Identificar os efeitos das mutações BRCA1 em Recombinação Homóloga usando células que expressam BRCA1 tipo selvagem endógena

O objetivo geral do experimento a seguir é testar variantes específicas na proteína BRCA um usando um ensaio de recombinação homóloga in vitro. Isso é conseguido substituindo a proteína BRCA um do tipo selvagem endógeno pela variante que está sendo testada por meio da transfecção de RNA interferente curto, específico para BRCA um e plasmídeo para reexpressar proteínas variantes BRCA um de teste em células como uma segunda etapa, o RNA interferente curto e o plasmídeo para expressar BRCA mutante um é RET ressecado, além de um plasmídeo para expressar a proteína ISCE um, que causa danos ao DNA em um local específico no genoma do DNA da célula de teste. Em seguida, as células são incubadas por dois a três dias para permitir que ocorram danos ao DNA e o reparo, são obtidos resultados que mostram se variantes proteicas específicas da proteína BRCA uma função no reparo do DNA por recombinação homóloga com base na análise de citometria de fluxo de células que expressam GFP.

Esta técnica combina dois métodos estabelecidos para criar um sistema versátil para analisar variantes proteicas específicas no reparo de danos ao DNA por recombinação homóloga. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que os métodos previamente estabelecidos dependiam de linhagens celulares que tinham um nocaute genético de BRCA. Usamos uma linhagem celular mais gerenciável derivada de células HELOC que permite a depleção de BRC um por interferência de RNA da proteína endógena e adição de proteína de teste nessas células.

Agora, expressando uma variante da proteína BRC one, podemos testar a recombinação homóloga. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à morte celular excessiva durante o procedimento. É importante ter uma condição de transecção cuidadosamente definida, maximizando o efeito da reação de recombinação e limitando a citotoxicidade.

Antes do início deste protocolo, a linhagem celular hela DR 13 nove foi estabelecida por transsecção de células hela com P-D-R-G-F-P Mantenha a linha celular em placas de Petri de 10 centímetros em purmicina para seleção de células transfectadas de forma estável. O substrato de recombinação no plasmídeo P-D-R-G-F-P e nos transformantes estáveis contém dois alelos inativos de GFP. Um alelo está inativo devido à inclusão do local de reconhecimento da enzima de restrição de 18 pares de bases para ISCE um.

Em sua expressão de sequência de codificação de ISCE, uma dessas células cria uma quebra de DNA de fita dupla ou DSB no segundo alelo de GFP inativo. A porção de sua sequência correlacionada com o I SCE E um sítio no primeiro alelo é do tipo selvagem. Este segundo alelo GFP pode funcionar como um doador de sequência para reparo de recombinação homóloga do DSP e resultaria em um alelo GFP ativo, que é prontamente detectado por citometria de fluxo no dia anterior à primeira transfecção.

Obtenha um prato de 10 centímetros de hela DR 13 nove células com pelo menos 90% de tripsina confluente para as células em um mililitro por dois a três minutos. Pare a reação adicionando nove mililitros de D-M-E-M-F-B-S e misture bem a suspensão celular pipetando. Adicione 40 microlitros de células tripsinizadas por poço de uma placa de 24 poços em 0,5 mililitros de DMEMFBS incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite.

No primeiro dia, as células devem estar entre 40 e 50% confluentes. Comece a transfecção misturando o irna para esgotar o plasmídeo endógeno b RCA um e o mutante B RCA um expressando o plasmídeo em meio ideal. Em seguida, combine os ácidos nucléicos com o lábio em um meio ideal.

Prossiga com a transfecção da lipectomia de acordo com as instruções do fabricante após a transfecção. Retorne as células para incubar. Substitua o meio quatro a seis horas depois por um meio que não contenha antibióticos.

Retorne as células para incubar durante a noite no segundo dia. A tripsina é as células adicionando 0,3 mililitros de reagente de tripsina a cada poço após uma breve incubação a 37 graus Celsius, afrouxe as células pipetando as células para cima e para baixo no reagente de tripsina. Uma vez que a tripsina é transferida as células da placa de 24 poços para uma placa de seis poços contendo dois mililitros de D-M-E-M-F-B-S para interromper a atividade das tripsinas.

Deixe a placa de seis poços incubar durante a noite nas mesmas condições de antes, dois dias após a transfecção inicial. Prepare o SIR A, o mutante BRCA que expressa DNA plasmático e o ISCE que expressa plasmídeo em 62,5 microlitros de Optum. Misture esta solução com 2,5 microlitros de LIPECTOMIA 2060 2,5 microlitros de Optum.

Prossiga para transfectar as células após uma incubação de quatro a seis horas. Substitua a mídia por D-M-E-M-F-P-S sem antibióticos. Devolva as células à incubadora no sexto dia.

A tripsina são as células em cada poço, adicionando 0,5 mililitros de reagente de tripsina tripa. Pare a reação adicionando dois mililitros de D-M-E-M-F-B-S colete as células por centrifugação a 1000 RPM por cinco minutos à temperatura ambiente. Ressuspenda as células em um mililitro de D-M-E-M-F-B-S fresco e analise 10.000 células por poço para a expressão de GFP.

Por citometria de fluxo, células vivas individuais são fechadas usando parâmetros de dispersão direta e de tamanho. As células GFP positivas são direcionadas usando o detector de fluorescência GFP e os resultados são apresentados como um histograma. As células restantes podem ser replaqueadas para fotografia por fluorescência.

A microscopia do BRCA desejado regula a via de reparo de quebras de DNA de fita dupla por recombinação homóloga. As células que foram submetidas a reparo por recombinação homóloga são prontamente detectadas por microscopia fluorescente. A depleção de BRCA one por RNAi resulta em uma diminuição acentuada nas células GFP positivas detectadas.

A saída do FCA é um histograma com intensidade de GFP por célula no eixo x e o número de células no eixo Y. Na ausência de plasmídeo transfectado, eu SCE um expressando plasmídeo. Não há células positivas para GFP detectadas.

Os resultados nas colunas dois a seis foram todos retirados de células nas quais o plasmídeo expressor ISC um foi transfectado no terceiro dia. Em um conjunto típico de resultados de um único experimento, 15,5% das células são GFP positivas após a expressão de I SCE um e controlam a depleção de RNAi para um gene irrelevante por comparação com a depleção de BRCA um e adição de um vetor de plasmídeo vazio. Reduzir a conversão de GFP para 0,7% Adição de BRCA de tipo selvagem exógeno uma recombinação homóloga totalmente restaurada, conforme detectado pela obtenção de 15 a 16% de células positivas para GFP.

Da mesma forma, expressão de outra variante de significado desconhecido. A mutação BRCA one I 21 B foi totalmente restaurada. BRCA uma função de recombinação homóloga dependente adicionar de volta do BRCA um mutante M 18 T teve um efeito semelhante ao controle vetorial.

Uma vez que esta variante se expressa em níveis semelhantes aos da proteína endógena, sugere que a variante BRCA one M 18 T não é funcional na recombinação homóloga. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de monitorar o crescimento das células, que as células estão crescendo lentamente e em baixa fluência de conf e a quantidade de mistura de transfecção usada deve ser reduzida. Também é importante remover o meio de transfecção em tempo hábil.

Descobrimos que nos dias seguintes à transfecção, há uma grande quantidade de citotoxicidade se os antibióticos forem incluídos no meio. Por esta razão, todos os meios após o primeiro dia carecem de antibióticos após o seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da pesquisa do câncer de mama explorarem a genética das variantes do BRC um com significado clínico desconhecido em clínicas de câncer.

Esperamos que o ensaio funcional BRC one desenvolvido neste trabalho permita uma melhor previsão dos efeitos das variantes BRC one na predisposição ao câncer.