Name: Purificação de DNA plasmidial colônias bacterianas Usando o Kit Qiagen Miniprep (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprenda a purificar DNA plasmidial de colônias bacterianas usando o kit Qiagen Miniprep. Este método demonstra extração eficiente para mutagênese dirigida e preparação de amostras para sequenciamento.

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Os autores não têm nada a declarar.

purificação de dna plasmidial colônias bacterianas usando o kit qiagen miniprep

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Purificação de DNA plasmidial de E. coli é uma técnica de núcleo para clonagem molecular. Purificação de pequena escala (miniprep) de menos de 5 ml de cultura bacteriana é uma maneira rápida para verificação clone ou o isolamento do DNA, seguida por outras reações enzimáticas (reação em cadeia da polimerase e digestão enzima de restrição). Aqui, vídeo-gravados os procedimentos gerais de miniprep através QIAprep a QIAGEN Kit Miniprep 8, com o objetivo de introduzir esta técnica altamente eficiente para os novatos em geral para técnicas de biologia molecular. Todo o procedimento é baseado em lise alcalina de células de E. coli seguido por adsorção de DNA em sílica na presença de sal. Ele consiste de três etapas: 1) preparação e limpeza de um lisado bacteriano, 2) adsorção de DNA para a membrana QIAprep, 3) lavagem e eluição do DNA plasmidial. Todas as etapas são realizadas sem o uso de fenol, clorofórmio, CsCl, brometo de etídio, e sem precipitação álcool. Ele normalmente leva menos de 2 horas para terminar todo o procedimento.

Purificação de DNA plasmidial colônias bacterianas Usando o Kit Qiagen Miniprep

A purificação de DNA plasmidial de E. coli é uma técnica fundamental para a clonagem molecular. A purificação em pequena escala (miniprep) a partir de menos de 5 ml de cultura bacteriana...

Sou do laboratório de Mike Halen, Departamento de Fisiologia e Biofísica, Universidade da Califórnia, Irvine. Hoje vou mostrar como usar o mini kit de colágeno para purificar DNA de bactérias. Estou realizando este procedimento como uma etapa de um experimento de mutagênese direcionada a sítios.Após obter o plasmídeo, sequenciarei o inserto para verificar se as linhagens selecionadas contêm as mutações desejadas. Antes de realizarmos a mini-preparação, vamos recapitular brevemente o que fizemos ontem. Para cultivar as bactérias, preciso primeiro inocular cinco mililitros de LB-A em tubos separados.E, como você pode ver, antes de colocarmos bactérias no tubo, o meio está claro. Em seguida, uso uma alça de PERS para inocular uma única colônia de uma placa de ágar e troco a ponteira a cada vez para evitar contaminação. Depois, coloco os tubos em um agitador e os deixo crescer a 300 RPM por pelo menos oito horas, normalmente durante a noite.Existem três tampões importantes do kit de mini preparação de colágeno. Eles são P um, P dois e N três. Normalmente, colocamos P um a quatro graus porque contém RNAs; P dois deixamos em temperatura ambiente; e para N três, nós o pré-aquecemos logo antes do experimento, após oito horas.Como você pode ver, o meio agora está turvo porque há bactérias crescendo no interior, e eu vou transferir cinco microlitros do meio para outra placa. Assim, uma vez que eu verifique as colônias, poderei voltar diretamente às bactérias, sem precisar realizar outra transformação. Após centrifugarmos o meio, você pode observar um bom pellet bacteriano no fundo do tubo, e removeremos o sobrenadante para a água sanitária, a fim de evitar qualquer contaminação do ambiente, enquanto o pellet permanece intacto.Agora adiciono o tampão P1 aos pellet bacterianos. O tampão P1 é um tampão de ressuspensão para ressuspender as bactérias. Em seguida, pipeto a solução para cima e para baixo para homogeneizar as bactérias com o tampão.Nesta etapa, você não deseja ver nenhuma paleta bacteriana na solução. Agora vou transferir as bactérias resus bender para um novo tubo de eppendorf. Sempre rotulo meus tubos para poder rastreá-los e saber de qual clone veio cada solução.Agora adicionei o tampão P2 a cada tubo, e o tampão P2 é um tampão de lise para lisar as bactérias. Após adicionar o tampão P2, pode-se observar que a solução ainda não está clara. Agora inverti todos os tubos várias vezes para que a solução se misture bem.E agora você pode ver que a solução fica clara. Agora adiciono o tampão N três e, a cada tubo, o tampão M três, que é o tampão de neutralização. Assim que adiciono o tampão N três, imediatamente observo a precipitação das proteínas, mas ainda inverto os tubos várias vezes para misturar completamente a solução.Depois de misturarmos bem a solução. É assim que deve ficar após eu adicionar o tampão e três. Agora vou usar o sge para centrifugar a precipitação da proteína durante 10 minutos. Monte um Cal VAC seis s.Coloco todas as peças em ordem e, em seguida, as conecto a um sistema de vácuo. Agora fixo o auxílio para o preparo do cal, a correia ao coletor. Hoje faremos apenas um, então bloqueio os outros orifícios.Então, temos um bom vácuo. Como você pode ver, identifiquei a fita de acordo com os meus tubos e, assim que ligo o vácuo, obtenho um bom vácuo. Ok, após centrifugar o tubo, é possível observar o pellet proteico no fundo, enquanto o DNA deve permanecer dissolvido no sobrenadante.Agora nossa transferência, o sobrenadante, que contém DNA, para as fitas de preparo de vaca, devo mencionar que sempre precisamos trocar as ponteiras para prevenir contaminação cruzada. Agora ligo o vácuo. Agora desligo o vácuo e adiciono o tampão PB para lavar a fita, que no momento contém DNA no filtro.Agora adiciono a solução PB à tira para lavá-la, e as tiras ainda contêm DNA no filtro. Desta vez, não preciso trocar as ponteiras se não tocar na tira. Agora adiciono o tampão P à tira da mesma forma que fiz com o tampão PB.E farei isso duas vezes após ligar o vácuo. Como você pode ver, a solução P está passando pelo suporte no momento, e deixaremos o vácuo ligado por mais cinco minutos para garantir que o filtro fique bem seco. Após cinco minutos de vácuo, retire a tira da caixa e envolva-a com papel Kimwipe. Bata-a contra a mesa para remover o resíduo do tampão P.E agora você pode ver que não há muitas gotas da tampa do tampão P e o DNA ainda deve estar no filtro. Aqui estão os microtubos de coleta. Eu os rotulei de acordo com a tira.Agora abro o v&aacute;cuo do carro e remonto-o com os microtubos de coleta, certificando-me de que as abas correspondam aos microtubos. Assim &eacute; como o manifold deve estar agora. Veja como est&aacute; o manifold a v&aacute;cuo, preparado para eluir o DNA da tira para o microtubo.A tira está na parte superior e o tubo está logo abaixo, identificado da mesma maneira. Agora, adicione água estéril à tira sem aplicar vácuo e deixe repousar por um minuto. Desta vez, quando o vácuo é prolongado, como é possível observar, a água atravessa a tira e entra nos microtubos de coleta.A água contém o DNA. Também mantenho o vácuo ligado por um tempo para garantir que toda a água seja coletada. Aqui estão os microtubos de coleta com a solução de DNA após esta etapa.Olá, acabei de mostrar como usar o kit de mini preparação de cálcio para purificar ácidos nucleicos de bactérias. Agora sequenciei o inserto para verificar os clones corretos, e devo mencionar o uso deste método. A quantidade de DNA geralmente está na faixa do micrograma.Boa sorte com seus experimentos. Obrigado por assistir.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo é uma alternativa rentável para o esclarecimento paralela eficiente e purificação de DNA plasmidial...

Purificação simplificada do DNA plasmidial das culturas Procarióticas

Nós descrevemos um método robusto para cromatina imunoprecipitação utilizando células T primárias. O método baseia-se em métodos normais, mas utiliza um conjunto específico de condições e reagentes que melhoram a eficiência de uma quantidade limitada de células. Importante, é apresentada uma descrição detalhada da fase de análise de dados.

Imunoprecipitação da Cromatina eficiente usando Limitando quantidades de biomassa

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Um método de extração de DNA híbrido para a Avaliação de comunidades bacterianas Qualitativa e Quantitativa de amostras de produção de aves de capoeira

O minivetor de DNA linear covalentemente fechado (LCC) (ministring de DNA) é um vetor de entrega de genes não viral que oferece alta eficiência de transfecção e é relevante para qualquer aplicação de entrega de DNA. O sistema de produção é simples, rápido e escalável in vivo. O protocolo a seguir fornece instruções visuais passo a passo para a produção de ministrings de DNA.

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Este artigo apresenta um método sensível chamado Circle-Seq para purificar o DNA circular extracromossômico (eccDNA). O método abrange purificação de coluna, remoção de DNA cromossômico linear restante, amplificação de círculo rolante e sequenciamento de alto rendimento. O Circle-Seq é aplicável à triagem em escala genômica de eccDNA eucariótico e ao estudo da instabilidade do genoma e da variação do número de cópias.

A purificação de todo o genoma de DNA circular Extracromossômica de células eucarióticas

Aqui, apresentamos a montagem de quimera por recuperação de plasmídeo e inserção de site de enzima de restrição (CAPRRESI), um protocolo baseado na inserção de sites de enzimas de restrição em seqüências de DNA sinônimo e recuperação de plasmídeo funcional. Este protocolo é um método rápido e de baixo custo para a fusão de genes que codificam proteínas.

CAPRRESI: montagem de quimera por recuperação de plasmídeos e restrição de inserção do site enzimático

Este protocolo descreve o transfection do plasmídeo da elevado-produção de pilhas de mamíferos em uma placa 384-well usando a tecnologia acústica da ejeção da gota. O tempo-demorado, erro-propenso a dispensar e Multiplexing do ADN, mas igualmente a dispensação do reagente do transfection, são software-driven e executado por um dispositivo do nanodispenser. As células são então semeadas nestes poços pré-preenchidos.

Multiplexação e transfecção de plasmídeo de DNA de alta produtividade usando tecnologia de Nanodosagem acústica

Aqui, apresentamos protocolos para trabalhar com Limosilactobacillus reuteri DSM20016, detalhando crescimento, transformação plasmidial, PCR de colônias, medição de proteína repórter fluorescente e mini-preparação limitada de plasmídeos, bem como problemas comuns e solução de problemas. Esses protocolos permitem a medição de proteínas repórteres em DSM20016, ou a confirmação via PCR de colônia se nenhum repórter estiver envolvido.

Métodos para Confirmação de Eletroporação e Transformação em Limosilactobacillus reuteri DSM20016

O vírus adenoassociado recombinante (rAAV) é amplamente utilizado para liberação clínica e pré-clínica de genes. Um uso subestimado para rAAVs é a transdução robusta de células cultivadas sem a necessidade de purificação. Para pesquisadores iniciantes no rAAV, fornecemos um protocolo para clonagem de transgênico, produção bruta de vetores e transdução de cultura celular.

Expressão de Transgenes em Células Cultivadas Usando Vetores Virais Adenoassociados Recombinantes Não Purificados

O estudo atual descreve um fluxo de trabalho para sequenciamento nanoporoso de plasmídeos quando a sequência cromossômica já é conhecida ou não tem interesse. Uma etapa inicial de enriquecimento de DNA plasmídico garante a profundidade ótima da sequência plasmídica e maximiza o número de amostras que podem ser sequenciadas por célula de fluxo.

Sequenciamento e montagem de plasmídeos de leitura longa usando fluxos de trabalho baseados em sequenciamento nanopore

Aprenda a purificar DNA plasmidial de colônias bacterianas usando o kit Qiagen Miniprep. Este método demonstra extração eficiente para mutagênese dirigida e preparação de amostras para sequenciamento.

Purificação de DNA plasmidial colônias bacterianas Usando o Kit Qiagen Miniprep

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