Identificar os efeitos das mutações BRCA1 em Recombinação Homóloga usando células que expressam BRCA1 tipo selvagem endógena

O objetivo geral do experimento a seguir é testar variantes específicas na proteína BRCA1 utilizando um ensaio in vitro de recombinação homóloga. Isso é realizado substituindo a proteína BRCA1 de tipo selvagem endógena pela variante em teste por meio da transfeção de RNA interferente curto, específico para BRCA1, e de um plasmídeo para reexpressar as proteínas variantes de BRCA1 testadas nas células. Como segundo passo, o RNA interferente curto e o plasmídeo para expressar a variante mutante de BRCA1 são cotransfectados, juntamente com um plasmídeo para expressar a proteína I-SceI, que induz dano no DNA em um local específico do genoma da célula-teste. Em seguida, as células são incubadas por dois a três dias para permitir que ocorram o dano e a reparação do DNA. Os resultados obtidos demonstram se variantes proteicas específicas da proteína BRCA1 exercem função na reparação do DNA por recombinação homóloga, com base na análise por citometria de fluxo de células que expressam GFP.

Esta técnica combina dois métodos estabelecidos para criar um sistema versátil para analisar variantes proteicas específicas no reparo de danos no DNA por recombinação homóloga. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que os métodos previamente estabelecidos dependiam de linhagens celulares com uma inativação genética do BRCA1. Utilizamos uma linhagem celular mais manejável derivada de células HELOC que permite a diminuição do BRCA1 por interferência de RNA da proteína endógena e a reintrodução da proteína de teste nessas células.

Agora, expressando uma variante da proteína BRC1, podemos testar a recombinação homóloga. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido à morte celular excessiva durante o procedimento. É importante ter uma condição de transfeção cuidadosamente ajustada, maximizando o efeito da reação de recombinação ao mesmo tempo em que se limita a citotoxicidade.

Antes do início deste protocolo, a linhagem celular hela DR 13 nove foi estabelecida por meio da transfeção de células hela com o plasmídeo P-D-R-G-F-P. Mantenha a linhagem celular em placas de Petri de 10 centímetros com puromicina para seleção de células estavelmente transfectadas. O substrato de recombinação no plasmídeo P-D-R-G-F-P e nos transformantes estáveis contém dois alelos inativos de GFP. Um dos alelos é inativo devido à inclusão do sítio de reconhecimento de enzima de restrição de 18 pares de bases para a ISCE um.

Na sua sequência codificadora, a expressão de ISCE um nessas células cria uma quebra de DNA de dupla fita, ou DSB, no segundo alelo de GFP inativo. A porção de sua sequência correlacionada ao sítio I SCE E um no primeiro alelo é do tipo selvagem. Esse segundo alelo de GFP pode funcionar como doador de sequência para reparo por recombinação homóloga do DSP e resultaria em um alelo de GFP ativo, que é facilmente detectado por citometria de fluxo no dia anterior à primeira transfeção.

Obtenha uma placa de 10 centímetros com células HeLa DR13-9 que estejam com pelo menos 90% de confluência. Incube as células com tripsina em um mililitro por dois a três minutos. Interrompa a reação adicionando nove mililitros de D-MEM-FBS e homogeneíze bem a suspensão celular por pipetagem. Adicione 40 microlitros das células tripsinizadas por poço de uma placa de 24 poços em 0,5 mililitros de D-MEM-FBS. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite.

No primeiro dia, as células devem estar entre 40 e 50% confluentes. Inicie a transfeção misturando o RNAi para esgotar o bRCA1 endógeno e o plasmídeo que expressa a mutante bRCA1 em meio ótimo. Em seguida, combine os ácidos nucleicos com lip em meio ótimo.

Prossiga com a transfeção por lipofecção conforme as instruções do fabricante após a transfeção. Retorne as células para incubação. Substitua o meio quatro a seis horas depois por um meio que não contenha antibióticos.

Retorne as células para incubação durante a noite no segundo dia. Desses as células com tripsina, adicionando 0,3 mililitros do reagente triplo tripsina a cada poço após uma breve incubação a 37 graus Celsius, soltando as células pipetando-as para cima e para baixo no reagente de tripsina. Assim que a tripsina agir, transfira as células da placa de 24 poços para uma placa de seis poços contendo dois mililitros de D-M-E-M-F-B-S para interromper a atividade da tripsina.

Deixe a placa de seis poços incubar durante a noite nas mesmas condições de dois dias após a transfeção inicial. Prepare o SIR A, o DNA plasmidial mutante BRCA1 e o plasmídio expressante ISCE1 em 62,5 microlitros de Optum. Misture esta solução com 2,5 microlitros de LIPECTOMY 2060 e 2,5 microlitros de Optum.

Prossiga com a transfeção das células após uma incubação de quatro a seis horas. Substitua o meio por D-M-E-M-F-P-S sem antibióticos. Retorne as células ao incubador no sexto dia.

A tripsina é adicionada às células em cada poço mediante 0,5 mililitros do reagente tripsina-tripsina. Interrompa a reação adicionando dois mililitros de D-M-E-M-F-B-S e colete as células por centrifugação a 1000 RPM durante cinco minutos à temperatura ambiente. Resuspenda as células em um mililitro de D-M-E-M-F-B-S fresco e analise 10.000 células por poço quanto à expressão de GFP.

Por citometria de fluxo, células vivas individuais são selecionadas utilizando parâmetros de dispersão direta e de tamanho. As células positivas para GFP são detectadas com o detector de fluorescência de GFP e os resultados são apresentados como um histograma. As células restantes podem ser replacadas para fotografia por fluorescência.

A microscopia do BRCA1 desejado regula a via de reparo de quebras de DNA de dupla fita por recombinação homóloga. As células que sofreram reparo por recombinação homóloga são facilmente detectadas por microscopia fluorescente. O esgotamento do BRCA1 por RNAi resulta em uma acentuada diminuição nas células positivas para GFP detectadas.

A saída da AFC é um histograma com a intensidade de GFP por célula no eixo X e o número de células no eixo Y. Na ausência do plasmídeo transfectado expressando I SCE, nenhuma célula positiva para GFP é detectada.

Os resultados nas colunas de dois a seis foram todos obtidos de células nas quais o plasmídeo que expressa ISC um foi transfectado no terceiro dia. Em um conjunto típico de resultados provenientes de um único experimento, 15,5% das células são positivas para GFP após a expressão de ISC um e esgotamento por RNAi controle para um gene irrelevante; em comparação, o esgotamento de BRCA um e a adição de um vetor plasmidial vazio reduziram a conversão GFP para 0,7%. A adição de BRCA um exógeno selvagem restaurou completamente a recombinação homóloga, conforme detectado pela obtenção de 15 a 16% de células positivas para GFP.

Da mesma forma, a expressão de outra variante de significado desconhecido. A mutação BRCA1 I21B restaurou completamente a função de recombinação homóloga dependente de BRCA1. A reintrodução do mutante BRCA1 M18T teve um efeito semelhante ao controle com vetor.

Como esta variante é expressa em níveis semelhantes ao da proteína endógena, isso sugere que a variante BRCA1 M18T é não funcional na recombinação homóloga. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de monitorar o crescimento das células, de que as células estão crescendo lentamente e com baixa confluência, e de que a quantidade de mistura de transfeção utilizada deve ser reduzida. Também é importante remover o meio de transfeção em tempo hábil.

Observamos que nos dias seguintes à transfeção, há uma alta quantidade de citotoxicidade se antibióticos forem incluídos no meio. Por esse motivo, todo o meio após o primeiro dia não contém antibióticos após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de pesquisa do câncer de mama explorarem a genética de variantes do BRC um com significado clínico desconhecido nas clínicas oncológicas.

Esperamos que o ensaio funcional de BRC um desenvolvido neste trabalho permita uma predição aprimorada dos efeitos das variantes de BRC um na predisposição ao câncer.