Name: Protocolo para vacinas recombinantes RBD baseado SARS: Preparação de proteínas, Vacinação Animal e Detecção de Neutralização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Aprenda a preparar vacinas recombinantes RBD contra SARS, imunizar camundongos e avaliar anticorpos neutralizantes usando ensaio de pseudovírus. Este protocolo demonstra expressão proteica em células 293T e análise de imunogenicidade.

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Este estudo foi financiado pelo National Institutes of Health (NIH) dos Estados Unidos (RO1 AI68002).

1. Recombinante SARS-CoV Preparação Protein RBD <ol><li> Prepare cálcio reagentes de transfecção de fosfato <ol><li> 2X tampão HBS preparação: Misture 16 g de NaCl, 0,4 g de Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, e 13,0 g de HEPES. Ajustar o pH a 7,00 e educação de volume total para 1000 mL em água destilada. Depois de filtrar a solução para alíquota de esterilização, e armazená-lo a -20 ° C. Dica: Qualquer variação do valor de pH afetaria os resultados transfecção. Assim, é aconselhável testar vários valores de pH em torno de 7,00 (por exemplo, 6,99, 7,00, ou 7,01) e encontrar o melhor para a transfecção usando o método introduzido abaixo. </li><li> 2,5 M CaCl 2 preparação: Adicionar 73,5 g de CaCl 2 * 2H 2 O em água destilada em um volume final de 200 mL. Filtrar a solução e armazenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> Transfecção do plasmídeo recombinante e proteína de purificação <ol><li> Dividir células 293T em 50-70% 24 h antes de confluência de transfecção. Cultivar células em T-175 cm 2 frascos de cultura de tecidos em 40 mL DMEM contendo 10% inativado pelo calor (HI) FBS e 1% Penicilina / Estreptomicina (P / S) a 37 ° C em 5% CO 2. </li><li> Todos os reagentes de transfecção deve ser trazido à temperatura ambiente antes de transfecção. Estes reagentes incluem 2X HBS, 2.5M CaCl 2, Dih 2 O, e rRBD 6 plasmídeo. Dica: O plasmídeo recombinante final de construção usado para a expressão da proteína deve conter um peptídeo sinal para garantir a secreção de proteínas recombinantes expressas para o sobrenadante da cultura. A tag Sua 6x pode ser adicionado ao C-terminal da proteína expressa para a purificação fácil. </li><li> Prepare uma mL 50 (A) e um 15 mL (B) BD tubo Falcon, e adicionar os reagentes aos tubos, como indicado na Tabela 1. Adicionar 2X tampão HBS para A. tubo no tubo B, adicionar 2,5 milhões de CaCl 2 e rRBD plasmídeo, e levar o volume para a exigência da Dih 2 O. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> A. Um T-175 cm 2 frasco de cultura de tecidos (4000 mL / frasco): preparar para a expressão rRBD </td></tr><tr><td colspan="2"> Um tubo </td><td colspan="2"> Tubo B </td></tr><tr><td> 2X HBS </td><td> 2000 mL </td><td> 2.5M CaCl 2 </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td></td><td></td><td> DNA plasmídeo rRBD </td><td> 40 mcg </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Dih 2 O para </td><td> 2000 mL </td></tr><tr><td colspan="4"> B. Um de 100 mm placa de Petri (1000 mL / prato): preparar-se para SARS produção pseudovirus </td></tr><tr><td colspan="2"> Um tubo </td><td colspan="2"> Tubo B </td></tr><tr><td> 2X HBS </td><td> 500 mL </td><td> 2.5M CaCl 2 </td><td> 50 mL </td></tr><tr><td></td><td></td><td> DNA plasmídeo SARS-CoV S </td><td> 5 mg </td></tr><tr><td></td><td></td><td> HIV-1 plasmídeo (pNL4-3.luc.RE) </td><td> 5 mg </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Dih 2 O para </td><td> 500 mL </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Preparação da mistura Transfection e volumes Os volumes listados na Tabela 1 são para uma unidade de transfecção. Se frascos mais ou pratos são utilizados para a transfecção, ajustar volumes em conformidade. </li><li> Adicionar a solução de DNA de cálcio no tubo B no tubo A de uma forma gota a gota, mantendo constante e suave a mistura em um vórtice. Deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 20-30 min. A chave para o sucesso de transfecção de fosfato de cálcio depende do tamanho e forma do precipitado formado. Assim, a mistura deve ser constantemente agitadas e, lentamente, para cumprir este requisito e, como conseqüência, melhorar a eficácia de transfecção. </li><li> Adicione a mistura de uma forma gotas e até mesmo em células 293T (4000 mL / frasco). Células de cultura em estufa a 37 ° C em 5% CO 2. </li><li> Substituir o meio de cultura com novas OPTI-MEM eu sem soro Médio Reduzido-Serum (50 mL / frasco) 8-10 h pós-transfecção. Continuar a células de cultura por mais dois dias na mesma condição. </li><li> Recolher o sobrenadante contendo proteínas expressas rRBD 72 h pós-transfecção. Centrifugar a 6000 rpm por 15 min para remover restos celulares. Adicionar coquetel inibidor de protease para o sobrenadante coletado e armazenar a 4 ° C durante a noite. </li><li> No dia seguinte, purificar proteínas recombinantes rRBD do sobrenadante da cultura através de instruções de Ni-NTA fabricante Superflow seguinte. </li><li> Concentre-se proteína purificada usando Amicon Ultra tubos concentração -15. Após a concentração de proteína,PBS adicionar aos tubos de concentração e centrifugar novamente para remover imidazol em tampão de eluição. Calcular a concentração de proteína e armazenar proteína purificada a -80 ° C até o uso. </li></ol></li></ol> 2. Imunização mouse e Coleta de Amostra <ol><li> Pré-aquecer Sigma sistema adjuvante (SAS) para 40-45 ° C de acordo com instruções do fabricante. Adicionar 1 mL de PBS por frasco e misturar bem. </li><li> Prepare a proteína adjuvante emulsão de acordo com o protocolo na Tabela 2. Pipeta calculada proteína rRBD em um tubo de 1,5 mL. Adicionar igual volume de adjuvante SAS para o tubo e vortex vigorosamente por 2-3 min para formar emulsão. Dica: Os volumes listados na Tabela 2 são para um mouse. Ajustar volumes de acordo com os números do mouse real usado. Para cada grupo, misture as proteínas e adjuvante necessários para cada vacina. Sempre preparar uma amostra suplementar para a vacinação para garantir a precisão. <table border="1"><tbody><tr><td> Grupo </td><td> 1 ª vacina (200 mL / rato) </td><td> 2 ª vacina (200 mL / rato) </td><td> 3 ª vacina (200 mL / rato) </td></tr><tr><td> proteína rRBD </td><td> 20 g de proteína em PBS (100 mL) + 100 mL SAS </td><td> 10 g de proteína em PBS (100 L) + 100 mL SAS </td><td> 10 g de proteína em PBS (100 L) + 100 mL SAS </td></tr><tr><td> PBS controle </td><td> 100 mL PBS + 100 mL SAS </td><td> 100 mL PBS + 100 mL SAS </td><td> 100 mL PBS + 100 mL SAS </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Protocolo de imunização do rato </li><li> Por via subcutânea prime-imunizar fêmeas BALB / c (4-6 semanas de idade, cinco ratos / grupo), e aumentar duas vezes com rRBD e SAS, conforme indicado na Tabela 2. Use PBS grupo como o controle. O site para injeções subcutâneas geralmente escolhido é a pele solta entre as omoplatas. Alternativamente, o abdômen ventral é comumente usado, porque é mais fácil para injetar, e pode observar qualquer vazamento dos locais de injeção. Quando repetidas doses de vacinas são usadas, é fácil selecionar os locais de injeção diferentes, prevenindo potenciais reacções cutâneas locais. </li><li> Sangrar camundongos via retro-orbital com anestésico antes da imunização e 10 dias após cada vacinação, soros e calor a 56 ° C por 30 min para a inativação do complemento. Loja do mouse soros a -20 ° C até o uso. </li></ol> 3. Detecção de neutralização usando ensaio de neutralização Pseudovirus <ol><li> Prepare pseudovirus SARS <ol><li> Dividir células 293T em 100 milímetros de tecido placas de cultura de petri (2x10 6 células / prato) 16 h antes da transfecção, as células crescem e como acima. </li><li> Preparar reagentes de transfecção, conforme indicado na Tabela 1. Proteína co-transfecção um plasmídeo SARS-CoV S e um plasmídeo Env-defeituoso, luciferase expressando o genoma do HIV-1 (pNL4-3.luc.RE), utilizando reagentes de transfecção de cálcio fosfato. </li><li> Substituir médio com 10 mL fresco DMEM contendo 10% FBS e 1% P / S 10/08 h pós-transfecção. Recolher o sobrenadante contendo SARS pseudovirus 72 h pós-transfecção. </li><li> Pseudovirus filtro através de um filtro mM 0,45. Alíquotas e armazenar a -80 ° C até o uso. </li></ol></li><li> SARS ensaio de neutralização pseudovirus <ol><li> Dividir células 293T expressar SARS-CoV receptor ECA2 (ACE2/293T) a 10 4 cells/100 mL / poço em placas de 96 poços de cultura de tecido 16 h antes da infecção. </li><li> Diluir pseudovirus SARS por 2 vezes para detectar o título do vírus nas células ACE2/293T. </li><li> Serialmente diluída em soro de rato placas de 96 poços de cultura de tecidos, e adicionar igual volume de titulado pseudovirus SARS. Pré-incubação das placas a 37 ° C por 1 h. </li><li> Após a incubação, adicionar 100 mL da mistura de soros para as células-pseudovirus ACE2/293T, e continuam a crescer as células a 37 ° C em 5% CO 2. Adicionar nova DMEM 24 h mais tarde. </li><li> Remover completamente o sobrenadante da cultura de placas de 72 h pós-infecção. Adicionar 1X luciferase reagente de lise celular cultura (60 mL / poço), e promover a lise celular com constante agitação de placas por 1-2 h à temperatura ambiente. </li><li> Transferência de lisados ​​celulares (50 mL / poço) em placas luminômetro (Microfluor placas de 96 poços). Adicionar substrato luciferase (50 mL / poço), incluído no sistema de análise luciferase, e detectar a atividade luciferase relativa no luminômetro 384 Ultra. </li><li> Calcule SARS título de neutralização pseudovirus e presente como título de anticorpos neutralizantes 50% (NT 50) 6. </li></ol></li></ol>

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<li>Jiang, M., Deng, L., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Ca%282%2B%29-phosphate+transfection+efficiency+enables+single+neuron+gene+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">High Ca(2+)-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis.</a> Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).</li>
<li>Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+safe+neutralization+assay+for+SARS-CoV+and+characterization+of+S-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein.</a> Virology. 326, 140-149 (2004).</li>
<li>Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Densidade celular é um fator importante que afeta a eficácia de transfecção de cálcio à base de fosfato. Em nossa experiência, menos de 70% confluência das células traz os melhores resultados. Assim, a fim de melhorar a eficiência de transfecção, recomenda-se que a densidade de células ser mantidos a cerca de 50-70% de confluência. O cálcio método de transfecção de fosfato é geralmente pensado para ser menos eficiente em comparação com os métodos de transfecção outras, tais como a transfecção lipídica 16. No entanto, neste protocolo, foi utilizado um método modificado de cálcio fosfato de transfecção em que constante e lenta mistura da solução de transfecção em um vórtice garante a formação de um precipitado com o tamanho apropriado ea forma, melhorando assim a eficiência de transfecção.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;*7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2429</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;*2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12430</td><td></td></tr><tr><td>FBS HI</td><td>Invitrogen</td><td>10438</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Meio OPTI-MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de inibidores de protease</td><td>Roche Group</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30450</td><td></td></tr><tr><td>Sistema adjuvante Sigma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6322</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de ensaio de luciferase</td><td>Promega Corp.</td><td>E1501</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de lise de cultura celular para luciferase (5X)</td><td>Promega Corp.</td><td>E1531</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra - 15</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Placas Microfluor de 96 poços</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>7905</td><td></td></tr><tr><td>Luminômetro Ultra 384</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo para vacinas recombinantes rbd baseado sars: preparação de proteínas, vacinação animal e detecção de neutralização

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Com base em seu perfil de segurança e capacidade de induzir potentes respostas imunes contra as infecções, as vacinas de subunidades têm sido usados ​​como candidatos para uma ampla variedade de patógenos 1-3. Desde que o sistema de células de mamíferos é capaz de modificação pós-traducional, formando proteínas adequadamente dobradas e glicosilada, proteínas recombinantes expressas em células de mamíferos têm demonstrado o maior potencial para manter elevada antigenicidade e imunogenicidade 4-6. Embora nenhum novo caso de SARS têm sido relatados desde 2004, futuros surtos são uma ameaça constante e, portanto, o desenvolvimento de vacinas contra a SARS-CoV é um passo prudente preventiva e deve ser realizada. O RBD de proteína SARS-CoV S desempenha um papel importante na ligação do receptor e indução de anticorpos neutralizantes específicos contra a infecção pelo vírus 7-9. Portanto, neste protocolo, descrevemos novos métodos para o desenvolvimento de uma vacina de subunidade RBD baseada contra SARS. Resumidamente, a proteína recombinante RBD (rRBD) foi expressa em sobrenadante de cultura de células de mamíferos 293T para obter uma proteína dobrado corretamente com conformação adequada e elevada imunogenicidade 6. A transfecção do plasmídeo recombinante codificação RBD às células foi então realizada usando um método de transfecção de fosfato de cálcio 6,10 com algumas modificações. Comparado com o método de transfecção lipídica 11,12, este método modificado de cálcio fosfato de transfecção é mais barato, mais fácil de manusear, e tem o potencial para alcançar alta eficácia, uma vez um complexo de transfecção com o tamanho e forma adequadas é formado 13,14. Finalmente, um ensaio de neutralização pseudovirus SARS foi introduzida no protocolo e usado para detectar a atividade neutralizante de soros de camundongos vacinados com a proteína rRBD. Este ensaio é relativamente seguro, não envolve um infecciosas SARS-CoV, e pode ser realizada sem a exigência de um laboratório de biossegurança-3 15. O protocolo aqui descrito também pode ser usado para desenhar e estudar vacinas subunidade recombinante contra outros vírus com proteínas de classe I de fusão, por exemplo, HIV, vírus sincicial respiratório (VSR), o vírus Ebola, o vírus influenza, bem como Nipah e Handra. Além disso, os métodos para gerar um pseudovirus e, posteriormente, estabelecer um ensaio de neutralização pseudovirus pode ser aplicada a todos estes vírus.

Este protocolo descreve um procedimento geral para o estudo de ligação aos receptores recombinantes de domínio (RBD) com base em vacinas de subunidade contra a SARS. Ele inclui métodos para transfecção e expressão da proteína em células RBD 293T, a imunização de camundongos com RBD e detecção de atividade de neutralização dos soros do mouse usando um ensaio de neutralização estabelecida SARS pseudovirus.

Protocolo para vacinas recombinantes RBD baseado SARS: Preparação de proteínas, Vacinação Animal e Detecção de Neutralização

Com base no seu perfil de segurança e na capacidade de induzir respostas imunitárias potentes contra infeções, as vacinas de subunidades têm sido utilizadas como candidatas para uma ampla ...

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Chinês
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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O sistema de genética reversa para o vírus da febre Rift Vale cepa vacinal MP-12 é uma ferramenta útil para a criação de adicionais MP-12 mutantes com atenuação aumentada e imunogenicidade. Nós descrevemos o protocolo para gerar e caracterizar NSS cepas mutantes.

Usando genética reversa para manipular o NSS Gene do vírus da febre Rift Valley MP-12 Strain para melhorar a segurança e eficácia da vacina

O vírus da doença de Newcastle (NDV) tem sido extensivamente estudada nos últimos anos de forma a desenvolver novos vectores para a vacinação e a terapia, entre outros. Estes estudos têm sido possível devido às técnicas para resgatar vírus recombinante a partir do cDNA, tais como aqueles aqui descrita.

Resgate de Vírus da Doença de Newcastle recombinante de cDNA

Este estudo descreve um alto throughput, com base em imagens de ensaio de microneutralização para determinar o título de anticorpos neutralizantes específicos para o vírus sincicial respiratório (VSR). Este formato de ensaio foi testado em tipos diferentes de amostra.

Um ensaio de Microneutralização do vírus sincicial respiratório (VSR) melhorada e alta taxa de transferência

Nós descrevemos um método para gerar e amplificar geneticamente modificado vírus sincicial respiratórios (RSVs) e um ensaio de placa otimizado para RSVs. Ilustramos este protocolo criando dois vírus recombinantes que respectivamente permitem quantificação de replicação RSV e análise de corpos de inclusão RSV e grânulos associada a corpos de inclusão dinâmica de viver.

Geração, amplificação e titulação do vírus sincicial respiratórios recombinantes

Aqui descrevemos uma imunocaptura indireta do sanduíche ELISA para determinar o conteúdo de glicoproteína imunogênica em vacinas antirrábicas. Este teste usa um anticorpo monoclonal neutralizante (mAb-D1) reconhecendo aparadores de glicoproteína. É uma alternativa ao teste in vivo NIH para acompanhar a consistência da potência vacinal durante a produção.

Teste in vitro ELISA para avaliar a potência da vacina antirrábica

Um método detalhado é fornecido aqui descrevendo a purificação, o redobramento, e a caracterização de nanopartículas de proteína Self-montagem (SAPNs) para o uso no desenvolvimento da vacina.

Produção de E. coli-expressa auto-montagem de nanopartículas de proteína para vacinas que requerem Trimeric epitope apresentação

A geração de rotavírus recombinantes a partir do DNA plasmático fornece uma ferramenta essencial para o estudo da replicação de rotavírus e patogênese, e o desenvolvimento de vetores e vacinas de expressão rotavírus. Aqui, descrevemos uma abordagem genética reversa simplificada para a geração de rotavírus recombinantes, incluindo cepas expressando proteínas fluorescentes de repórteres.

Método de genética reversa simplificado para recuperar rotavírus recombinantes expressando proteínas de repórter

O presente protocolo descreve a bioengenharia de vesículas de membrana externa como uma plataforma de vacina "Plug-and-Display", incluindo produção, purificação, bioconjugação e caracterização.

Uma plataforma de vacina de nanopartículas "plug-and-display" baseada em vesículas de membrana externa exibindo o domínio de ligação ao receptor SARS-CoV-2

A metodologia descreve a geração de células dendríticas derivadas de monócitos bovinos (MoDCs) e sua aplicação na avaliação in vitro de candidatos antigênicos durante o desenvolvimento de potenciais vacinas veterinárias em bovinos.

Determinação da imunogenicidade vacinal utilizando células dendríticas derivadas de monócitos bovinos

Vírus pseudotipados (PVs) são virions defeituosos de replicação que são usados para estudar interações vírus-hospedeiro em condições mais seguras do que manusear vírus autênticos. Apresentado aqui é um protocolo detalhado que mostra como os PVs SARS-CoV-2 podem ser usados para testar a capacidade de neutralização do soro dos pacientes após a vacinação COVID-19.

Vírus pseudotipados como uma ferramenta molecular para monitorar respostas imunes humorais contra SARS-CoV-2 via ensaio de neutralização

Aprenda a preparar vacinas recombinantes RBD contra SARS, imunizar camundongos e avaliar anticorpos neutralizantes usando ensaio de pseudovírus. Este protocolo demonstra expressão proteica em células 293T e análise de imunogenicidade.

Protocolo para vacinas recombinantes RBD baseado SARS: Preparação de proteínas, Vacinação Animal e Detecção de Neutralização

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