Name: A tela de elevada capacidade para Biomining Atividade da celulase de Bibliotecas metagenomic (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Aprenda a identificar clones expressores de celulase em bibliotecas metagenômicas usando Escherichia coli. Este método automatizado de triagem em alta vazão permite descobrir enzimas celulolíticas com eficiência.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Steve Withers e Hong-Ming Chen para a prestação de DNP Cellobioside-substrato.

Antes de iniciar este protocolo, você terá sua biblioteca metagenomic armazenados em um formato placa 384 poços. Em nosso estudo, foi utilizada a pCC1 vetor de controle de cópia fosmid em combinação com TransforMax fago T1-resistentes EPI300-T1 R E. células de Escherichia como o anfitrião da biblioteca e armazenadas nossas placas a -80 ° C 11. 1. Replicação das Placas Biblioteca metagenomic <ol><li> Descongele as placas contendo sua biblioteca a 37 ° C por aproximadamente 20 minutos, ou até que todos os poços são descongelados. </li><li> Use o recurso de luz ultravioleta de esterilização da qPix2 para esterilizar o robô por 15 minutos. </li><li> Prepare o caldo LB com cloranfenicol na concentração final de 12.5ug/mL e arabinose em 100ug/mL em um frasco de reagente 500mL. Cada placa usará cerca de 20 mL, além de fazer uma 50mL adicionais para permitir volume morto. </li><li> Configure o qFill3 como instruções do fabricante com a garrafa media ligados ao colector através do tubo estéril. Programá-lo para a quantidade adequada de mídia, e configurá-lo para preencher um volume de 45uL em cada poço. </li><li> Purgar o ar da tubulação e múltiplas usando o recurso de purga do robô até que a mídia é visível proveniente de cada pino da placa base. </li><li> Preencher o número desejado de placas com a mídia usando o LB qFill3. Cada prato leva aproximadamente 20 segundos para encher. </li><li> Carregar as placas biblioteca e as placas novas em áreas apropriadas do robô qPix2. Preencha os banhos de limpeza com os reagentes adequados; 2% Micro90 no banho traseira, autoclavado água destilada em banho de meio, 80% de etanol na banheira frente. </li><li> Use o programa "Replicar" do qPix2. No software, selecione o apropriado cabeça, número e tipos de placas e chapas de fonte de destino. Também configurar a cabeça para limpar entre repetições, geralmente 6 ciclos em cada banho é suficiente. Capacidade da máquina é de 10 placas de cada vez, e leva aproximadamente 15 minutos para replicar todas elas com uma cabeça de alfinete 384 (ou cerca de 50 minutos com uma cabeça de alfinete 96). Nota: Existe uma opção para "Stir Source" ou "Stir Destino". É recomendado não usar essas opções como problemas já ocorreu com o nosso robot usá-los. </li><li> Uma vez que as placas são replicadas, crescem as placas a 37 ° C por 24 horas em uma caixa de umidade. Porque estamos induzindo a um número elevado de cópias de fosmid com adição de arabinose, os clones tendem a crescer mais lentamente do que os não-induzida clones. Retorno das placas biblioteca para -80 ° C. Nota: Incubação em uma caixa de umidade garante a evaporação dos meios de comunicação não ocorrer nos poços na borda das placas, mantendo um ambiente uniforme para todos os poços. </li><li> Limpe o robô qFill3 pela primeira purga-lo com água (~ 50 ml) e, em seguida, o etanol 80% (~ 50 ml). Desmontar os componentes, e limpo e autoclave a garrafa, tampa, e tubo enrolado em folha de alumínio. </li></ol> 2. Medir o Crescimento da E. Clones coli <ol><li> Remover placas de 37 ° C incubadora. Retire e reserve as tampas, e placas de lugar para a plataforma de carregamento revista fornecido com o RapidStak, até um máximo de 25 placas. Nota: A placa na parte inferior da pilha será o primeiro a ser lido. Certifique-se de acompanhar a ordem das placas, como o software não registra isso. </li><li> Remover uma revista da Stak Rapid, garantir que ele está vazio, e empurre-o para a pilha de pratos para ser lido. Agarrá-lo pela alça, e as placas devem todos ser carregados na revista. Carregar a revista no RapidStak. Nota: A revista tem um pequeno parafuso no canto denotando que canto os poços A1 das placas deve ir. A revista só vai montar na RapidStak em uma orientação. </li><li> Abra o programa RE SkanIt no computador ligado às máquinas. Selecionar "New Session" e nomeá-la adequadamente. Escolha "Fundo Plano Corning 384-placa bem" como o tipo de prato. </li><li> Na "Placa Layout" da área, selecione a opção "Wizard" botão, e escolhê-lo para adicionar 384 incógnitas para seu prato. </li><li> No "Protocolo", selecione o "Bem Loop" opção, e entrar para 384 poços. A "Bem Loop" ícone aparecerá no fluxo de árvore no lado esquerdo da tela. Selecione o ícone e clique para adicionar "Medição fotométrica". Configurá-lo para ler em 600nm. </li><li> Salve o seu protocolo com um nome único, e feche o programa RE SkanIt. </li><li> No computador, abra o programa PolaraRS. </li><li> Na página principal, haverá tabela listando os instrumentos conectado ao dispositivo RapidStak. O VarioSkan deve ser no lado esquerdo desta tabela. Sob o título VarioSkan, haverá dois links; "RunSession" e "Incubar". Clique no botão "RunSession" opção. </li><li> Uma nova janela, a janela de teste, aparecerá com um fluxograma no meio. Selecione a opção "RunSession" item (deve ser o item presente apenas). No lado direito da tela um menu drop-downirá aparecer. Encontrar o nome do seu RE SkanIt salvo executar neste menu. Nota: Parece haver qualquer ordenamento racional para esse menu. Não é por ordem alfabética, ou por data de adição, ou relacionado ao local onde o computador do protocolo é salvo. Isto significa que você deve olhar através de todos os protocolos antes de encontrar o seu próprio, que é uma dor. </li><li> Uma vez selecionado o protocolo, no canto superior direito clique em "Executar este ensaio". </li><li> Uma caixa irá aparecer, pedindo-lhe para indicar que a revista para usar como fonte, e que a revista está vazio. Caixa inferior na tela corresponde à revista da frente. [Opcional: ele pede que você digite o número de placas carregadas para determinar uma estimativa para a quantidade de tempo que levará. Esta estimativa é normalmente muito longe.] </li><li> Garantir tanto a RapidStak eo VarioSkan estão ligados, e pressione "OK". </li><li> O RapidStak irá carregar automaticamente suas placas para o leitor de placas, permitindo medições contínuas de chapas. Para ler 25 placas leva aproximadamente 50 minutos. Nota: Recomenda-se observar o carregamento primeira placa na VarioSkan para garantir o alinhamento correcto das máquinas. Se o RapidStak não carrega o leitor de placas corretamente, utilize o "Pause este ensaio" botão no canto superior direito da janela PolaraRS. </li><li> Uma vez que o VarioSkan é feito de ler todos os pratos, retire o carregador cheio e colocá-lo na plataforma de carga revista. Levante o retângulo externo da plataforma, ea revista deve deslizar, deixando as placas de pé em uma pilha no meio. Substituir as tampas para as placas apropriadas. </li></ol> 3. Além do Mix Ensaio para Cada Placa <ol><li> Preparar a mistura de ensaio usando o estoque 10x premade da mistura de lise (10% Triton X-100, ris 100mM, EDTA 10mM) em tampão acetato de potássio 50 mM pH 5,5. Prepare um estoque de até 75mg/mL substrato DNP cellobioside em DMSO, certificando-se o substrato estiver completamente dissolvido. Adicionar DNP-cellobioside solução estoque de misturar ensaio para uma concentração final de 0.1mg/mL. Cada placa usará cerca de 20 mL de solução, além de fazer uma 50mL adicionais para permitir volume morto. Nota: DNP Cellobioside não é facilmente solúvel em água, de modo a dissolução em DMSO aumenta a solubilidade. A presença de DMSO na solução final do ensaio não tem nenhum efeito observável. </li><li> Configure o qFill3 como instruções do fabricante com a garrafa media ligados ao colector através do tubo estéril. Programá-lo para a quantidade adequada de mídia, e configurá-lo para preencher um volume de 45uL em cada poço. </li><li> Purgar o ar da tubulação e múltiplas usando o recurso de purga do robô até que a mídia é visível proveniente de cada pino da placa base. </li><li> Adicione a mistura de ensaio para cada placa usando o qFill3. Cada prato leva aproximadamente 20 segundos para encher. </li><li> Uma vez mix de ensaio é adicionada, incubar as placas a 37 ° C em uma caixa de umidade para 12-16 horas. Nota: Mais de incubação das placas uma vez que o mix de ensaio é adicionada fará com que a evaporação nos poços externa da placa, produzindo valores mais elevados de absorbância do que o observado para os poços no interior. Isso pode ser compensado por placas de incubação em câmara úmida. </li></ol> 4. Absorbância leitura de Clones Analisada <ol><li> Remover placas de 37 ° C incubadora. Retire e reserve as tampas, e placas de lugar para a plataforma de carregamento revista fornecido com o RapidStak, até um máximo de 25 placas. Nota: A placa na parte inferior da pilha será o primeiro a ser lido. Certifique-se de acompanhar a ordem das placas, como o software não registra isso. </li><li> Remover uma revista da Stak Rapid, garantir que ele está vazio, e empurre-o para a pilha de pratos para ser lido. Agarrá-lo pela alça, e as placas devem todos ser carregados na revista. Carregar a revista no RapidStak. Nota: A revista tem um pequeno parafuso no canto denotando que canto os poços A1 das placas deve ir. A revista só vai montar na RapidStak em uma orientação. </li><li> Abra o programa RE SkanIt no computador ligado às máquinas. Selecionar "New Session" e nomeá-la adequadamente. Escolha "Fundo Plano Corning 384-placa bem" como o tipo de prato. </li><li> Na "Placa Layout" da área, selecione a opção "Wizard" botão, e escolhê-lo para adicionar 384 incógnitas para seu prato. </li><li> No "Protocolo", selecione o "Bem Loop" opção, e entrar para 384 poços. A "Bem Loop" ícone aparecerá no fluxo de árvore no lado esquerdo da tela. Selecione o ícone e clique para adicionar "Medição fotométrica". Configurá-lo para ler em 400nm. </li><li> Salve o seu protocolo com um nome único, e feche o programa RE SkanIt. </li><li> No computador, abra o programa PolaraRS. </li><li> Na página principal, haverá tabela listando os instrumentos conectado ao dispositivo RapidStak. O VarioSkan deve ser no lado esquerdo desta tabela. Sob o título VarioSkan, haverá dois links; "RunSession" e "Incubate ". Clique no botão" RunSession opção ". </li><li> Uma nova janela, a janela de teste, aparecerá com um fluxograma no meio. Selecione a opção "RunSession" item (deve ser o item presente apenas). No lado direito da tela um menu drop-down aparecerá. Encontrar o nome do seu RE SkanIt salvo executar neste menu. </li><li> Uma vez selecionado o protocolo, no canto superior direito clique em "Executar este ensaio". </li><li> Uma caixa irá aparecer, pedindo-lhe para indicar que a revista para usar como fonte, e que a revista está vazio. Caixa inferior na tela corresponde à revista da frente. [Opcional: ele pede que você digite o número de placas carregadas para determinar uma estimativa para a quantidade de tempo que levará. Esta estimativa é normalmente muito longe.] </li><li> Garantir tanto a RapidStak eo VarioSkan estão ligados, e pressione "OK" </li><li> O RapidStak irá carregar automaticamente suas placas para o leitor de placas, permitindo medições contínuas de chapas. Nota: Recomenda-se observar o carregamento primeira placa na VarioSkan para garantir o alinhamento correcto das máquinas. Se o RapidStak não carrega o leitor de placas corretamente, utilize o "Pause este ensaio" botão no canto superior direito da janela PolaraRS. </li><li> Uma vez que o VarioSkan é feito de ler todos os pratos, retire o carregador cheio e colocá-lo na plataforma de carga revista. Levante o retângulo externo da plataforma, ea revista deve deslizar, deixando as placas de pé em uma pilha no meio. As placas podem ser eliminadas de acordo com seus procedimentos de laboratório. </li><li> Para exportar as leituras de absorbância, software open RE SkanIt, e escolha "Abrir um arquivo existente". </li><li> Selecione o diretório onde você salvou a sua sessão, bateu o ícone "+" para expandir a lista e sob o título rubrica será opções rotuladas "Container 1" para "Container N", dependendo do número de placas. Selecione a primeira placa a ser analisado. </li><li> Na barra de menu no topo da página, selecione "Processamento de Dados&gt; Relatório / Export" </li><li> Escolha as opções desejadas para a exportação. Nota: Eu normalmente selecione "Layout da placa" e "fotométrica" ​​dados para a exportação. </li><li> Clique em "Exibir relatório" e depois "File&gt; Save". Escolha o diretório desejado. O formato de saída é uma planilha do Microsoft Excel </li></ol> 5. Resultados representante Um exemplo de leituras de absorbância de uma placa de 384 único poço que contém um clone positivo é mostrado na Figura 2. Clones positivos mostram um acentuado aumento na absorvância sobre aqueles que não expressam a atividade celulase. Diferenças no tempo de ensaio, local bem no prato, ou concentração DNP (pode ser introduzido através da filtragem de não-dissolvido DNP) pode afetar as leituras de absorbância absoluta. Leituras de absorbância relativa, como a diferença de absorvância acima da média ou média placa de coluna, são um método mais robusto de identificar clones celulase positivo. Após a identificação dos clones positivos das placas biblioteca, recomenda-se a replicar todos os clones positivos para um novo prato para a triagem secundária. Isso elimina os efeitos decorrentes da variação local bem ou placa e permite uma maior comparação direta entre clones positivos. <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Fluxograma do ensaio de alto rendimento para uma biblioteca metagenomic clonado em E. coli e armazenadas a -80 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Leituras de absorbância de uma placa de 384 poços contendo um clone positivo. Celulase clones positivos podem ser identificados por absorbância aumentou significativamente ao longo clones negativo.

<ol><li>Rubin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+of+cellulosic+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomics of cellulosic biofuels.</a> Nature. 454, 841-845 (2008).</li>
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<li>Kasana, R. C., Salwan, R., Dhar, H., Dutt, S., Gulati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+easy+method+for+detection+of+microbial+cellulases+on+agar+plates+using+Gram%27s+Iodine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A rapid and easy method for detection of microbial cellulases on agar plates using Gram's Iodine.</a> Curr. Microbiology. 57, 503-507 (2008).</li>
<li>Huang, J. S., Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+assay+for+cellulase+and+dextranase%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Sensitive assay for cellulase and dextranase.</a> Anal. Biochem. 73, 369-377 (1976).</li>
<li>Tull, D., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cellulases+and+xylanases%3A+A+detailed+kinetic+study+of+the+exo-beta-1%2C4-glycanase+from+Cellulomonas+fimi%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cellulases and xylanases: A detailed kinetic study of the exo-beta-1,4-glycanase from Cellulomonas fimi.</a> Biochemistry. 33, 6363-6370 (1994).</li>
<li>Martinez, A., Bradley, A. S., Waldbauer, J. R., Summons, R. E., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteorhodopsin+photosystem+gene+expression+enables+photophosphorylation+in+a+heterologous+host%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host.</a> PNAS. 104, 5590-5595 (2007).</li>
<li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+Insert+Environmental+Genomic+Library+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large Insert Environmental Genomic Library Production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Martinez, A., Tyson, G. W., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+known+and+novel+phosphonate+utilization+pathways+in+marine+bacteria+revealed+by+functional+screening+and+metagenomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Widespread known and novel phosphonate utilization pathways in marine bacteria revealed by functional screening and metagenomic analyses.</a> Environ Microbiol. 12, 222-238 (2010).</li>
<li>Wild, J., Hradecna, Z., Szybalski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+amplifiable+BACs%3A+Switching+from+single-copy+to+high-copy+vectors+and+genomic+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Conditionally amplifiable BACs: Switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones.</a> Genome Research. 12, 1434-1444 (2002).</li>
<li>Johnson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sacchirification+of+complex+cellulosic+substrates+by+the+cellulase+system+from+Clostridium+thermocellum%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sacchirification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from Clostridium thermocellum.</a> Appl Environ Microbiology. 43, 1125-1132 (1982).</li>
<li>Stutzenberger, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulase+Production+by+Thermomonospora+curvata+isolated+from+municipal+solid+waste+compost%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cellulase Production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost.</a> Appl Environ Microbiol. 22, 147-152 (1971).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Uma tela de alto rendimento para a detecção rápida da atividade celulolítica de uma biblioteca genômica inserir grandes metagenomic DNA expressa em E. coli é descrita neste protocolo. Este método é uma melhoria em relação ao ensaio de Red CMC / Congo comumente utilizados na literatura. É solução baseada, e permite um pot-triagem química em 384 poços pratos, com o resultado final como leituras de absorbância de um leitor de placas permitindo a análise quantitativa. A automação de cada etapa deste processo permit...

<table><tbody><tr><td>qPix2</td><td>Genetix</td><td></td><td>Com cabeça de gradeação de 384 pinos</td></tr><tr><td>qFill3</td><td>Genetix</td><td></td><td>Com manifold de 384 poços</td></tr><tr><td>Varioskan</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RapidStak</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td>Conectado ao Varioskan</td></tr><tr><td>Detergente Micro90</td><td>Cole-Parmer</td><td>18100-00</td><td>Diluído a 2% em água</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fornecedor principal de laboratório</td><td></td><td>Diluído a 80% em água</td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>12,5 mg/mL em etanol</td></tr><tr><td>Caldo LB, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td>25 g/L, autoclavado</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de fundo plano de 384 poços</td><td>Corning</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-Araabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td>100 mg/mL em água</td></tr><tr><td>Acetato de potássio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P171</td><td>50 mM em água, autoclavado, ajustado para pH 5,5 com HCl</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Trizma cloreto de hidrogênio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td>Na solução tampão TE, 100 mM</td></tr><tr><td>Sal dissódico de EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>Na solução tampão TE, 10 mM</td></tr><tr><td>2,4-dinitrofenil celobiosídeo</td><td></td><td></td><td>Fornecido pelo Dr. Steve Withers, UBC</td></tr><tr><td>Dissulfóxido de dimetila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr></tbody></table>

a tela de elevada capacidade para biomining atividade da celulase de bibliotecas metagenomic

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Celulose, a mais abundante fonte de carbono orgânico no planeta, tem amplas aplicações industriais, com ênfase crescente na produção de biocombustíveis 1. Métodos químicos para modificar ou degradar a celulose normalmente requerem ácidos fortes e altas temperaturas. Como tal, métodos enzimáticos tornaram-se proeminentes no processo de bioconversão. Enquanto a identificação de celulases ativa a partir de isolados de bactérias e fungos tem sido pouco eficaz, a grande maioria dos micróbios na natureza resistir cultivo de laboratório. Genômica ambiental, também conhecida como screening metagenomic abordagens, têm uma grande promessa para fazer a ponte de cultivo na busca de enzimas bioconversão romance. Abordagens triagem metagenomic com sucesso recuperado celulases romance de ambientes tão variados quanto os solos 2, 3 e rúmen de búfalo da região posterior do intestino de cupins 4 usando placas de carboximetilcelulose (CMC) agar coradas com corante vermelho congo (com base no método de Teather e Wood 5). No entanto, o método CMC é limitada em débito, não é quantitativa e manifesta um baixo sinal-ruído 6. Outros métodos têm sido relatados 7,8, mas cada um usa ensaio agar plate-based, o que é indesejável para high-throughput screening de bibliotecas genômicas grande inserção. Aqui nós apresentamos uma solução baseada em tela para a atividade celulase utilizando um dinitrofenol cromogênico (DNP)-cellobioside substrato 9. Nossa biblioteca foi clonado no controle de cópia pCC1 fosmid para aumentar a sensibilidade do ensaio através da indução no número de cópias 10. O método usa um pot-química em 384 poços microplacas com a leitura final, fornecida como uma medida de absorbância. Essa leitura é quantitativa, sensíveis e automatizados com um caudal de até 100X placas de 384 poços por dia, utilizando um manipulador de líquidos e leitor de placas com sistema de empilhamento em anexo.

Este protocolo descreve um ecrã de alta taxa de transferência para a atividade celulolítica de uma biblioteca metagenomic expressa em Escherichia coli. A tela é solução baseada e altamente automatizado, e usa um pot-química em 384 microplacas bem com a leitura final como uma medida de absorbância.

A tela de elevada capacidade para Biomining Atividade da celulase de Bibliotecas metagenomic

A celulose, a fonte de carbono orgânico mais abundante do planeta, possui aplicações industriais abrangentes, com ênfase crescente em biocombustíveis...

O objetivo geral deste procedimento é identificar clones produtores de celulase a partir de uma biblioteca metagenômica. Isso é realizado primeiramente replicando uma biblioteca metagenômica previamente construída usando um robô, seguido pela incubação da biblioteca replicada a 37 graus Celsius por 24 horas. O crescimento dos clones de E. coli é medido, e então tampão de lise e substrato são adicionados à biblioteca replicada.No final, podem ser obtidos resultados que mostram atividade de celulase por meio de medições colorimétricas de absorbância utilizando um leitor de placas. Olá, sou Keith do laboratório de Steven Hallam do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade da Colúmbia Britânica. Hoje vamos mostrar um procedimento para a triagem funcional em alto rendimento de bibliotecas metagenômicas.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a atividade da celulase biomin a partir de bibliotecas metagenômicas. Então, vamos começar. Antes de iniciar este protocolo, prepare uma biblioteca metagenômica armazenada em formato de placa de 384 poços.Este estudo utilizou o vetor SMID de controle de uma cópia do PCC em combinação com células E. coli resist

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Grande Escala Telas de Bibliotecas metagenomic

Nós desenvolvemos abrangente, imparcial genome-wide telas para entender gene de drogas e interações gene-ambiente. Métodos para a triagem dessas coleções mutantes são apresentados.

Competitiva Screens Genomic de Bibliotecas Yeast Barcoded

Nós descrevemos um baixo custo, o método de alto rendimento para a tela para a atividade endoglucanase fúngicas...

High Throughput Screening da atividade endoglucanase de fungos em Escherichia coli</em

Um método simples e rápido para determinar o potencial de sacarificação de um grande número de amostras de biomassa vegetal é descrito. A plataforma automatizada para esta análise envolve a preparação da biomassa de plantas para análise em 96 placas bem e do desempenho posterior de hidrólise pré-tratamento e quantificação dos açúcares liberados.

Alto rendimento Assay Sacarificação para materiais lignocelulósicos

Fonte: Kim, H. et. al., Triagem Multienzimática Usando um Sistema de Triagem Enzimática Genética de Alto Rendimento. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra um método de triagem genética para detectar a expressão enzimática usando bibliotecas metagenômicas de fosmid e substratos cromogênicos. A citometria de fluxo identifica e isola células individuais produzindo produtos coloridos, permitindo a seleção de alta produtividade das células ativas que expressam enzimas.

Detecção da expressão de enzimas-alvo em células bacterianas geneticamente modificadas

As plantas de tabaco foram utilizadas para produzir uma celulase fúngica, TrCel5A, através de um sistema de expressão transiente. A expressão pode ser controlada por meio de uma proteína de fusão fluorescente, e a actividade da proteína foi caracterizada pós-expressão.

Expressão da proteína recombinante a partir da celulase Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Em Plantas de tabaco

A estrutura da parede celular vegetal e as características químicas são avaliadas para identificar matérias-primas ideais para biocombustíveis e biomateriais. Os métodos padrão têm limitações quando aplicados a grandes conjuntos de dados. Esses métodos de pré-tratamento de alto rendimento, sacarificação enzimática e espectrometria de massa de feixe molecular de pirólise comparam um grande número de amostras de biomassa com tempo e custo experimentais reduzidos.

Rastreio de alto rendimento de Variações recalcitrância da biomassa lignocelulósica em: Total lignina, a lignina monómeros, e enzimática Sugar lançamento

Este trabalho apresenta um método de triagem de alto rendimento usando um sistema universal de triagem enzimática genética que pode ser teoricamente aplicado a mais de 200 enzimas. Aqui, o sistema de triagem único identifica três enzimas diferentes (lipase, celulase e fosfatase alcalina) simplesmente alterando o substrato usado (acetato de p-nitrofenila, p-nitrofenil-β-D-celobiosídeo e fenil fosfato).

Multi-enzima Triagem Usando um de alta capacidade Enzyme genética Sistema de Triagem

Um ensaio de alto rendimento para triagem enzimática é descrito. Este kit de ensaio multiplexado pronto para uso é composto por substratos Chromogênicos Polymer Hydrogel (CPH) pré-escolhidos e substratos complexos de Chromogênico B iomassa (ICB). As enzimas-alvo são endoenzimas e proteases degradadoras de polissacarídeos.

High-throughput screening de enzimas Carboidratos-degradantes Usando Novel Insolúvel substrato cromogénico Kits de Ensaio

A tecnologia CRISPR-Cas9 fornece um método eficiente para editar precisamente o genoma dos mamíferos em qualquer tipo de célula e representa um novo meio para realizar telas genéticas de todo o genoma. Um protocolo detalhado que discute as etapas necessárias para o desempenho bem-sucedido de telas de CRISPR-Cas9 agrupadas em todo o genoma é fornecido aqui.

Telas genéticas com base em CRISPR agrupadas em células de mamíferos

Esse protocolo apresenta um fluxo padrão de triagem de alta produtividade para microrganismos industriais. Envolve construir uma biblioteca mutante via mutagênese ARTP, realizar triagem positiva de gotículas com microfluídica automatizada e, posteriormente, verificar os resultados. A confiabilidade do fluxo de trabalho foi validada por meio de triagem de cepas de B. coagulans de alto rendimento.

Triagem de alto rendimento de mutantes Bacillus coagulans , hiperprodutora de ácido l-lático, utilizando uma plataforma microfluídica automatizada de gotículas

Aprenda a identificar clones expressores de celulase em bibliotecas metagenômicas usando Escherichia coli. Este método automatizado de triagem em alta vazão permite descobrir enzimas celulolíticas com eficiência.

A tela de elevada capacidade para Biomining Atividade da celulase de Bibliotecas metagenomic

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