Name: Cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Aprenda a cristalização de proteínas de membrana em fase lipídica cúbica para determinação estrutural por cristalografia de raios X. Este método utiliza ensaios LCP-FRAP para otimizar condições e obter cristais de alta qualidade.

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Este trabalho foi financiado em partes pelo NIH concede GM073197 e RR025336.

Um esquema típico de um experimento em meso cristalização é mostrado na Fig.1 1,2. Pré-cristalização LCP FRAP-ensaios são opcionais, no entanto, eles podem acelerar significativamente o processo de busca de condições de cristalização inicial, especialmente no caso de proteínas da membrana difícil 3. 1. Reconstituição de proteínas em LCP <ol><li> Purificar uma proteína de membrana de interesse em uma solução de detergente e concentrar a complexos de proteína / detergente para ~ 10 - 20 mg / mL, tomando cuidado para não sobre-concentrar a 1,4 detergente. </li><li> Transferência de ~ 25 mg de um lipídio anfitrião LCP (tipicamente monoolein) ou uma mistura de lipídios em um tubo de 1,5 mL de plástico e incubar a 40 ° C por alguns minutos até que os lipídios se derrete. </li><li> Anexar um acoplador de seringa para uma seringa de 100 mL à prova de gás. </li><li> Carregar a seringa com a lipídios fundido usando uma pipeta de volume ajustável. Registrar o volume dos lipídios na seringa. </li><li> Carregar outro seringa de 100 L com a solução de proteína em uma proteína relação de solução em lipídeos 03/02 v / v. </li><li> Conectar ambas as seringas em conjunto, através do acoplador seringa. </li><li> Empurre a seringa êmbolos alternadamente para mover a lipídios e proteínas, através da agulha interior do engate, e para trás, até que a mesofase lipídios torna-se homogênea. LCP formas espontaneamente ao mistura mecânica, ea proteína torna-se reconstituído na bicamada lipídica da LCP. Formação de LCP pode ser verificada por sua consistência transparente e gel-like e pela ausência de birrefringência quando visto sob um microscópio equipado com cross-polarizadores, ou, se possível, usando pequeno ângulo de difração de raios-X 1. </li></ol> 2. LCP-FRAP pré-cristalização Ensaios LCP-FRAP testes são projetados para medir as propriedades de difusão de proteínas da membrana reconstituída em LCP em uma variedade de condições de triagem 3. A difusão de longo alcance de proteínas da membrana em LCP é essencial para a cristalização de sucesso, no entanto, a microestrutura do LCP restringe a difusão de proteínas ou grandes agregados da proteína oligomérica. Uma razão comum para o fracasso de um experimento em meso cristalização é uma agregação de proteínas rápida levando a uma perda de difusão. Tem sido demonstrado que o comportamento de agregação de uma proteína depende da construção de determinada proteína, lipídios do hospedeiro e da composição da solução de triagem 3. <ol><li> Rótulo a proteína com um corante fluorescente (Cy3 ou similar) na proporção de proteína / tintura de ~ 100 / 1, remover o corante não reagido e concentrar a proteína ~ 1 mg / mL. Rótulo ou aminas livres ou tióis livres. Quando rotulagem aminas livres, use pH entre 7 e 7,5 a etiqueta predominantemente livre N-terminal. Esteja ciente de que a rotulagem amino também pode rótulo lipídios co-purificada com a proteína 2,3. </li><li> Reconstituir a proteína rotulados de LCP, conforme descrito na seção 1). </li><li> Configurar placas de ensaio como descrito na seção 3) usando soluções LCP-FRAP triagem em vez de telas de cristalização 2. </li><li> Incubar as placas a 20 ° C no escuro por pelo menos 12 horas para alcançar um estado de equilíbrio. </li><li> Coloque uma das placas na estação LCP-FRAP e foco no primeiro poço usando uma objetiva de 10x. </li><li> Aquisição de 5 imagens fluorescentes para capturar o estado pré-branqueada inicial. </li><li> Acionar o laser. A potência do laser e do número de pulsos deve ser ajustada para bleach ~ 30 - 70% da proteína rotulado no meio da mancha branqueada. </li><li> Imediatamente após o disparo do laser, iniciar a gravação de uma seqüência de pós-clareamento rápido de ~ 200 imagens a uma taxa mais rápida possível. </li><li> Siga com a gravação de uma seqüência de pós-bleach-lenta de ~ 50 imagens, selecionando a demora entre imagens como s 20/01, dependendo da taxa de difusão da proteína. </li><li> Integrar a intensidade dentro do local de lixívia em todos os quadros e corrigi-lo para o branqueamento ea luz flutuações de intensidade durante a aquisição, dividindo a intensidade dentro do local branqueada pela intensidade média de um ponto de referência fora da área de laser branqueada. </li><li> Normalizar a intensidade corrigida para tornar a intensidade pré-branqueada igual a 1 e a intensidade inicial branqueada igual a 0. </li><li> O traçado da curva da intensidade normalizada em função do tempo, F (t), usando a seguinte equação 5: F (t) = M x exp (-2T / t) x (I 0 (2T / t) + I 1 (2T / t)), (Eq.1) onde M é a fração de moléculas de difusão móvel, T é o tempo de difusão característico, t é o tempo real de cada quadro gravado, I 0 e I 1 são os dias 0 e 1 ª ordem modificado funções de Bessel. </li><li> Calcular o coeficiente de difusão, D, como: D = R 2 / 4T, (Eq.2) onde R é o raio da mancha branqueada. </li><li> Mover to bem próxima e repita os passos 2.5) - 2.13). </li><li> Compare as frações móvel e coeficientes de difusão obtidos para as condições de seleção diferentes. Concepção nova cristalização telas com base nos componentes que facilitaram a difusão de proteínas e as condições de exclusão para o qual a difusão de proteína não foi observada. Se a proteína não difusa em qualquer uma das condições selecionadas, considerar ampliando o espaço de triagem ou tentando construir uma nova proteína. </li></ol> 3. Configurando Trials Cristalização LCP <ol><li> Proteína em reconstituir a LCP, conforme descrito na seção 1). </li><li> Transferir a LCP proteína-laden em uma seringa de 10 mL à prova de gás ligado a uma seringa dispenser repetitivo. </li><li> Anexar uma pequena agulha removível (calibre 26, 10 mm de comprimento) para a seringa de 10 mL. </li><li> Dispense 200 nL bolo de LCP na superfície de quatro poços adjacentes formando um quadrado 2x2. </li><li> Sobreposição de cada um dos bolos LCP com 1 mL de solução correspondente a cristalização tela. </li><li> Cap quatro poços carregado com uma lamela de vidro 18 milímetros quadrados. Aplique uma pressão suave sobre as lamelas para selar os poços. </li><li> Repita os passos 3,4) -3,6) com o próximo conjunto de 4 poços até a placa inteira está cheia. </li><li> Incubar a placa a uma temperatura constante, verificando periodicamente a formação de cristais e crescimento. </li></ol> 4. Cristais colheita de LCP <ol><li> Coloque um prato com cristais de proteínas sob um microscópio estéreo com zoom variável, equipado com um polarizador e analisador linear de rotação. </li><li> Concentre-se no bem de interesse usando um zoom de baixa potência para que o bem geral é colocado dentro do campo de visão. </li><li> Pontuação do vidro lamela em quatro cursos fazendo um quadrado dentro dos limites bem usando um canto de uma pedra afiada corte de cerâmica capilar. </li><li> Imprensa em torno do perímetro marcou com fortes sharp-ponto pinças para propagar os riscos através da espessura do vidro lamela. </li><li> Faça dois pequenos furos em cantos opostos do quadrado marcado. </li><li> Injetar mL de solução precipitante poucos através de um dos buracos para reduzir a desidratação durante as etapas subseqüentes. </li><li> Usando uma sonda de agulha em ângulo agudo quebrar o vidro ao longo de um ou dois lados para liberar a praça cut-out. </li><li> Cuidadosamente levante a assistir quadrados de vidro para o bolo fase cúbicos. Se o bolo está preso à lamela, em seguida, virar o quadrado de vidro e coloque no fundo do poço. </li><li> Adicionar um extra alguns mL de solução precipitante, completada com uma crio-protetor, se necessário, no topo do bolo fase expostos cúbicos no poço. </li><li> Aumentar a ampliação do microscópio e se concentrar em um cristal. </li><li> Ajustar o ângulo entre o polarizador eo analisador para aumentar o contraste entre o cristal birrefringente eo fundo, mantendo luz suficiente para ver o circuito de colheita. </li><li> Selecione um MicroMount MiTeGen com um diâmetro correspondente ao tamanho de cristal e depois colher o cristal diretamente da LCP escavando-o na MicroMount. </li><li> Flash congelar o MicroMount com o cristal colhidas em nitrogênio líquido, e enviá-lo a uma linha de luz síncrotron fonte para coleta de dados de raios-X 6. </li></ol> 5. Resultados representativos: Uma engenharia humana beta 2 adrenérgicos G receptor acoplado à proteína (β 2 AR-T4L) foi expressa em baculovírus infectados células de inseto Sf9 e purificado em dodecylmaltoside (DDM) / hemissuccinato colesterol (CHS) solução de detergente vinculado a um agonista parcial inversa carazololo 7. A proteína foi marcado com Cy3 éster NHS e utilizado em ensaios pré-cristalização LCP-FRAP (Figura 2). Telas grade grosseira com base em várias condições selecionados a partir dos resultados da LCP-FRAP ensaios produzidos inicial cristal-como hits (Figura 3). Otimização das condições de precipitante rendeu cristais de difração de qualidade (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Fluxograma de um experimento típico LCP cristalização. Passos nas caixas cinza não estão descritos nos protocolos atuais. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. LCP-ensaio FRAP com AR-T4L/carazolol 2 β em monoolein LCP baseado. A) Resultados de um ensaio FRAP LCP-realizada em um modo de alto rendimento automático, em que cada amostra de uma placa de 96 poços é branqueada seqüencialmente e recuperação de fluorescência é medida após a incubação de 30 min. As recuperações obtidas por fluorescência, que representam a fração móvel em cada amostra, são traçados para todas as 96 amostras. As soluções de triagem contêm 0,1 M Tris pH 8, 30% v / v PEG 400 combinado com 48 diferentes sais em duas concentrações diferentes. B) Fluorescência perfis de recuperação para vários repcondições representativas. Curvas linha sólida representa encaixa pela equação. 1.O frações móvel e os coeficientes de difusão são determinados utilizando equações. 1 e 2. Recuperação rápida de menos de 10% na amostra contendo cloreto de sódio é devido a lipídios fluorescente etiquetado co-purificada com a proteína. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Sucessos cristal inicial de AR-T4L/carazolol 2 β obtido por uma triagem grade grossa em torno de condições mais promissoras identificadas pela LCP-FRAP, contendo sulfato de sódio (painel A) e Na Formate (painel B). A proteína é rotulado com Cy3 éster NHS e as imagens fluorescentes são tiradas com excitação em 543 nm e emissão a 605 nm. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Cristais Optimized de AR-T4L/carazolol 2 β. As imagens dos cristais crescidos na presença de sulfato de sódio (painéis A e B) e K Formate (painéis C e D) são tomadas no modo brightfield (painéis A e C) e usando cross-polarizadores (painéis B e D).

<ol><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs%2C+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-170 (2010).</li>
<li>Cherezov, V., Liu, J., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LCP-FRAP+assay+for+pre-screening+membrane+proteins+for+in+meso+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cryst.+Growth+Design%22%5BJournal%5D)">LCP-FRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization.</a> J. Cryst. Growth Design. 8, 4307-4315 (2008).</li>
<li>Misquitta, Y., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergents+destabilize+the+cubic+phase+of+monoolein%3A+implications+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization.</a> Biophys. J. 79, 394-405 (2003).</li>
<li>Soumpasis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments.</a> Biophys. J. 41, 95-97 (1983).</li>
<li>Cherezov, V., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Hilgart, M. C., Sanishvili, R., Nagarajan, V., Stepanov, S., Fischetti, R. F., Kuhn, P., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rastering+strategy+for+screening+and+centering+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+micrometer+size+X-ray+synchrotron+beam%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Rastering strategy for screening and centering of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 micrometer size X-ray synchrotron beam.</a> J. R. Soc. Interface. 6, S587-S597 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li>
<li>Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+imaging+of+integral+membrane+protein+crystals+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases.</a> Anal. Chem. 82, 491-497 (2010).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+inexpensive+nanoliter-volume+dispenser+for+highly+viscous+materials+used+in+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">A simple and inexpensive nanoliter-volume dispenser for highly viscous materials used in membrane protein crystallization.</a> J. Appl. Cryst. 38, 398-400 (2005).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+screens%3A+compatibility+with+the+lipidic+cubic+phase+for+in+meso+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins.</a> Biophys J. 81, 225-242 (2001).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os protocolos de fornecer uma orientação básica visual para as principais etapas envolvidas na realização de experimentos de cristalização meso. Mais em profundidade os detalhes relacionados a estes protocolos, enfatizando possíveis armadilhas, deficiências ou rotas alternativas estão disponíveis em outros lugares 1,2. Opcional LCP FRAP-ensaios podem ajudar nas fases anteriores para selecionar a construção de proteínas mais promissores, LCP lipídica host e aditivos de lipídios, bem como limitar a gama de possíveis precipitantes e condições de buffer 3. Uma vez um sucesso de cristalização inicial é encontrada, ela deve ser otimizado para obter cristais de melhor qualidade. Otimização das condições de cristalização de meso é essencialmente similar a otimização das condições de proteínas solúveis com a adição de parâmetros adicionais associados com a composição da LCP 1. Cristais de proteína de membrana lipídica cultivadas em mesofase são geralmente menores em tamanho do que os cristais obtidos em solução de detergente, mas mais ordenada, assim, beneficiando fortemente do uso de linhas de luz disponíveis em microfoco fontes de síncrotron moderna 6. Muitos dos procedimentos relacionados no meso cristalização, incluindo a configuração de placas de cristalização ou ensaio, a realização de LCP FRAP-ensaios e detecção de cristais, foram semi ou totalmente automatizado 1,2,8,9, permitindo triagem de uma grande variedade de condições ao consumir pequenas quantidades de proteínas e lipídios. Por outro lado, proteína em reconstituições LCP e colheita de cristal permanecem operações manuais e mais tedioso e, portanto, têm uma necessidade de melhoria.

<table><tbody><tr><td>100 &amp;mu;L de seringa estanque a gás</td><td>Hamilton Co</td><td>7656-01</td><td>São necessárias 2 seringas</td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L de seringa estanque a gás</td><td>Hamilton Co</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>Acoplador para seringa</td><td>Hamilton Co</td><td>7770-02 30902</td><td>O acoplador pode ser fabricado com peças disponíveis conforme descrito nas refs. 10</td></tr><tr><td>Dispensador repetitivo de seringa</td><td>Hamilton Co</td><td>83700</td><td>O dispensador repetitivo de seringa pode ser modificado para reduzir o volume dispensado em cerca de 3 vezes&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Agulha removível curta (0,375&amp;#8221;) com ponta plana (estilo da ponta 3, calibre 26)</td><td>Hamilton Co</td><td>7804-03</td><td></td></tr><tr><td>Placa de sanduíche de vidro de 96 poços</td><td>Marienfeld</td><td>08 900 03</td><td>Para operações manuais, é mais conveniente montar a placa de sanduíche de vidro usando lâminas de microscópio padrão e fita adesiva dupla com orifícios perfurados&lt;sup&gt;1,2,12&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Lâmina de cobertura de vidro</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63787-01</td><td></td></tr><tr><td>monooleína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7765</td><td></td></tr><tr><td>Telas de cristalização</td><td>Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience</td><td></td><td>A maioria das telas comerciais disponíveis pode ser usada para triagem inicial. Condições que consistentemente desestabilizam o LCP podem ser diluídas 2x para melhor compatibilidade&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Pedra para corte de capilares</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-334</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta de ponta fina</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>510</td><td></td></tr><tr><td>Agulha pontiaguda angular</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13650</td><td></td></tr><tr><td>MicroMounts</td><td>MiTeGen</td><td>M1-Lxx-xx</td><td>Selecione o diâmetro do MicroMount de acordo com o tamanho do cristal</td></tr></tbody></table>

cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Proteínas da membrana realizar funções críticas em células vivas relacionadas com o transporte do sinal de transdução, e transformações de energia, e, como tal, estão implicados em uma infinidade de disfunções e doenças. No entanto, um entendimento estrutural e funcional de proteínas da membrana é fortemente ficando muito atrás de seus parceiros solúveis, principalmente, devido às dificuldades associadas à sua solubilização e geração de cristais de qualidade de difração. Cristalização em mesofases lipídico (também conhecido como cristalização em meso ou LCP) é uma técnica promissora que foi aplicado com sucesso a obtenção de estruturas de alta resolução de rodopsinas microbiana, proteínas fotossintéticas, barris beta membrana externa e acoplados à proteína G receptores. Em meso cristalização tira proveito de um ambiente de membrana nativa-like e, normalmente, produz cristais com menor teor de solvente e melhor organização, em comparação com a cristalização das soluções tradicionais de detergente. O método não é difícil, mas requer uma compreensão do comportamento de lipídios fase e prática na manipulação de materiais viscosos mesofase. Aqui nós demonstramos uma forma simples e eficiente de fazer LCP e reconstituindo uma proteína de membrana na bicamada lipídica da LCP usando um mixer seringa, seguida de distribuição de porções nanolitros de LCP em um ensaio ou placa de cristalização, a realização de ensaios de pré-cristalização e colheita de cristais a matriz LCP. Esses protocolos fornecem um guia básico para a abordagem em ensaios de cristalização meso, no entanto, como em qualquer experimento de cristalização, uma extensa triagem e otimização são necessárias, e um resultado bem-sucedido não é necessariamente garantido.

Os protocolos descrevem os passos essenciais para a obtenção de cristais de difração de qualidade de uma proteína de membrana a partir de reconstituição da proteína em uma fase lipídica cúbicos (LCP), encontrando condições iniciais com os ensaios pré-cristalização LCP-FRAP, a criação de ensaios de cristalização LCP e cristais colheita .

Cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases

As proteínas de membrana desempenham funções críticas em células vivas relacionadas à transdução de sinal, transporte e transformações energéticas e, como tal, são ...

O objetivo geral do procedimento a seguir é obter cristais de alta qualidade de uma proteína de membrana para determinação estrutural por cristalografia de raios X. Isso é alcançado pela reconstituição da proteína na membrana de uma fase cúbica lipídica e incubação com uma solução precipitante, o que induz a nucleação e o crescimento dos cristais devido à vasta extensão do espaço de cristalização e ao feedback limitado proveniente dos experimentos de cristalização. O ensaio de recuperação de fluorescência da fase cúbica lipídica após fotoablação ou LCP Frap Prec foi desenvolvido para selecionar as condições de cristalização mais promissoras.Este ensaio reduz a quantidade de triagem e aumenta as chances de obter os primeiros sucessos de cristalização. Uma vez encontrados os primeiros sucessos, são realizados ensaios de otimização com o objetivo de melhorar o crescimento dos cristais. Por fim, os cristais otimizados são coletados e congelados em nitrogênio líquido para a coleta de dados em uma fonte de sincrotron.Os resultados demonstram o uso eficaz do ensaio FRA em LCP para obtenção de cristais iniciais do receptor beta-2 adrenérgico em LCP, cuja otimização subsequente levou a cristais de qualidade para difração. Esta técnica aproveita um ambiente de membrana semelhante ao nativo fornecido pela fase cúbica repetida e geralmente resulta em cristais com baixo conteúdo de soluções e melhor ordenação, em comparação com a cristalização em soluções de detergentes. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades devido à alta viscosidade e às propriedades tixotrópicas das fases lipídicas, o que torna esses materiais difíceis de manipular.No entanto, quando as ferramentas adequadas são utilizadas e a técnica é dominada, este procedimento não é mais difícil do que qualquer outra técnica de cristalização de proteínas e pode ser automatizado e realizado em alto rendimento. Vamos então começar. Purifique a proteína de membrana de interesse em uma solução com detergente e concentre os complexos proteína-detergente para aproximadamente 10 a 20 miligramas por mililitro.Transfira cerca de 25 miligramas de um lipídio hospedeiro LCP A ou uma mistura de lipídios para um tubo plástico e incube a 40 graus Celsius por alguns minutos até que o lipídio derreta. Em seguida, acople um conector de seringa a uma seringa gastight de 100 microlitros. Carregue a seringa com o lipídio fundido utilizando uma pipeta de volume ajustável.Registre o volume do lipídio na seringa e carregue outra seringa de 100 microlitros com quantidade suficiente de solução proteica para resultar em uma proporção de solução proteica para lipídio de dois para três, volume por volume. Conecte ambas as seringas através do acoplador de seringas. Empurre alternadamente os êmbolos das seringas para mover o lipídio e a proteína através da agulha interna do acoplador, de um lado para o outro, até que a fase mesomorfa do lipídio fique homogênea.O LCP forma-se espontaneamente mediante mistura mecânica, e a proteína é então reconstituída na bicamada lipídica do LCP. A formação do LCP pode ser verificada por sua consistência transparente e semelhante a gel, bem como pela ausência de birrefringência quando observada ao microscópio equipado com polarizadores cruzados, ou, se possível, por difração de raios X de pequeno ângulo. Para iniciar ensaios de FRAP em LCP, marque a proteína com um corante fluorescente numa proporção de proteína para corante de aproximadamente 100 para um, conforme descrito no protocolo escrito.Remova o corante não reativo e concentre a proteína até aproximadamente um miligrama por mililitro. Em seguida, reconstitua a proteína marcada em LCP da mesma maneira feita para a proteína não marcada. Prepare as placas de ensaio.Utilizando soluções de triagem com LCP. Primeiro, transfira o LCP carregado com proteína para uma seringa estéril de 10 microlitros acoplada a um dispensador de seringas repetitivo; em seguida, fixe uma agulha curta removível à seringa de 10 microlitros. Dispense bolus de 200 nanolitros de LCP sobre a superfície de quatro poços adjacentes, formando um quadrado dois por dois, e recubra cada bolus de LCP com um microlitro da solução correspondente de triagem LCP FRA.Uma vez que a solução de triagem tenha sido dispensada, tampe os quatro poços carregados com uma lamínula quadrada de vidro de 18 milímetros. Aplique uma pressão suave sobre a lamínula para selar os poços. Repita este processo para o próximo conjunto de quatro poços até que toda a placa esteja preenchida.Uma vez preenchido, cubra a placa com papel alumínio. Incube as placas a 20 graus Celsius por pelo menos 12 horas. Para atingir um estado de equilíbrio, coloque uma das placas na estação LCP Frap e foque no primeiro poço utilizando uma objetiva de 10 vezes.A aquisição de dados de FRAP é realizada automaticamente usando um script Image Pro no qual o usuário insere primeiro todos os parâmetros de aquisição e depois pressiona o botão de início. Uma sequência típica de aquisição começa com a gravação de cinco imagens pré-branqueadas, depois dispara o laser de branqueamento sincronizado com a captura de uma sequência rápida de recuperação de cerca de 200 imagens na taxa mais rápida possível, seguida pela obtenção de uma sequência lenta de recuperação de 50 imagens com intervalos de um a 20 segundos entre as imagens, dependendo da taxa de difusão da proteína. Após a conclusão da coleta de dados, integre a intensidade dentro do ponto de branqueamento e para pontos de referência posicionados fora da área branqueada pelo laser em todos os quadros corrigidos.A curva de intensidade integrada para os desvios causados por flutuações da luz e fotoesbranquiamento durante a aquisição de dados normaliza a intensidade corrigida, tornando a intensidade pré-esbranquiada igual a um e a intensidade inicial após o esbranquiamento igual a zero; ajusta-se a curva da intensidade normalizada versus tempo conforme descrito no protocolo escrito, a fim de obter a fração móvel e o coeficiente de difusão. Repita este procedimento para o próximo poço, compare as frações móveis e coeficientes de difusão obtidos sob diferentes condições de triagem. Projete telas de cristalização nu baseadas nos componentes que facilitaram a difusão da proteína e excluindo as condições para as quais não foi observada difusão proteica, a fim de montar ensaios de cristalização em LCP.Reconstitua a proteína em LCP como anteriormente, então prepare as placas de cristalização como para LCP frap, mas com soluções de triagem de cristalização. Alternativamente, os ensaios de cristalização podem ser montados roboticamente uma vez que as placas de cristalização tenham sido preparadas, incubando-as em temperatura constante e verificando periodicamente a formação e o crescimento de cristais. Após o crescimento dos cristais proteicos, coloque uma placa com os cristais sob um microscópio estereoscópico com zoom variável equipado com polarizador e analisador lineares rotativos.Concentre-se no poço de interesse usando um zoom de baixa potência, de modo que todo o poço fique dentro do campo de visão. Risque o vidro da lamínula em quatro traços, fazendo um quadrado dentro dos limites do poço, utilizando um canto afiado de uma pedra de corte de capilar cerâmico. Pressione ao redor do perímetro riscado com pinça de ponta fina e resistente para propagar os riscos por toda a espessura da lamínula.Faça dois pequenos furos com um perfurador de lâmina em cantos opostos do quadrado marcado. Injete algumas microlitros de solução precipitante por um dos furos para reduzir a desidratação durante as etapas subsequentes. Usando uma sonda agulha afiada em ângulo, quebre o vidro ao longo de um ou dois lados para soltar o quadrado recortado.Levante cuidadosamente o quadrado de vidro observando o bolo da fase cúbica. Adicione algumas microlitros extras de solução precipitante suplementada com um crioprotetor, se necessário, sobre o bolo da fase cúbica exposto no poço. Aumente a ampliação do microscópio e foque em um cristal. Ajuste o ângulo entre o polarizador e o analisador para aumentar o contraste entre o cristal e o fundo, mantendo luz suficiente para visualizar o laço de coleta.Em seguida, remova o excesso de lipídio e recolha o cristal diretamente do LCP, recolhendo-o com uma micromontagem mighty gen previamente selecionada para ter um diâmetro compatível com o tamanho do cristal. Congele a micromontagem com o cristal recolhido em nitrogênio líquido e envie-a para uma linha de feixe de sincrotrão para coleta de dados de raios X. O receptor beta-2 adrenérgico marcado foi rotulado com éster S SI três NHS e utilizado em ensaios de cristalização LCP Frep prec em modo automático de alto rendimento, nos quais cada amostra de uma placa de 96 poços é branqueada sequencialmente e a recuperação de fluorescência é medida após uma incubação de 30 minutos. As recuperações de fluorescência obtidas, que representam a fração móvel em cada amostra, são representadas graficamente para todas as 96 amostras.As soluções de triagem contêm tris 0,1 molar pH oito, PEG 400 a 30% volume por volume, combinados com 48 sais diferentes em duas concentrações distintas. São apresentados os perfis de recuperação de fluorescência para várias condições representativas. As curvas em linha contínua representam ajustes da intensidade normalizada versus tempo. A rápida recuperação de menos de 10% na amostra contendo cloreto de sódio é devida a lipídios marcados fluorescentemente.Co purificado com a proteína, cristais iniciais do receptor beta-2 adrenérgico em complexo com olol foram obtidos por meio de uma triagem em grade grosseira ao redor das condições mais promissoras identificadas por LCP Frap contendo sulfato de sódio e formiato de sódio. A otimização adicional das condições de precipitante gerou cristais de qualidade para difração. Aqui, as imagens dos cristais cultivados na presença de sulfato de sódio e formiato de potássio foram obtidas no modo de campo claro.Os mesmos cristais também podem ser visualizados utilizando polarizadores cruzados. Após dominar a técnica, a reconstituição da proteína em fases cúbicas lipídicas pode ser concluída em 10 a 15 minutos, e a montagem manual de uma placa de cristalização de 96 poços pode ser realizada em uma hora. O ensaio L três B com envoltório no modo alto requer cerca de duas horas por placa de 96 poços, e a cristalização H leva aproximadamente de 10 a 20 minutos por poço. Os procedimentos mostrados neste vídeo fornecem um guia básico para a realização de ensaios de cristalização de proteínas.No entanto, como em qualquer experimento de cristalização, é necessário um peneiramento extensivo e uma otimização cuidadosa, e um resultado bem-sucedido não é necessariamente garantido.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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