A tela de elevada capacidade para Biomining Atividade da celulase de Bibliotecas metagenomic

O objetivo geral deste procedimento é identificar clones que expressam celulase a partir de uma biblioteca metagenômica. Isso é feito primeiro replicando uma biblioteca metagenômica feita anteriormente usando um robô após a incubação da biblioteca replicada a 37 graus Celsius por 24 horas. O crescimento dos clones de E coli é medido, a lise, o tampão e o substrato são então adicionados à biblioteca replicada.

Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a atividade da celulase por meio de medições de absorbância colormétrica usando um leitor de placas. Olá, sou Keith, do laboratório de Steven Hallam no Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade da Colúmbia Britânica. Hoje mostraremos um procedimento para a triagem funcional de alto rendimento de bibliotecas metagenômicas.

Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a atividade da biomin celulase de bibliotecas metagenômicas. Então vamos começar. Antes de iniciar este protocolo, prepare uma biblioteca metagenômica armazenada em um formato de placa de 384 poços.

Este estudo usou o vetor SMID de controle de cópia PCC one em combinação com células de e coli resistentes a Farge T um TRANSFECT max EPI 300 T resistente como host da biblioteca para iniciar este procedimento, remover as placas contendo a biblioteca de menos 80 graus Celsius e descongelá-las a 37 graus Celsius por aproximadamente 20 minutos. Enquanto isso, use o recurso de esterilização por luz UV no QIX two para esterilizar o robô por 15 minutos. Configure o Q fill three de acordo com as instruções do fabricante com o frasco de mídia conectado ao coletor por meio do programa de tubulação estéril.

O Q preenche três para a quantidade apropriada de mídia e configura-o para preencher um volume de 45 microlitros. Em cada um, purgue bem o ar da tubulação e do coletor usando o recurso de purga do robô até que a mídia esteja visível. Em cada pino do coletor, preencha o número desejado de placas com mídia LB usando o preenchimento Q três.

Cada prato leva aproximadamente 20 segundos para encher. Em seguida, coloque as placas da biblioteca e as placas novas nas áreas apropriadas das escolhas Q. Para o robô encher os banhos de limpeza com os reagentes apropriados.

2% micro 90 no banho traseiro, água destilada em autoclave no banho do meio e 80% de etanol no banho frontal. Usando o programa de replicação do qix two, selecione a cabeça apropriada, bem como o número e os tipos de placas de origem e destino. Configure também o cabeçote para limpar entre as replicações.

Normalmente, seis ciclos em cada banho são suficientes. A capacidade da máquina é de 10 placas por vez. Configure a máquina para funcionar.

Levará aproximadamente 15 minutos para replicá-lo. Capacidade total com uma cabeça de 384 pinos. Depois que as placas forem replicadas, cultive-as a 37 graus Celsius por 24 horas em uma caixa de umidade.

O longo tempo de incubação é necessário, pois um alto número de cópias de smid está sendo induzido com a adição de arabinose. Enquanto isso, limpe o robô Q fill three conforme descrito no protocolo escrito. Após a incubação, remova as placas da incubadora de 37 graus Celsius.

Separe as tampas e coloque as placas na plataforma de carregamento de revistas fornecida com a pilha rápida. Certifique-se de acompanhar a ordem das placas, pois o software não o faz. As placas na parte inferior da pilha serão lidas.

Primeiro, remova um carregador da pilha rápida. Certifique-se de que está vazio e empurre-o para a pilha de placas a serem lidas. Pegue o carregador pela alça e a placa deve ser carregada no carregador.

Carregue o carregador na pilha rápida na orientação correta. Abra a varredura e reprograme no computador conectado. Selecione nova sessão e nomeie-a adequadamente.

Escolha chamar a placa de fundo plano 384 Well como a placa. Digite na área de layout da placa. Selecione o botão do assistente e escolha-o para adicionar 384 incógnitas à placa.

Na área de protocolo, selecione a opção de loop de poço e insira para 384 poços. Um ícone de loop de poço aparecerá na árvore de fluxo no lado esquerdo da tela. Selecione o ícone e clique para adicionar medição fotométrica.

Configure-o para ler em 600 nanômetros. Salve o protocolo com um nome exclusivo e feche a varredura de seu reprograma. Em seguida, abra o programa polara RS.

Na página principal há uma tabela listando os instrumentos conectados ao dispositivo de pilha rápida sob o título de varredura VARI, clique na opção de sessão de execução. A janela de ensaio deve então aparecer com um fluxograma no meio. Selecione o item da sessão de execução e encontre o nome da verificação salva.

É executado novamente no menu suspenso que aparece no lado direito da tela. Depois que o protocolo for selecionado, clique em executar. Neste ensaio, uma caixa aparecerá perguntando qual revista usar como fonte e qual revista está vazia.

A caixa inferior na tela corresponde ao zine da revista frontal. Certifique-se de que a pilha rápida e a varredura do Vario estejam ativadas e clique em Iniciar. A pilha rápida carregará automaticamente as placas no leitor de placas, permitindo medições contínuas das placas.

Observe o carregamento da primeira placa na varredura Vario para garantir o alinhamento adequado das máquinas a serem lidas. 25 placas levam aproximadamente 50 minutos. Assim que a varredura de Barrios estiver concluída, remova o carregador cheio e coloque-o na plataforma de carregamento do carregador.

Levante o retângulo externo da plataforma e o carregador deve deslizar, deixando as placas em uma pilha no meio. Por fim, substitua as tampas das placas por uma tela baseada em solução. Para a atividade de celulose primeiro, prepare a mistura de ensaio usando um estoque pré-fabricado de 10 vezes de lise.

Misture tampão de acetato de potássio 50 milimolares a pH 5,5, conforme descrito no protocolo escrito. Em seguida, prepare um estoque de até 75 miligramas por mililitro, substrato biocida cromogênico DIFENIL ou DNP em DMSO, certificando-se de que o substrato esteja totalmente dissolvido. Adicione a solução estoque de biocida de células DNP à mistura de ensaio até uma concentração final de 0,1 miligramas por mililitro.

Lembre-se de que cada placa usa aproximadamente 20 mililitros de solução e são necessários 50 mililitros adicionais para permitir o volume morto. Configure o preenchimento Q três como antes na mistura de ensaio para cada placa usando o preenchimento Q três. Cada prato leva aproximadamente 20 segundos para encher.

Depois que a mistura de ensaio for adicionada, incube as placas a 37 graus Celsius por 12 a 16 horas. Em uma caixa de umidade, remova as placas da incubadora de 37 graus Celsius. Separe as tampas e coloque as placas na plataforma de carregamento de revistas fornecida com a pilha rápida da mesma maneira que antes.

Abra a varredura em seu programa re e configure-o como feito anteriormente, com exceção da medição fotométrica, que deve ser configurada para ler em 400 nanômetros. Em seguida, insira os parâmetros no programa POLARA RS. Como foi demonstrado anteriormente.

Permita que a digitalização Vario leia as placas. Após a execução, remova e descarte as placas. Para exportar as leituras de absorbância abertas, digitalize-o re software e escolha.

Abra um arquivo existente. Selecione o diretório onde a sessão foi salva e clique no ícone de adição para expandir a lista. Sob o título serão as opções rotuladas contêiner de um a contêiner N.Dependendo do número de placas, selecione a primeira placa a ser analisada na barra de menu na parte superior da página, selecione exportação de relatório de dados.

Escolha opções de exportação, como layout de placa e dados fotométricos. Clique em exibir relatório e em salvar arquivo. Escolha o diretório desejado.

O formato de saída é uma planilha do Microsoft Excel. Aqui, leituras de absorbância de um único 384. Placa de poço contendo um clone positivo, como mostrado clones positivos mostram um aumento acentuado na absorbância em comparação com clones que não expressam atividade de celulase.

Diferenças no tempo de ensaio, poço, localização na placa ou concentração de DNP podem afetar as leituras de absorbância absoluta. Leituras de absorbância relativa, como a diferença de absorbância acima da média da placa ou da coluna, são um método mais robusto de identificação de clones positivos para celulase. Acabamos de mostrar como identificar clones positivos de celulase de uma biblioteca metagenômica.

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de dissolver o lado biológico da célula DNP no DMSO e incubar as placas em uma câmara de umidade. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.