Name: Combinando corante lipofílico, In situ Hibridação, imunohistoquímica e histologia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Aprenda a combinar corante lipofílico, hibridização in situ, imunohistoquímica e histologia em tecido de camundongo. Este método maximiza a coleta de dados de um único espécime, correlacionando mutações genéticas com perfis morfológicos e de expressão.

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Confocal imagens foram obtidas na Universidade de Iowa Carver Center for Imaging. O financiamento foi fornecido por uma concessão SBIR (MH079805) para BF apoio adicional para a reprodução dos ratos para este projeto foi fornecido pelo NIDCD (5R01DC00559007) para BF

<ol><li>Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+three-color+neuronal+tracing+in+fixed+tissue+using+NeuroVue+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes.</a> Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).</li>
<li>Tonniges, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-+and+bio-physical+characterization+of+novel+violet+and+near-infrared+lipophilic+fluorophores+for+neuronal+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Photo- and bio-physical characterization of novel violet and near-infrared lipophilic fluorophores for neuronal tracing.</a> Journal of Microscopy. , (2010).</li>
<li>Bartheld, C. S. von, Cunningham, D. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+tracing+with+DiI%3A+decalcification%2C+cryosectioning%2C+and+photoconversion+for+light+and+electron+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis.</a> J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).</li>
<li>Gurung, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+embryonic+midbrain+thalamic+and+thalamic+auditory+connection+development+in+mice+as+revealed+by+carbocyannine+dye+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Time course of embryonic midbrain thalamic and thalamic auditory connection development in mice as revealed by carbocyannine dye injection.</a> J Comp Neurol. 479, 309-327 (2004).</li>
<li>Fritzsch, B., Nichols, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI+reveals+a+prenatal+arrival+of+efferents+at+the+differentiating+otocyst+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">DiI reveals a prenatal arrival of efferents at the differentiating otocyst of mice.</a> Hear Res. 65, 51-60 (1993).</li>
<li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurod1+suppresses+hair+cell+differentiation+in+ear+ganglia+and+regulates+hair+cell+subtype+development+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neurod1 suppresses hair cell differentiation in ear ganglia and regulates hair cell subtype development in the cochlea.</a> PloS ONE. 5, e11661-e11661 (2010).</li>
</ol>

Tecidos de camundongos foram coletados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Universidade de Iowa Animal Care Institucional e Comitê de Uso (ACURF 0.804.066).

Neste vídeo, demonstramos um método para combinar quatro técnicas a fim de maximizar a coleta de dados e de coesão, correlacionando os dados dentro de um determinado animal (figura 3). Esta abordagem irá reduzir a quantidade de cruzamentos e, assim, tempo necessário para obter dados publicáveis, melhorando a informação sobre co-localização e efeitos correlatos de mutantes. Embora os ratos embrionárias foram utilizados neste vídeo mouse, adulto, bem como outros animais, como frango, Xenopus e peixe-zebra podem ser analisados ​​usando essas técnicas também. Quando se utiliza outras espécies proteinase k digestão pode precisar de ser alterada. Aqui usamos diferentes corantes fluorescentes NeuroVue especificamente rótulo até três populações neuronais de interesse. O benefício desses corantes é que eles podem ser usados ​​em camundongos mutantes, que pode ser problemático quando depender exclusivamente de imuno-histoquímica que pode ou não ser afetadas por mutações para ser analisado, e eles rótulo neurônios retrogradamente e anterógrada 5. Um estudo recente também aumentou o número de populações de neurônios que podem ser em simultâneo a seis 2. Depois, o corante lipofílico traçando o mesmo tecido de interesse podem ser analisados ​​utilizando hibridização in situ, para a análise da transcrição de genes e podem ser posteriormente analisados ​​por meio de imunohistoquímica para a distribuição de proteínas. A última análise pode ser complementada pela análise histológica detalhada que pode acrescentar à caracterização fenotípica 6. Esta análise multifatorial tem o potencial para ganhar novos conhecimentos através da análise correlativa dentro do mesmo animal que de outra forma ser improvável ou, pelo menos, na necessidade de protocolos mais extensa e reprodução do mouse.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; Hibridização:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de tampão de lavagem e bloqueio PC DIG</td><td>Grupo Roche</td><td>1585762</td><td></td></tr><tr><td>Tampão SSC 20x pré-misturado</td><td>Grupo Roche</td><td>1666681</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K 20 mg/ml</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>Pirocarbonato de dietila (DEPC) </td><td>Research Products International Corp.</td><td>D43060</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Dextrana Sulfato</td><td>Research Products International Corp.</td><td>D20020</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple </td><td>Grupo Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Fragmentos Fab anti-Dig-AP</td><td>Grupo Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Enzima RNase A 10 mg/ml</td><td>Fermentas</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Research Products International Corp.</td><td>7003</td><td></td></tr><tr><td>DNA de esperma de salmão 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Filtragem Stericup 0,22&amp;mu;m; 500 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Discos de Filtro 0,2&amp;mu;m; 25 mm</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>Pacotes de solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Imuno-histoquímica:&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;corante chst</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>9460</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Histologia:&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de Meios de Inclusão Poly/Bed 812/DMP-30 </td><td>Polysciences, Inc.</td><td>08792-1</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de propileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110205</td><td></td></tr><tr><td>Solução de glutaraldeído 50%</td><td>Fisher Scientific</td><td>G151</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Montagem DPX</td><td>Fluka</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>Agitador</td><td>MidSci</td><td>55D1114</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de aquecimento</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-715-125D</td><td></td></tr><tr><td>Rotador</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora ajustada a 60&amp;#x00B0;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Rastreamento com corante&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtesouras</td><td>Geuder</td><td>G-19775</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Fina</td><td>E.M.S</td><td>72680-F</td><td></td></tr><tr><td>Corante NeuroVue: Marrom, Vermelho, Jato</td><td>MTTI</td><td>FS-100(1,2,6)</td><td></td></tr><tr><td>1X solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>Escopo da dissecação</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora ajustada a 36&amp;#x00B0;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-506DQ</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Leica Microsystems</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas</td><td>Surgipath</td><td>00240</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura</td><td>Surgipath</td><td>00106</td><td></td></tr><tr><td>RPI</td><td>Glicerol</td><td>G22025-0,5</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (4% e 0,4%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td></td></tr></tbody></table>

combinando corante lipofílico, in situ hibridação, imunohistoquímica e histologia

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Indo além da função de um único gene para cortar mais fundo em redes gene regulador exige múltiplas mutações combinadas em um único animal. Tal análise de dois ou mais genes precisa ser complementada com a hibridização in situ de outros genes, ou imuno-histoquímica das suas proteínas, tanto em tudo montado órgãos em desenvolvimento ou seções para a resolução detalhada das alterações expressão celular e tecidual. Combinando alterações genéticas múltiplas requer o uso de CRE ou flipase para condicionalmente excluir genes e evitar a letalidade embrionária. Sistemas de criação necessária aumentar dramaticamente esforço e custo proporcional ao número de genes mutados, com um resultado de muito poucos animais com o repertório cheio de modificações genéticas desejadas. Amortizando a grande quantidade de esforço e tempo para obter esses poucos espécimes preciosos que são portadores de mutações múltiplas requer otimização de tecido. Além disso, investigar um único animal com várias técnicas faz com que seja mais fácil para correlacionar defeitos deleção do gene com perfis de expressão. Nós desenvolvemos uma técnica para obter uma análise mais aprofundada de um determinado animal, com a capacidade de analisar diversas estruturas histologicamente reconhecível, bem como a expressão do gene e proteína todos da mesma amostra em ambos os órgãos tudo montado e seções. Embora os ratos têm sido utilizados para demonstrar a eficácia desta técnica pode ser aplicada a uma grande variedade de animais. Para fazer isso nós combinamos corante lipofílico rastreamento, montar toda a hibridização in situ, imunohistoquímica e histologia para extrair a quantidade máxima possível de dados.

A combinação de diferentes técnicas para maximizar a coleta de dados a partir de tecido do mouse é apresentado.

Combinando corante lipofílico, In situ Hibridação, imunohistoquímica e histologia

Para ir além da função de um único gene e aprofundar-se nas redes de regulação gênica, são necessárias múltiplas mutações combinadas em um único animal. Tal análise de...

Ir além da função de um único gene e analisar redes regulatórias gênicas exige múltiplas mutações em um único animal. Neste sistema, otimizamos a quantidade de dados gerados a partir de um único tecido para correlacionar mutações genéticas com perfis morfológicos e de expressão. Isso é alcançado primeiramente injetando um corante lipofílico para visualizar diversas populações neuronais discretas.A hibridização in situ dupla é realizada para visualizar o padrão espacial e temporal de transcritos gênicos. Enquanto a imuno-histoquímica reflete padrões específicos de expressão proteica, a dimensão adicional do corte histológico contribui para a caracterização do fenótipo. Em conjunto, este sistema experimental permite analisar diversas estruturas histologicamente reconhecíveis, bem como a expressão gênica e proteica, tudo a partir da mesma amostra, tanto em preparações montadas inteiras quanto em cortes. Apresentamos um sistema que combina o rastreamento com corante lipofílico e a hibridização C dupla, imuno-histoquímica e histologia.Essa técnica maximiza a informação obtida a partir de um único espécime, correlacionando a morfologia com a expressão gênica e proteica. Para todas as dissecações e manipulações de tecidos, fixe os animais em paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1 molar por perfusão transcardial utilizando bombas peristálticas com agulhas de tamanho apropriado. Como os DY são fotossensíveis, armazene-os em um compartimento fechado e escuro e, para evitar contaminação cruzada, designe um conjunto separado de instrumentos para manipular cada corante sob microscópio estereoscópico.Determine um local de aplicação do corante para rotular seletivamente a população neuronal em consideração e não outras estruturas extrínsecas. Remova tecidos extrínsecos para confirmar visualmente o local escolhido e o acesso para a colocação do corante. Agora, corte as tiras pré-carregadas de filtro de corante neuro view em pedaços triangularmente adequados usando tesoura microcirúrgica.Certifique-se de cortar o menor pedaço possível para evitar a marcação de outras estruturas durante a inserção em tecidos moles, como o cérebro diretamente. Insira o filtro utilizando um dos vértices do triângulo do filtro para perfurar o tecido. Para tecidos mais rígidos, faça uma incisão para permitir a inserção mais fácil do D. Não utilize uma agulha de dissecação para empurrar o filtro para dentro do tecido.Coloque os espécimes em um frasco fechado hermeticamente com paraformaldeído 4% e incube a 36 graus Celsius no escuro por dois a 14 dias, dependendo da idade e da distância de difusão a ser percorrida. Utilizando um microscópio estereoscópico com fluorescência epiluminiscente, verifique se o corante difundiu até a localização desejada e dissecque o tecido de interesse. Fixe o espécime em uma lâmina com glicerol para imageamento em um microscópio confocal.Após a aquisição de imagens de olhos lipofílicos no microscópio confocal, transfira as amostras para um tubo eppendorf de dois mililitros livre de RNAses, contendo PBS livre de RNAses, para remover sistematicamente o glicerol. Processe as amostras por desidratação e reidratação com uma série graduada de metanol a quatro graus Celsius. Inicie com uma incubação em metanol 100% por pelo menos uma hora e reduza progressivamente até 25% de metanol por 15 minutos.Lave três vezes em PBS 1x durante cinco minutos cada vez. Digerir o tecido com dois microlitros de proteinase K estoque a 20 miligramas por mililitro em dois mililitros de PBS fresco. Monitorar a reação de digestão pela mudança na opacidade do tecido, de opaco para quase transparente.Para interromper a digestão enzimática, incube as amostras em paraformaldeído 4% por cinco minutos. Em seguida, lave com PBS uma vez por um minuto, seguido por três lavagens de cinco minutos cada. Descarte a lavagem final com PBS prestando especial atenção para eliminar o máximo possível, como um passo pré-hibridização.Incube as amostras em 1,8 mililitros de hibridização. Misture por uma hora a 60 graus Celsius em um inversor, desnature o DNA de esperma de salmão por incubação a 85 graus Celsius por 10 minutos e coloque no gelo, adicione 200 microlitros de DNA desnaturado de fita simples e aproximadamente 100 nanogramas de riba marcada com DIG. Adicione a sonda a cada amostra e hibridize durante a noite a 60 graus Celsius em uma estufa de hibridização.Processe as amostras com três lavagens de 10 minutos com SSC 2X a 60 graus Celsius no forno de hibridização. Importante: remova qualquer atividade de fosfatase alcalina endógena com uma lavagem com SSC 2X por 60 minutos a 70 graus Celsius em um bloco térmico ISO. Lave as amostras com PBS por cinco minutos.Agora substitua o PBS e adicione um microlitro de 10 miligramas por mililitro de RNAs A e incube por 60 minutos a 37 graus Celsius em um bloco térmico ISO temp. Descarte o PBS com RNAs A e lave três vezes com solução de lavagem, durante 10 minutos cada.Por fim, aqueça e ative qualquer RNA remanescente por meio de uma incubação de 60 minutos a 70 graus Celsius em um bloco térmico ISO. O passo final é visualizar a sonda de ribo. Incube as amostras em tampão bloqueador na concentração de uma vez por uma hora.Descarte o tampão de bloqueio e adicione dois mililitros de tampão de bloqueio contendo um microlitro de anticorpo anti-ditch a cada amostra. Incube durante a noite e lave várias vezes com tampão de lavagem uma vez, conforme indicado. Em seguida, incube as amostras em tampão de lavagem uma vez durante a noite.Lave as amostras com tampão de detecção 1 vez durante 10 minutos e transfira as amostras para uma placa de poços. Descarte o tampão e desenvolva a coloração com BM purple, pois o BM.Purple é sensível à luz. Cubra com papel alumínio ou uma caixa quando a intensidade de sinal desejada for obtida.Lave as amostras com detecção em tampão uma vez nos poços durante cinco minutos. Imagem as amostras com microscopia de transmissão ou armazene-as em paraformaldeído 4% a quatro graus Celsius. Remova corantes lipofílicos do tecido com uma série graduada de etanol, se necessário.Em seguida, reidrate o tecido adicionando PBS progressivamente ao longo de cinco a 10 minutos. Agora, bloqueie o tecido por uma hora em soro normal de cabra 2,5% e Triton X-100 0,5% à temperatura ambiente em agitador, incube com o anticorpo primário diluído na solução de bloqueio por 48 horas a quatro graus Celsius em agitador, lave três vezes com PBS por uma hora cada, bloqueie novamente as amostras e, em seguida, incube com o anticorpo secundário conjugado com fluoróforo diluído na solução de bloqueio por 12 a 24 horas a quatro graus Celsius em agitador. A partir deste momento, deve-se ter o cuidado de proteger as amostras da luz, pois os anticorpos secundários são sensíveis à luz.Novamente, lave as amostras três vezes com PBS, durante uma hora cada vez. Por fim, analise os espécimes por meio de imagem com microscopia epifluorescente e confocal. O encapsulamento em epóxi e o corte exigem a fixação do tecido em 2,5% de GLUTARALDEÍDO e 1% de PFA em tampão fosfato 0,1 molar, geralmente durante a noite em um frasco de amostra de vidro; desidrate o tecido com imersões em etanol em concentrações crescentes; agora, para a transição a solventes, faça uma imersão na proporção de um para um de etanol absoluto para óxido de propileno durante cinco minutos, seguida por cinco lavagens de dez minutos cada apenas em óxido de propileno; infiltre a amostra com resina por meio de uma simples imersão na proporção de um para um de óxido de propileno para resina durante a noite em agitador.Despeje a solução com a amostra em um molde de inclusão plano e deixe sobre a bancada por quatro a seis horas para evaporar o óxido de propileno. Transfira as amostras para resina a 100% por quatro horas no molde final. Inclua as amostras em resina e coloque uma etiqueta.Deixe a resina polimerizar incubando-a a 60 graus Celsius por 24 a 48 horas. Para minimizar a resina residual, esculpa o bloco de resina com uma lâmina de barbear conforme necessário. Em um ultramicrótomo.Corte seções seriadas de um a dois mícrons, monte e visualize as amostras utilizando microscopia de transmissão e microscopia fluorescente em epifluorescência. Diferentes corantes lipofílicos de comprimentos de onda distintos podem facilitar a visualização das projeções centrais de três nervos cranianos diferentes. Aqui, o corante lipofílico é colocado nas porções periféricas dos nervos trigêmeo, glossofaríngeo e vago.Após a incubação para difusão do corante, os processos centrais do nervo até o tronco encefálico são visualizados por microscopia de campo claro. Quando o cérebro posterior é dissecado e montado em lâmina plana, alguma marcação dos processos centrais dos três nervos marcados é claramente evidente. Na microscopia de campo claro, o microscópio confocal permite tridimensionalidade, onde áreas específicas são iluminadas, e o uso de três corantes diferentes permite a avaliação da distribuição de cada população.Em relação aos demais, aqui, os aferentes da orelha interna são rastreados em um camundongo recém-nascido por meio da neurovisão. Em vermelho na figura C, hibridização in situ para Prox1 e uma combinação de imunorreatividade para anti-tubulina e anti-Prox1 para visualizar os aferentes.Além disso, uma seção de resina epóxi com espessura de dois mícrons imagina o cóclea como uma ação de corte transversal. Ao tentar este procedimento, é importante escolher cuidadosamente o posicionamento do corante lipofílico. Um bom entendimento da neuroanatomia ajudará nesse processo; também seja cauteloso em todos os passos sensíveis à luz.Este procedimento reduzirá a quantidade de cruzamentos e o tempo necessário para obter dados publicáveis, ao mesmo tempo que melhora a informação sobre colocalização e efeitos colaterais em mutantes.

combining-lipophilic-dye-situ-hybridization-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Uma técnica que combina na coloração tetrâmero situ e hibridização in situ (ISTH) permite o mapeamento, visualização e análise da proximidade espacial de vírus específicos células CD8 + T ao seu infectados por vírus metas e determinação das relações quantitativas entre estes efetores imunes e metas aos resultados infecção.

Uma técnica para Simultaneamente Visualize-Virus específicos células T CD8 + e células infectadas por vírus In situ</em

Fonte: Jolly, S., et.al. Combinando hibridização de fluorescência dupla  in situ com imunomarcação para detecção da expressão de três genes em seções cerebrais de camundongos. J. Vis. Exp. (2016). Este vídeo demonstra o uso de hibridização in situ de fluorescência dupla para visualizar a expressão de dois alvos de RNA em seções cerebrais de camundongos. O protocolo envolve a detecção sequencial de RNA usando sondas marcadas com isotiocianato de fluoresceína e digoxigenina, seguida de...

 Realizando hibridização in situ de fluorescência dupla para detectar a expressão gênica em seções cerebrais de camundongos

Todo o Monte RNA Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; A hibridação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões

Nós descrevemos um monte de todo o processo de hibridação in situ multi-alvo cromogénico (MC-DESEJO) em embriões de Drosophila intactas permitindo a detecção simultânea e específica de três padrões de distribuição mRNA diferentes, contrastando precipitados de cor.

Multi-alvo Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização para Comparando Expressão Gênica em Domínios<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

Localizar a expressão gênica em tipos específicos de células pode ser um desafio devido à falta de anticorpos específicos. Aqui descrevemos um protocolo para detecção tripla simultânea de expressão gênica combinando hibridização in situ de RNA de fluorescência dupla com imunocoloração.

Combinando Duplo Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com imunomarcação para a detecção da expressão de três genes em secções do cérebro do rato

O protocolo descrito de RNA em situ hibridização permite a detecção de RNA em toda Drosophila embriões ou tecidos dissecados. Usando placas de 96 poços da microplaca e amplificação do sinal de tyramide, transcrições podem ser detectadas no throughput, sensibilidade e alta resolução e a um custo relativamente baixo.

Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

Aqui descrevemos um protocolo para multiplex immunohistochemical fluorescente de coloração e de imagem para localização simultânea de múltiplos antígenos associada a câncer de linfoma. Este protocolo pode ser estendido para a análise de colocalization de biomarcadores dentro de todas as secções de tecido.

Coloração imuno-histoquímica fluorescente multiplexada, imagem e análise de amostras histológicas de linfoma

Descrevemos um método de coloração rápida para realizar imagens multiespectrais em tecidos congelados.

Um método rápido para imagem de fluorescência multiespectral de seções de tecido congelado

Este protocolo descreve um método para combinar hibridização in situ fluorescente (FISH) e imunohistoquímica de fluorescência (IHQ) em cortes frescos congelados e fixos de camundongos em cérebros, com o objetivo de obter sinais de FISH multimarcados e IHC de fluorescência. IHQ teve como alvo proteínas citoplasmáticas e ligadas à membrana.

Combinando Hibridização In Situ por Fluorescência Multiplex com Imunohistoquímica Fluorescente em Seções Cerebrais de Camundongos Frescos Congelados ou Fixos

Este protocolo descreve as etapas detalhadas da microscopia imunoeletrônica pré-incorporada, com foco na exploração de circuitos sinápticos e localização de proteínas na retina.

Investigando circuitos retinianos e localização molecular por microscopia imunoeletrônica pré-incorporada

Aprenda a combinar corante lipofílico, hibridização in situ, imunohistoquímica e histologia em tecido de camundongo. Este método maximiza a coleta de dados de um único espécime, correlacionando mutações genéticas com perfis morfológicos e de expressão.

Combinando corante lipofílico, In situ Hibridação, imunohistoquímica e histologia

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