Métodos de Desenvolvimento de Sangue Transporte Macrófago Borne de Nanoformulated medicamentos anti-retrovirais

O objetivo deste procedimento é fabricar e testar a absorção celular, a secreção e as propriedades antirretrovirais de nanopartículas cristalinas antirretrovirais, às quais nos referimos como nano art. Isso é realizado primeiramente processando os medicamentos antirretrovirais por meio de homogeneização por sonicador ou moagem úmida. O segundo passo do procedimento consiste em caracterizar as propriedades físicas das partículas de nano art após a isolamento de monócitos primários por centrifugação contracorrente.

Eles são cultivados por sete dias em DMEM contendo fator estimulador de colônias de macrófagos, ou MCSF, que induz sua diferenciação em macrófagos derivados de monócitos. O terceiro passo é testar a captação, retenção e liberação de nano ART em macrófagos humanos derivados de monócitos. O passo final do procedimento é testar a eficácia anti-retroviral in vitro do nano ART em macrófagos derivados de monócitos.

No final, podem ser obtidos resultados que demonstram a captação facilitada e a liberação lenta de nanoarte por células, bem como uma eficácia antirretroviral robusta. Isso é determinado por meio de medições dos níveis de fármaco, por cromatografia líquida de alta eficiência ou HPLC, e pelo teste de materiais sobrenadantes de culturas infectadas mediante a medição da atividade da transcriptase reversa. Olá, sou Hanta Aldi e sou pesquisadora pós-doutoranda no laboratório da Dra. Howard Gelman no Centro Médico da Universidade do Nebraska.

Os métodos que apresentamos podem ajudar a responder perguntas fundamentais na nanomedicina, como, por exemplo, como os sistemas de liberação de fármacos baseados em células podem ser utilizados para desenvolver atividades de pesquisa translacional. Isso pode ser realizado utilizando terapia antirretroviral nanoformulada com meias-vidas prolongadas. Nossos estudos apoiam o potencial uso clínico do nano art.

Olá, meu nome é Ari Noche e sou aluno bolsista de MD PhD que trabalha no Laboratório Emergente de Neurociência Carol Schwartz. Sob a orientação do Dr. Gendelman, a implicação das técnicas que mostramos aqui se estende à terapia antirretroviral, pois compostos nanoformulados podem simultaneamente melhorar a biodisponibilidade e a farmacocinética, além de reduzir os efeitos colaterais relacionados ao medicamento. Ao utilizar medicamentos antirretrovirais clinicamente disponíveis e reembalá-los em nanopartículas, podemos ser capazes de melhorar a adesão ao tratamento e também afetar positivamente os desfechos da doença.

Olá, sou o Dr. Howard Gendelman. Sou cientista clínico e professor titular do Departamento de Farmacologia e Neurociência Experimental aqui no Centro Médico da Universidade do Nebraska. Nosso objetivo geral é simplificar os medicamentos antirretrovirais para torná-los mais facilmente disponíveis e melhorar sua biodistribuição e farmacocinética.

Agora passo a palavra para Ari e Sean, que irão levá-los ao laboratório de pesquisa e mostrar como é feita a fabricação e o desenvolvimento dessas nanopartículas. Aplicação clínica e desenvolvimento aqui no Centro Médico da Universidade do Nebraska. Para fabricar nanoarte por meio de moagem úmida, primeiro pese os cristais do fármaco e os diversos surfactantes que serão utilizados para produzir as formulações nano e misture-os com tampão heis 10 milimolar, pH 7,8, usando um misturador T 18 Ultra Turx até completa dispersão. A porcentagem do fármaco na formulação deve estar entre 1 e 2% para moagem contínua.

Certifique-se de que o refrigerador e o compressor estão ligados e que a pressão de saída está em torno de 100 PSI. Agora, prepare o sistema para que o meio de moagem possa ser carregado no tanque e adicione 50 mililitros de esferas à câmara de moagem. Usando um funil, certifique-se de que não haja esferas nas roscas ou em qualquer lugar fora da câmara de moagem para evitar vazamentos no selo mecânico. Agora, verifique se a junta de vedação (O-ring) está em sua posição correta na câmara de moagem.

Em seguida, selecione um tamanho apropriado de malha da peneira e fixe as tampas apertando as porcas. O tamanho da malha da peneira deve ser pelo menos metade do tamanho das esferas. Utilize uma malha de peneira de tamanho grande para evitar que o produto entupa o filtro durante a moagem contínua.

Após abaixar a câmara de moagem, adicione a suspensão do fármaco com diferentes quantidades de surfactantes à entrada do produto. O volume mínimo da suspensão deve ser de 100 mililitros. Isso evitará o superaquecimento da câmara de moagem e também impedirá a contaminação das microesferas devido ao menor desgaste das peças.

Em seguida, ligue a bomba. Usando a unidade de controle, varie a taxa de fluxo conforme necessário para sua formulação. Em seguida, ligue o agitador e ajuste a velocidade na unidade de controle.

A velocidade pode ser aumentada de 600 rotações por minuto para 4.320 rotações por minuto. Em um micro sur, monitore a temperatura utilizando o medidor de temperatura acoplado na parte superior da câmara de moagem para garantir que não haja superaquecimento. Agora, moa a amostra em várias velocidades e taxas de fluxo e retire alíquotas pequenas de cerca de um mililitro da formulação para medições de tamanho e carga utilizando um zetasizer Malvern de dispersão de luz por difração.

Após atingir o tamanho desejado, interrompa a moagem utilizando a unidade de controle e, com a bomba ainda ligada, colete a amostra em um frasco, permitindo que o fármaco drene completamente. Lembre-se de desligar a bomba ao finalizar e de remover e limpar as esferas. Agora, transfira a suspensão do moinho para tubos cónicos de 50 mililitros e configure a centrífuga para 10.000 rotações por minuto durante 30 minutos.

Após a conclusão do ciclo de centrífuga, meça a quantidade de sobrenadante e substitua pela mesma quantidade de solução fresca de surfactante. Uma vez concluída a suspensão de Resus, transfira a suspensão para a câmara de moagem e moa por 10 minutos. Retire uma alíquota de cerca de um mililitro e meça novamente o tamanho e a carga da amostra utilizando o analisador de zeta potencial.

Por fim, meça a concentração das formulações de nanoarte utilizando HBLC para fabricar nanoarte por meio de homogeneização. Usando o Avastin Emulex C cinco, prepare os cristais do fármaco e os diversos surfactantes conforme descrito anteriormente e transfira a suspensão para o recipiente de homogeneização e inicie a recirculação. Certifique-se de que o refrigerador esteja ligado antes de começar a homogeneizar a amostra.

Aumente a pressão gradualmente até o medidor indicar 20.000 mais ou menos 2.000 PSI e continue a homogeneizar até que o tamanho de partícula desejado seja alcançado. Isso geralmente leva entre 45 e 60 minutos. Colete periodicamente uma alíquota de cerca de um mililitro e meça o tamanho e a carga da amostra utilizando uma centrífuga zeta sizer, conforme descrito anteriormente para a suspensão homogeneizada.

Em seguida, após a suspensão em Resus, transfira a suspensão para o homogeneizador C cinco. Reinicie a circulação e restabeleça a pressão de homogeneização em 20.000 ± 2.000 PSI e homogeneíze por 30 minutos para fabricação por sonicação utilizando o processador ultrassônico Palmer frio. Despeje a solução de clorometano PLGA e fármaco em uma solução de surfactante PVA 1% e coloque em banho de gelo no ultrassom.

Inicie a sonicação em 50% de amplitude, embora a amplitude possa ser reduzida para cerca de 30% para lotes menores de amostras; sonique a amostra por 10 minutos. Retire uma pequena alíquota para análise de tamanho de partícula. Se o tamanho das partículas for maior que 1,5 mícron, sonique as amostras em intervalos de dois minutos, até um máximo de 16 minutos no total.

Observe as amostras ao microscópio com aumento de 20 vezes e documente as observações. Utilize uma placa agitadora para criar um vórtice adequado para a suspensão e continue a mistura durante a noite à temperatura ambiente. Colete a suspensão após 24 horas e despeje em tubos de centrífuga de 50 mililitros.

Centrifugue as amostras a uma velocidade de 8.000 rotações por minuto durante 20 minutos a cinco graus SIUs, decante o sobrenadante e re-suspenda uma metade da amostra em 75 mililitros de água filtrada por osmose reversa e a outra metade em 75 mililitros de surfactante de brometo de trimetilamônio de Ctal 0,5%. Centrifugue as amostras novamente a uma velocidade de 8.000 rotações por minuto durante 20 minutos a cinco graus Celsius e re-suspenda cada um dos pellets com um total de 20 mililitros de solução de manitol. Finalmente, para partículas fabricadas por homogeneização ou sonicação, meça o tamanho das partículas utilizando o zeta sizer e meça a concentração das amostras utilizando HPLC.

Para se preparar para a visualização com microscopia, pegue as suspensões preparadas de nanoarte e sonique por 10 segundos. Com amplitude de 20% e uma sonda de sonicação, pegue uma lamínula para lâmina de microscópio e coloque-a em um microscópio invertido. Sobre a lamínula.

Misture 15 microlitros da suspensão de nanoarte com 100 microlitros de solução salina tamponada com fosfato e homogeneíze pipetando para cima e para baixo várias vezes. Em seguida, visualize as nanopartículas utilizando uma objetiva de 20 vezes para observar a morfologia. As amostras também podem ser preparadas para visualização por microscopia eletrônica de varredura.

Aqui observamos imagens obtidas a partir do microscópio eletrônico de varredura com emissão de campo de baixa tensão A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F após o isolamento de monócitos sanguíneos por centrifugação, com monócitos purificados numa concentração de um vezes 10 à sexta potência células por mililitro em DMEM suplementado com os seguintes aditivos. Em seguida, plante duas vezes 10 à sexta potência células por poço em placas de seis poços dentro de uma atmosfera umidificada, suplementada com 5% de dióxido de carbono, e cultive por sete dias para permitir que os monócitos se diferenciem em macrófagos, a fim de analisar a captação e coleta celular. Misture nano art com meio de cultura até uma concentração final de 100 micromolar e adicione um mililitro de meio de tratamento a cada poço no ponto de tempo desejado ou quando as células estiverem completamente carregadas com nano art.

Remova todo o meio de tratamento e lave as células três vezes com um mililitro de PBS para remover quaisquer partículas que não foram internalizadas pelas células em um mililitro de PBS. Remova as células aderentes do fundo do poço utilizando um levantador de células e coloque-as em um tubo microcentrífugo de 1,7 mililitro. Em seguida, centrifugue as células a 1000 RCF a quatro graus Celsius por 10 minutos.

Remova o sobrenadante e adicione 200 microlitros de metanol a 100% às células para solubilizar o nano art por sonicamento breve do pellet com uma sonda sonora a 20% de amplitude por dois a cinco segundos. Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius até que estejam prontas para análise do conteúdo do fármaco. A retenção intracelular do nano art também pode ser visualizada por microscopia eletrônica de transmissão após o corte das seções com um micrótomo, conforme mostrado aqui.

Consulte o texto acompanhante deste artigo para obter detalhes sobre como analisar células tratadas com nano arco, seguindo o procedimento descrito anteriormente para análise da captação celular e coleta. No entanto, em vez de coletar as células após a lavagem, substitua o PBS por dois mililitros de meio de cultura celular sem MCSF e sem nano arte nos dias indicados ou conforme indicado pelo meio ficar amarelo, trocando metade do meio no dia desejado. Colete um mililitro do meio celular juntamente com as células replicadas e processe para análise do fármaco.

Para visualizar a captação em tempo real de nanoartes por microscopia bifocal, primeiramente obtenha um DRE, como o vibrant, e adicione-o ao meio. De acordo com as instruções do fabricante, adicione o meio contendo o corante aos macrófagos derivados de monócitos maduros e, em seguida, lave as células três vezes usando um mililitro de meio de cultura para remover qualquer corante em excesso. Agora, misture nanoartes com o meio de cultura utilizando nanoartes marcadas com fluorescência e adicione o meio de tratamento contendo nanoartes marcadas. Imediatamente antes da aquisição de imagens em um microscópio confocal, capture uma imagem a cada 30 segundos durante quatro horas usando uma objetiva de 60 vezes.

Por fim, podem ser realizados ensaios de infecção e infectividade pelo HIV-1. Primeiro, trate as células conforme descrito para a visualização da liberação de partículas virais. Em seguida, nos dias desejados, remova todo o meio e substitua por meio sem M-CSF contendo o HIV-1 (estirpe A) com uma multiplicidade de infecção de 0,01 partículas virais por célula e incube por 24 horas.

Em seguida, remova o meio viral e substitua por vírus fresco, cultivando as células em meio livre de vírus por 10 dias, trocando metade do meio a cada dois dias ou conforme necessário para manter as células vivas durante os 10 dias pós-infecção. Colete 10 microlitros de meio de cada poço e coloque em uma placa de 96 poços, armazenando a -80 graus Celsius até o momento de realizar a análise de transcriptase reversa. Detecções subsequentes de HIV-1 p24 também podem ser realizadas.

Aqui podemos observar prontamente a morfologia de células expostas ao vírus com uma multiplicidade de infecção de 0,011 dia após o tratamento com nano art. Nessas macrófagos derivados de monócitos, não há evidência de infecção viral e as nanopartículas são claramente visíveis no citoplasma celular. Aqui, as células foram expostas ao vírus 10 dias após o tratamento com nano art.

Algumas dessas células foram infectadas, conforme indicado pela coloração de P 24 e formação de células gigantes multinucleadas, mas ainda havia proteção significativa em comparação com as células não tratadas. Observe que as nanopartículas ainda são visíveis no citoplasma das células em B, mas não em tanta quantidade quanto foi observado em a; essas estruturas não estão presentes nas células que não foram tratadas com nano art. Nestes vídeos confocais de células vivas, observamos macrófagos marcados em verde e nano art marcado em vermelho.

Aqui podemos observar que as células acumulam muito poucas nanopartículas. Aqui, elas acumulam rapidamente partículas, conforme indicado pelo aumento da fluorescência vermelha. Essas diferenças seguem paralelamente os achados observados ao analisar a captação de fármacos utilizando HPLC; além disso, podemos ver que as células captam ativamente as partículas.

A diferença entre as taxas de acúmulo de nanoarte celular reflete os efeitos de características físicas, como tamanho, forma e carga, sobre a capacidade dos macrófagos de internalizar e reter nanoarte. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fabricar nanoarte utilizando técnicas de homogeneização por moagem úmida e sonicação. Estes são métodos eficazes para produzir nanopartículas antirretrovirais.

A moagem úmida e a homogeneização servem para fracionar partículas cristalinas maiores de fármacos em nanopartículas menores dentro de surfactantes lipídicos, e uma técnica de sonicação produz gotículas individuais de fármaco em escala nanométrica dentro de um polímero. Aqui também demonstramos como utilizar macrófagos derivados de monócitos humanos como uma plataforma de teste para avaliar o transporte de nanoartefatos. Nosso método de teste permite uma triagem muito simples da capacidade das partículas de serem internalizadas, retidas e liberadas pelas células, bem como de sua capacidade de inibir a replicação viral.

Isso permite que o pesquisador identifique nanofármacos que possam ter a maior probabilidade de sucesso in vivo e, eventualmente, de uso em humanos infectados. Os resultados completos desses experimentos são publicados no nosso artigo Online Nano. O artigo chama-se Nano Formulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics no Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010.

Muito obrigado.