Purificação de DNA plasmidial colônias bacterianas Usando o Kit Qiagen Miniprep

Sou do laboratório de Mike Halen, Departamento de Fisiologia e Biofísica, Universidade da Califórnia, Irvine. Hoje vou mostrar como usar o mini kit de colágeno para purificar DNA de bactérias. Estou realizando este procedimento como uma etapa de um experimento de mutagênese direcionada a sítios.

Após obter o plasmídeo, sequenciarei o inserto para verificar se as linhagens selecionadas contêm as mutações desejadas. Antes de realizarmos a mini-preparação, vamos recapitular brevemente o que fizemos ontem. Para cultivar as bactérias, preciso primeiro inocular cinco mililitros de LB-A em tubos separados.

E, como você pode ver, antes de colocarmos bactérias no tubo, o meio está claro. Em seguida, uso uma alça de PERS para inocular uma única colônia de uma placa de ágar e troco a ponteira a cada vez para evitar contaminação. Depois, coloco os tubos em um agitador e os deixo crescer a 300 RPM por pelo menos oito horas, normalmente durante a noite.

Existem três tampões importantes do kit de mini preparação de colágeno. Eles são P um, P dois e N três. Normalmente, colocamos P um a quatro graus porque contém RNAs; P dois deixamos em temperatura ambiente; e para N três, nós o pré-aquecemos logo antes do experimento, após oito horas.

Como você pode ver, o meio agora está turvo porque há bactérias crescendo no interior, e eu vou transferir cinco microlitros do meio para outra placa. Assim, uma vez que eu verifique as colônias, poderei voltar diretamente às bactérias, sem precisar realizar outra transformação. Após centrifugarmos o meio, você pode observar um bom pellet bacteriano no fundo do tubo, e removeremos o sobrenadante para a água sanitária, a fim de evitar qualquer contaminação do ambiente, enquanto o pellet permanece intacto.

Agora adiciono o tampão P1 aos pellet bacterianos. O tampão P1 é um tampão de ressuspensão para ressuspender as bactérias. Em seguida, pipeto a solução para cima e para baixo para homogeneizar as bactérias com o tampão.

Nesta etapa, você não deseja ver nenhuma paleta bacteriana na solução. Agora vou transferir as bactérias resus bender para um novo tubo de eppendorf. Sempre rotulo meus tubos para poder rastreá-los e saber de qual clone veio cada solução.

Agora adicionei o tampão P2 a cada tubo, e o tampão P2 é um tampão de lise para lisar as bactérias. Após adicionar o tampão P2, pode-se observar que a solução ainda não está clara. Agora inverti todos os tubos várias vezes para que a solução se misture bem.

E agora você pode ver que a solução fica clara. Agora adiciono o tampão N três e, a cada tubo, o tampão M três, que é o tampão de neutralização. Assim que adiciono o tampão N três, imediatamente observo a precipitação das proteínas, mas ainda inverto os tubos várias vezes para misturar completamente a solução.

Depois de misturarmos bem a solução. É assim que deve ficar após eu adicionar o tampão e três. Agora vou usar o sge para centrifugar a precipitação da proteína durante 10 minutos. Monte um Cal VAC seis s.

Coloco todas as peças em ordem e, em seguida, as conecto a um sistema de vácuo. Agora fixo o auxílio para o preparo do cal, a correia ao coletor. Hoje faremos apenas um, então bloqueio os outros orifícios.

Então, temos um bom vácuo. Como você pode ver, identifiquei a fita de acordo com os meus tubos e, assim que ligo o vácuo, obtenho um bom vácuo. Ok, após centrifugar o tubo, é possível observar o pellet proteico no fundo, enquanto o DNA deve permanecer dissolvido no sobrenadante.

Agora nossa transferência, o sobrenadante, que contém DNA, para as fitas de preparo de vaca, devo mencionar que sempre precisamos trocar as ponteiras para prevenir contaminação cruzada. Agora ligo o vácuo. Agora desligo o vácuo e adiciono o tampão PB para lavar a fita, que no momento contém DNA no filtro.

Agora adiciono a solução PB à tira para lavá-la, e as tiras ainda contêm DNA no filtro. Desta vez, não preciso trocar as ponteiras se não tocar na tira. Agora adiciono o tampão P à tira da mesma forma que fiz com o tampão PB.

E farei isso duas vezes após ligar o vácuo. Como você pode ver, a solução P está passando pelo suporte no momento, e deixaremos o vácuo ligado por mais cinco minutos para garantir que o filtro fique bem seco. Após cinco minutos de vácuo, retire a tira da caixa e envolva-a com papel Kimwipe. Bata-a contra a mesa para remover o resíduo do tampão P.

E agora você pode ver que não há muitas gotas da tampa do tampão P e o DNA ainda deve estar no filtro. Aqui estão os microtubos de coleta. Eu os rotulei de acordo com a tira.

Agora abro o vácuo do carro e remonto-o com os microtubos de coleta, certificando-me de que as abas correspondam aos microtubos. Assim é como o manifold deve estar agora. Veja como está o manifold a vácuo, preparado para eluir o DNA da tira para o microtubo.

A tira está na parte superior e o tubo está logo abaixo, identificado da mesma maneira. Agora, adicione água estéril à tira sem aplicar vácuo e deixe repousar por um minuto. Desta vez, quando o vácuo é prolongado, como é possível observar, a água atravessa a tira e entra nos microtubos de coleta.

A água contém o DNA. Também mantenho o vácuo ligado por um tempo para garantir que toda a água seja coletada. Aqui estão os microtubos de coleta com a solução de DNA após esta etapa.

Olá, acabei de mostrar como usar o kit de mini preparação de cálcio para purificar ácidos nucleicos de bactérias. Agora sequenciei o inserto para verificar os clones corretos, e devo mencionar o uso deste método. A quantidade de DNA geralmente está na faixa do micrograma.

Boa sorte com seus experimentos. Obrigado por assistir.