Isolamento mitocondrial do músculo esquelético
30 de março de 2011
Este protocolo descreve um procedimento para estudar a respiração das mitocôndrias isoladas dos músculos esqueléticos. Este método foi adaptado de Scorrano Et al. (2007). O procedimento de isolamento mitocondrial requer cerca de 2 horas. A respiração mitocondrial pode ser concluído em cerca de 1 hora.
O objetivo geral deste procedimento é isolar as mitocôndrias e realizar a respiração mitocondrial. Isso é feito isolando primeiro o músculo esquelético de ratos pulverizados. Em seguida, o músculo é homogeneizado e as mitocôndrias são isoladas por centrifugação.
A concentração de proteína é então determinada usando o ensaio de Bradford. Finalmente, a respiração mitocondrial é medida por poligrafia. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o consumo de oxigênio através dos diferentes estados de respiração mitocondrial.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do músculo esquelético, como o efeito de diferentes intervenções da função mitocondrial. Embora esse método possa fornecer informações sobre o metabolismo do músculo esquelético, ele também pode ser aplicado a outros órgãos, como fígado, cérebro, rim ou quase qualquer tecido antes de iniciar o procedimento. Para isolar o músculo esquelético, prepare as seguintes soluções, P-B-S-P-B-S mais EDTA 10 milimolares, oito vezes o tampão de isolamento do tampão mitocôndrico um ou IB um, o tampão de isolamento dois ou IB dois e o tampão experimental ou eb.
Consulte o protocolo escrito que acompanha as instruções. Em seguida, ligue a centrífuga e ajuste-a para quatro graus Celsius. Ligue um banho-maria e ajuste-o para 37 graus Celsius.
Em um bom balde, coloque três copos de 10 mililitros, cotovelo de oleiro, moedores de tecido de gema, pequenas tesouras cirúrgicas e 10 tubos de microcentrífuga no gelo. Tudo deve ficar gelado durante todo o experimento. Coloque IB um e IB dois em ICE e EB em um banho de água morna.
Em seguida, adicione as seguintes soluções aos três copos no copo de gelo: um copo de 10 mililitros de PBS, dois 10 mililitros de copo P-B-S-E-D-T-A. Três. Três mililitros de ib. Um sacrifica um rato de acordo com os procedimentos aprovados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e sucos.
Em seguida, isole rapidamente 250 a 500 miligramas de músculo esquelético com fórceps e tesoura Mayo Clinic. Enxágue em beca um, depois transfira para beca dois, para homogeneizar o músculo. Primeiro, transfira para o copo três e, finalmente, pique com uma tesoura.
Transfira a solução para o homogeneizador de gemas Elva de oleiro homogeneizar o músculo usando um pilão motorizado 10 vezes, mantendo o tubo sempre congelado. Em seguida, transfira o homogeneizado para microcentrífuga pré-resfriada de dois mililitros, tubos e centrífuga a 700 Gs por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante S para um novo tubo de microcentrífuga pré-arquivado e descarte a centrífuga de pellets.
O sobrenadante S a 10.500 Gs por 10 minutos A quatro graus Celsius, transfira o SNAT para um novo tubo de microcentrífuga pré-preenchido e rotule-o com SN one e tipo de músculo Reese. Suspenda o pellet em 500 microlitros de IB dois e centrifugue a 10.500 Gs por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o supinato para um novo tubo de microcentrífuga pré-preenchido e rotule-o com SN dois e tipo de músculo.
Suspenda o pellet mitocondrial final em 100 microlitros de IB dois. Gire em uma mini fuga por alguns segundos. Se houver um pellet, transfira o supinato para um novo tubo de microcentrífuga pré-cheio e descarte o pellet A calibração do eletrodo de oxigênio é uma etapa fundamental neste protocolo e deve ser realizada diariamente.
A calibração do eletrodo pode ser concluída durante o isolamento mitocondrial. Para começar, adicione 100 mililitros de água destilada a um frasco de 250 mililitros estrela vigorosamente por 20 minutos. Para equilibrar a água com o gás atmosférico, cubra o eletrodo GRAT com algumas gotas de cloreto de potássio a 50%.
Em seguida, coloque um pequeno pedaço de papel de enrolar azul rizla em cima do eletrodo. Em seguida, um pedaço de membrana de PTFE. Em cima do papel de enrolar.
Aplique o anel interno usando o aplicador de anel e, em seguida, coloque o anel externo na ranhura do eletrodo. Conecte os eletrodos e monte a base do anel de plástico maior, a câmara mitocondrial e as mangueiras de água. Ligue as caixas GRAT e inicie o software GRAS.
Adicione a água equilibrada à câmara mitocondrial. Em seguida, adicione uma barra de agitação para ligar a barra de agitação. Clique em hardware.
Em seguida, mexa uma velocidade. Ajuste a velocidade para 60 e clique em. Em seguida, inicie um novo experimento.
Clique em calibrar e, em seguida, em calibração da fase líquida. Para a caixa um, altere a temperatura para 37 graus Celsius e clique em ok duas vezes. Quando a substituição mudar para, ok, clique nela e abra o tanque de gás nitrogênio.
Coloque a ponta conectada ao tanque de nitrogênio na câmara e estabeleça oxigênio zero. Clique em OK quando ele alternar de substituição. Aspire a água e adicione 500 microlitros de EB às câmaras mitocondriais.
Sele a câmara com um êmbolo. Se estiver usando várias caixas, repita a partir da etapa de calibração para cada caixa. Inicie um novo experimento e deixe-o funcionar por cerca de um minuto.
Para estabilizar o sinal, adicione o volume necessário da suspensão mitocondrial para chegar a 150 microgramas em cada câmara. Marque o evento e deixe-o rodar. Por um minuto, adicione 10 microlitros de glutamato 250 milimolar quente, malato 125 milimolar para uma concentração final de glutamato cinco milimolar, marca de malato 2,5 milimolar e deixe funcionar por um minuto.
Isso é definido como estado dois. Em seguida, adicione 7,5 microlitros de 10 milimolares a DP para uma concentração final de 150 micromolares. Em seguida, marque e deixe funcionar por 30 segundos.
Isso é definido como estado três. Adicione mais 7,5 microlitros de 10 milimolares a marca DP e deixe funcionar por 1,5 minutos. Adicione 0,5 microlitros de oligomicina fria de 10 milimolares para uma concentração final de uma marca micromolar e deixe funcionar por três minutos.
Isso é definido como estado quatro. Adicione um microlitro de FCCP frio 0,1 milimolar para uma concentração final de 0,2 marca micromolar e deixe RUM por três minutos. Isso é definido como estado cinco.
Quando terminar, termine o experimento e salve-o. Adquira as taxas de respiração usando o software da jangada. Insira o fator de normalização.
Se adicionar 150 microgramas de proteína mitocondrial, o fator de normalização será 0,15. Calcule as taxas de respiração normalizadas para os diferentes estados de respiração. Calcule a taxa de controle respiratório ou RCR dividindo o estado três pelo estado quatro.
Esta figura mostra um traçado representativo do consumo de oxigênio pelo músculo esquelético. Mitocôndria. Depois que o sinal do eletrodo é estabilizado, a amostra de mitocôndrias é adicionada à câmara GRAT. Estado dois, a respiração começa com a adição de glutamato e malato.
A adição de um DP aumenta o consumo de oxigênio. Definindo o estado três. Respiração Uma TP syntase é bloqueada pela adição de uma liga micina para obter a respiração do estado quatro.
Finalmente, o FCCP é adicionado para desacoplar a respiração mitocondrial. Este diagrama mostra as taxas representativas de consumo de oxigênio para os estados 2, 3, 4 e cinco. A taxa de controle respiratório ou RCR é calculada para cada experimento.
Um RCR maior que quatro é considerado evidência de uma preparação mitocondrial viável ao tentar este procedimento. É importante manter as amostras mitocondriais no gelo o tempo todo. Seguindo este procedimento.
Outros métodos, como Western blots, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o conteúdo de proteínas mitocondriais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar o músculo mitocondrial do músculo esquelet, bem como a respiração mitocondrial.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um procedimento para isolar mitocôndrias de músculos esqueléticos e medir sua respiração. O método permite a avaliação da função mitocondrial por meio da análise do consumo de oxigênio.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Metabolismo
Contexto
- As mitocôndrias desempenham um papel crucial na produção de energia.
- Compreender a respiração mitocondrial é essencial para o estudo de distúrbios metabólicos.
- Este protocolo é adaptado de metodologias estabelecidas.
- O isolamento de mitocôndrias é fundamental para a medição precisa de sua função.
Objetivo do Estudo
- Isolar mitocôndrias de tecido muscular esquelético.
- Medir as taxas de respiração mitocondrial.
- Analisar o consumo de oxigênio em diferentes estados de respiração mitocondrial.
Métodos Utilizados
- Isolamento de músculo esquelético de ratos submetidos à secagem por aspersão.
- Homogeneização do tecido muscular.
- Centrifugação para isolamento de mitocôndrias.
- Determinação da concentração de proteína utilizando o ensaio de Bradford.
- Medição da respiração mitocondrial utilizando poligrafia.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de mitocôndrias do músculo esquelético.
- Avaliação quantitativa da respiração mitocondrial.
- Os resultados indicam consumo variável de oxigênio entre diferentes estados respiratórios.
Conclusões
- O protocolo isola efetivamente mitocôndrias para estudos de respiração.
- Os achados contribuem para a compreensão da função mitocondrial em processos metabólicos.
- Este método pode ser aplicado em pesquisas futuras sobre metabolismo muscular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de mitocôndrias funcionais do músculo esquelético permite a eliminação mecanicista de riscos associados a alvos metabólicos na fase pré-clínica de descoberta. Leituras quantitativas da respiração fornecem confiança preditiva para a validação de alvos e investigação de vias metabólicas. Este método apóia decisões precoces de avançar ou interromper projetos, estabelecendo limiares de viabilidade mitocondrial antes da triagem de compostos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas ao relacionar a função mitocondrial com o metabolismo do músculo esquelético e a homeostase energética.
- Valor Operacional: Permite a desconsideração de riscos biológicos mediante o isolamento padronizado de mitocôndrias viáveis com RCR ≥4 como referência funcional.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao quantificar razões de controle respiratório que refletem a integridade mitocondrial e a eficiência de acoplamento.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas mitocondriais validados para ensaios bioquímicos e funcionais posteriores, incluindo atividade enzimática e proteômica.
- Valor Operacional: Garante a padronização dos ensaios mediante calibração diária do eletrodo de oxigênio e normalização consistente de proteínas utilizando o ensaio de Bradford.
- Valor de Escalabilidade: Permite avaliação confiável de compostos por meio de medições reprodutíveis da respiração nos estados 2-5 sob condições controladas de substrato e inibidor.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a relevância para doenças ao estudar a respiração mitocondrial no músculo esquelético, um tecido-chave nos distúrbios metabólicos.
- Valor Operacional: Fornece continuidade translacional, desde a descoberta até a validação pré-clínica, por meio do consumo quantitativo de oxigênio em diferentes estados respiratórios.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta decisões ao medir a respiração desacoplada (estado 5) e a ligada ao ATP (estado 3) para avaliar a saúde bioenergética.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta que vai do teste de hipóteses à identificação de compostos líderes, apoiando programas direcionados a mitocôndrias em doenças metabólicas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante o isolamento de mitocôndrias para esclarecer as vias envolvidas na síntese de ATP e na sinalização metabólica.
- Triagem: Garante prontidão para ensaios por meio de medições reprodutíveis de respiração que permitem comparar os efeitos de compostos sobre o consumo de oxigênio.
- Análises: Gera resultados quantitativos (respiração nos estados 2-5, RCR) que ajudam as equipes a comparar condições e avaliar a função mitocondrial.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao fornecer dados funcionais de mitocôndrias relevantes para modelos de metabolismo muscular e de gasto energético.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de isolamento e respiração aplicável a diversos tipos de músculo esquelético e adaptável a outros tecidos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na viabilidade mitocondrial, redução da ambiguidade mecanicista em estudos do metabolismo energético.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos ensaios de isolamento mitocondrial e respiração.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre prosseguir ou interromper projetos, eficiência do capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados em programas de alvos metabólicos.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco com base em razões de controle respiratório e perfis de respiração específicos por substrato.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em técnicas de isolamento mitocondrial, centrifugação e medição da respiração.
- Depende de instrumentação, incluindo homogeneizadores, centrífugas mantidas a 4°C, banhos-maria a 37°C e sistemas com eletrodo polarográfico de oxigênio.
- Necessita padronização entre as equipes no preparo de tampões, calibração diária do eletrodo e manipulação rigorosa das amostras sob refrigeração com gelo.
- Considerações para adaptação incluem o ajuste da quantidade de tecido muscular (250-500 mg) e da carga proteica mitocondrial (150 µg) entre diferentes tipos de músculo esquelético.
- Limitações práticas incluem a necessidade de reagentes frescos, janela curta para estudos funcionais (~1 h após o isolamento) e calibração diária dos eletrodos de oxigênio.
