virulência de Inba Hisa.

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