Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 2:14 min. • November 28th, 2025
Comece com colônias de uma bactéria patogênica cultivada em um meio de ágar rico em nutrientes.
Escolha uma única colônia, que garante uma população geneticamente homogênea de células bacterianas e reduz a variabilidade durante a genotipagem.
Utilizando um laço de inoculação estéril, transfira a colônia selecionada para água ultrapura para minimizar o risco de introdução de contaminantes na amostra.
Faça vórtice na suspensão para quebrar a colônia e dispersar as células bacterianas uniformemente.
Em seguida, aqueça a suspensão para desestabilizar o envelope celular bacteriano, que consiste na membrana externa, camada de peptidoglicano e membrana interna.
Isso faz com que as células bacterianas se lisem e liberem conteúdos intracelulares, incluindo DNA genômico, na água.
Centrifuge a suspensão em alta velocidade para separar os detritos celulares do DNA genômico.
Transfira o sobrenadante para um tubo novo para a aplicação de genotipagem a jusante.
Para começar, use laços de inoculação estéreis para semear culturas puras de Yersinia ruckeri em qualquer tipo de ágar adequado em placas de Petri. Incube a 22 graus Celsius por um a dois dias ou a 15 graus Celsius por três a quatro dias. Depois disso, usando laços de inoculação, escolha uma colônia representativa de cada placa de Petri e transfira para tubos centrífugos de 1,5 mililitros, contendo 50 microlitros de água ultra purificada para ressuspensão.
O vórtice é brevemente e incuba por sete minutos em um bloco de aquecimento a 100 graus Celsius. Depois, centrifuge a 16.000 g por três minutos e use uma pipeta para transferir cuidadosamente o DNA do molde sobrenadante para tubos vazios de centrífuga de 1,5 mililitros. Prossiga para a próxima etapa ou armazene o DNA a menos 20 graus Celsius.