Protocolo para vacinas recombinantes RBD baseado SARS: Preparação de proteínas, Vacinação Animal e Detecção de Neutralização

Neste procedimento, uma vacina recombinante que expressa a proteína RBD do SARS-CoV é preparada e sua capacidade de induzir atividade neutralizante contra um pseudovírus do SARS é avaliada. Primeiro, a proteína RBD é expressa e purificada a partir do sobrenadante de cultura de células 293T transfectadas. A proteína purificada é então utilizada para imunizar.

Camundongos e soros são coletados dos camundongos vacinados em diversos momentos após a imunização para quantificar o potencial de neutralização dos soros imunes. É realizado um ensaio de neutralização por vírus pseudotipado; um vírus pseudotipado de SARS que expressa luciferase é produzido por meio de tecnologia recombinante e incubado com uma amostra de soro titulada. Em seguida, avalia-se a capacidade desses vírus neutralizados de infectar células que expressam o co-receptor ACE do SARS, mediante a medição da atividade relativa de luciferase nas células infectadas.

O título de anticorpo neutralizante 50% pode então ser calculado. Meu nome é tu. Atualmente sou pesquisador pós-doutoral no laboratório.

A principal vantagem do ensaio de neutralização por pseudovírus em comparação com técnicas existentes, como os ensaios de neutralização baseados em vírus vivos, é que esta técnica é relativamente segura. Não requer um vírus SARS infeccioso e pode ser realizada em um laboratório que não seja de nível de biossegurança 3. O nome do demonstrador do procedimento será Lay, e DU é um pesquisador pós-doutorando no meu laboratório que tem se dedicado ao desenvolvimento de vacinas contra doenças infecciosas emergentes, tais como SARS e gripe. Descongele alíquotas do tampão estéril HBS 2X, pH 7, cloreto de cálcio 2,5 molar e plasmídeo RBD à temperatura ambiente.

Uma vez que as soluções estejam descongeladas, transfira dois mililitros de dois XHBS para um tubo cônico de 50 mililitros; em um tubo de 15 mililitros, misture 200 microlitros de cloreto de cálcio com 40 microgramas de plasmídeo RBD. Ajuste o volume para dois mililitros utilizando água destilada estéril à temperatura ambiente com uma pipeta estéril de cinco mililitros. Adicione a solução de plasmídeo aos dois XHBS de maneira gota a gota, mantendo a mistura sob vortex constante, porém suave.

Manter esse vórtice lento e contínuo é crucial para obter um precipitado de consistência adequada para alta eficiência de transfeção. Armazene por 20 minutos à temperatura ambiente. Após essa incubação, adicione a mistura gota a gota a um frasco contendo células 293T com 50 a 70% de confluência.

Em um volume de 40 mililitros de meio de cultura celular, é importante distribuir a solução de transfeção uniformemente. Misture o meio imediatamente após adicionar a mistura de transfeção. Incube as células a 37 graus Celsius em uma estufa com 5% de dióxido de carbono.

Após oito a 10 horas de incubação, remova o meio celular completo e substitua por 50 mililitros de meio ótimo sem soro, fresco, para evitar qualquer interferência do soro na subsequente purificação de proteínas, e então retorne as células ao incubador a 37 graus Celsius. Dois dias depois, colete o sobrenadante, que conterá a proteína RBD expressa, e centrifugue por 15 minutos a 6.000 RPM para remover os detritos celulares. Uma vez que as células tenham sido sedimentadas, transfira o sobrenadante para um tubo novo e adicione um coquetel de inibidores de protease.

Para evitar a degradação proteica, utilize níquel NTA super flow seguindo as instruções do fabricante para purificar a proteína recombinante RBD do sobrenadante colhido. ELUA a proteína RBD com tampão contendo 250 milimolares de OLE. Em seguida, usando tubos Emon Ultra 15, concentre a proteína purificada contendo OLE por centrifugação a 3000 RPM a quatro graus Celsius por cerca de 15 minutos. Descarte o fluxo passante.

Adicione PBS aos tubos de concentração de RBD e centrifugue novamente a 3000 RPM a quatro graus Celsius por 20 minutos. Repita a lavagem duas vezes. Para garantir a remoção completa do ole, a proteína purificada será agora dissolvida em PBS; pipete a proteína para um tubo EOR limpo de 1,5 mililitro.

Por fim, calcule a concentração da proteína purificada utilizando um NanoDrop com PBS como branco e armazene a amostra a menos 80 graus Celsius. Primeiro, adicione um mililitro de PBS estéril a um frasco do sistema adjuvante Sigma. Pré-aqueça em banho-maria a 40 a 45 graus Celsius e vortexe o frasco completamente por dois a três minutos.

Em seguida, prepare a emulsão de adjuvante proteico em um tubo einor de 1,5 mililitro. Misture a quantidade desejada da proteína purificada descongelada diluída em PBS com um volume igual do sistema adjuvante e agite vigorosamente em vórtex por dois a três minutos. Além disso, prepare emulsões controle misturando o adjuvante com PBS apenas. Subcutaneamente.

Injete pelo menos cinco camundongos BC com quatro a seis semanas de idade com 200 microlitros de cada mistura de imunização inicial contendo 20 microgramas de proteína por dose ou com a emulsão controle 21 dias após a inoculação inicial por via subcutânea. Administre doses de reforço contendo 10 microgramas de proteína em um volume final de 200 microlitros cada. Colete amostras de sangue de cada camundongo antes da imunização inicial e 10 dias após cada vacinação e armazene o soro isolado a menos 20 graus Celsius após a inativação pelo calor.

Inativação do complemento a 56 graus Celsius por 30 minutos, 16 horas antes da transfeção, plaque células 293T em placas de cultura de tecidos de 100 milímetros com uma densidade de 2 milhões de células por placa. Prepare o reagente de transfeção conforme descrito anteriormente e realize a cotransfeção das células com um plasmídeo que codifica a proteína S do SARS-CoV e outro que codifica o genoma do HIV-1 com defeito no ENV e que expressa luciferase. Oito a 10 horas após a transfeção.

Troque o meio por 10 mililitros de meio DMEM fresco contendo 10% de soro e, em seguida, retorne as células ao incubador. Dois dias depois, colete o sobrenadante contendo o pseudovírus SARS. Passe o sobrenadante por um filtro de seringa de 0,45 mícron para remover debris celular e alíquotas do vírus.

Use imediatamente ou congele a menos 80 graus Celsius para uso futuro utilizando uma placa de pipetagem multicanal. Células 293T expressando o receptor ACE2 do SARS-CoV em placa de cultura de tecidos de 96 poços, numa concentração de 10.000 células por cem microlitros por poço, e incube as células a 37 graus Celsius por 16 horas. Utilize uma placa de 96 poços separada para titular o vírus pseudotipado recombinante que expressa luciferase e determine a concentração apropriada do vírus para o ensaio de neutralização nas fileiras A e B da primeira placa.

150 microlitros por poço de DMEM com 10% de FBS. Em seguida, adicione 150 microlitros de vírus não diluído às linhas A1 e B1 e realize uma diluição seriada dupla de duas vezes, transferindo 150 microlitros dos poços da linha 1 para os poços da linha seguinte, e assim por diante até a linha 11. Descarte os últimos 150 microlitros e não adicione vírus à linha 12.

Após a realização da diluição seriada e a incubação das células ACE 2 93 T por 16 horas, infecte as células transferindo 100 microlitros de cada poço da placa de vírus para o poço correspondente da placa contendo as células. Incube as células por dois dias a 37 graus Celsius para permitir que os vírus as infectem. Determine o nível de infecção em cada poço lendo a placa em um luminômetro ultra 3 84.

A quantidade de infecção é proporcional à intensidade da atividade de luciferase. A concentração viral na qual a unidade relativa de luciferase é cerca de mil vezes maior do que a unidade relativa de luciferase de fundo das células isoladas na coluna 12 será utilizada no ensaio de neutralização. Monte a neutralização primeiro em uma placa separada de 96 poços, utilizando uma pipeta multicanal, adicionando 150 microlitros de D-M-E-M com 10% de F-B-S a cada poço da coluna um e 120 microlitros aos poços das demais colunas.

Em seguida, adicione três microlitros de cada soro de camundongo a ser testado em poços duplicados da coluna um. Neste exemplo, os dois primeiros poços contêm soro diluído em 50 vezes de um camundongo imunizado com RBD. Os dois seguintes contêm soro de um segundo camundongo imunizado com RBD e os últimos quatro poços contêm soro de dois animais controle imunizados com PBS. Usando uma pipeta multicanal, realize uma diluição serial de cinco vezes do soro transferindo 30 microlitros de todos os poços da primeira coluna para os poços da segunda coluna, e repita esse procedimento até a coluna 11.

Descarte os 30 microlitros restantes e deixe as cavidades na coluna 12 sem soro. Em seguida, adicione 120 microlitros por poço de um pseudovírus SAR diluído a cada uma. Incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora para permitir que quaisquer anticorpos anti-RBD no soro de camundongo se liguem e neutralizem o pseudovírus SARS.

Após essa incubação, transfira 100 microlitros do vírus neutralizado de cada poço para os poços correspondentes da placa de 96 poços contendo células 293T que expressam ACE2. Incube as células a 37 graus Celsius por 24 horas para permitir a infecção. Uma vez que as células tenham sido infectadas, remova o meio utilizando uma pipeta multicanal e substitua por 100 microlitros por poço de meio fresco.

Retorne a placa ao incubador após 72 horas a 37 graus Celsius. Mais uma vez, remova o sobrenadante. Neste ponto, qualquer pseudovírus que não tenha sido neutralizado pelo soro de camundongo deveria ter sido capaz de infectar as células utilizando uma pipeta multicanal. Adicione 60 microlitros por poço de um reagente de lise de cultura celular luciferase.

Coloque a placa em um agitador à temperatura ambiente e deixe as células lisarem por uma a duas horas. Após as células terem sido lisadas, transfira 50 microlitros dos lisados celulares para uma placa de luminômetro de 96 poços e adicione 50 microlitros por poço de substrato de luciferase. Utilize um luminômetro Ultra 3 84 configurado para leitura de luminiscência em placas de 96 poços para ler a placa e avaliar a atividade relativa de luciferase nos diferentes poços, a partir da qual pode-se derivar a porcentagem de vírus neutralizado.

Esses dados mostram que a porcentagem de neutralização do vírus alcançada é proporcional à concentração de soro de camundongos imunizados com RBD. Em contraste, o soro de animais injetados com PBS não consegue neutralizar o vírus em nenhuma concentração, conforme esses dados. O NT 50 ou título sérico no qual 50% do vírus é neutralizado pode ser facilmente determinado.

Ao tentar realizar este procedimento, é importante lembrar que a confiança e a paciência são essenciais para o sucesso dos experimentos. Após assistir a esses vídeos, você deverá ter uma compreensão melhor de como expressar vacinas recombinantes contra a SARS em linhagens celulares de mamífero e de como determinar a capacidade de induzir uma resposta de anticorpos neutralizantes em modelos murinos.